羅霞　周景喜　陳華志

[摘要] 目的 探討缺氧誘導(dǎo)因子-1α（HIF-1α）在口腔白斑血管生成中的作用及其與口腔白斑術(shù)后復(fù)發(fā)的相關(guān)性與影響因素。 方法 免疫組化法檢測(cè)口腔鱗狀細(xì)胞癌、口腔白斑及口腔正常黏膜中HIF-1α的表達(dá)情況，熒光定量PCR法檢測(cè)microRNA表達(dá)。 結(jié)果 與口腔正常黏膜相比，口腔白斑microRNA相對(duì)表達(dá)量顯著增加，而口腔鱗癌與口腔白斑相比，microRNA相對(duì)表達(dá)量顯著增加，兩兩比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）。 結(jié)論 HIF-1α在口腔白斑及白斑癌組織中過(guò)度表達(dá)，其可作為判斷口腔黏膜組織發(fā)生白斑病變及白斑癌變的標(biāo)志物之一。

[關(guān)鍵詞] 缺氧誘導(dǎo)因子-1α；口腔白斑；血管生成

[中圖分類(lèi)號(hào)] R739.8 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] B [文章編號(hào)] 1673-9701（2014）05-0028-03

我國(guó)口腔頜面部鱗狀細(xì)胞癌多發(fā)于40～60歲的成年人，早期發(fā)現(xiàn)是目前預(yù)防與治療鱗癌的最佳方法，通過(guò)HIF-1α與口腔白斑癌變的相關(guān)性研究可以早期判斷白斑的性質(zhì)。口腔黏膜白斑是口腔黏膜病中常見(jiàn)的一種疾病，國(guó)內(nèi)外一直有大量學(xué)者在研究?jī)烧叩年P(guān)系，探討HIF-1α在口腔黏膜白斑可能的相關(guān)發(fā)病機(jī)制，為口腔黏膜白斑的診斷、治療和預(yù)后判斷提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)[1]。本研究將采用免疫組化法測(cè)定口腔白斑組織中HIF-1α表達(dá)情況，并對(duì)其與口腔白斑發(fā)生及發(fā)展相關(guān)性進(jìn)行分析，旨在為臨床口腔白斑的治療提供新的思路。

1 資料與方法

1.1 臨床資料

選擇2005～2012年從本院病理科選取的口腔鱗狀細(xì)胞癌、口腔白斑及口腔正常黏膜石蠟切片標(biāo)本各15例，三組病理組織學(xué)標(biāo)本結(jié)果均由兩位資深的病理分析醫(yī)師共同確認(rèn)。每個(gè)樣本均采用連續(xù)切片法，樣本的厚度為4 μm，具體資料見(jiàn)表1。

表1 實(shí)驗(yàn)樣本基本資料

1.2 方法

1.2.1 microRNA含量的測(cè)定 采用RT-PCR（購(gòu)于美國(guó)ADI公司）測(cè)定各組組織中microRNA含量，設(shè)計(jì)針對(duì)人microRNA的PCR探針序列以及熒光檢測(cè)引物，選擇人GAPDH（由美國(guó)BD公司提供）作為測(cè)試的內(nèi)參物，并采用Trizol試劑盒（美國(guó)Invitrogen公司）提取RNA，熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)嚴(yán)格按照試劑盒操作說(shuō)明進(jìn)行。microRNA相對(duì)表達(dá)量=目的基因/內(nèi)參基因。

1.2.2 免疫組化法測(cè)定 采用免疫熒光組化法檢測(cè)兩組HIF-1α、VEGF表達(dá)情況，兔抗人VEGF多克隆抗體購(gòu)于福州邁新生物技術(shù)公司，HIF-1α鼠抗人多克隆抗體購(gòu)于北京金橋生物技術(shù)公司。HIF-1α采用EDTA熱修復(fù)處理20 min，VEGF采用檸檬酸緩沖液于高壓鍋中熱修復(fù)處理2 min后采用冷水洗滌，并采用PBS緩沖液對(duì)樣品進(jìn)行沖洗，經(jīng)蘇木精復(fù)染后采用乙醇對(duì)樣本脫水并制成中性樹(shù)膠封片，并與已知的陽(yáng)性切片進(jìn)行對(duì)比，陰性對(duì)照采用PBS緩沖液替代一抗的樣本為參照。

1.3 免疫組化結(jié)果判斷

①HIF-1α陽(yáng)性表達(dá)為棕黃色顆粒見(jiàn)于細(xì)胞核內(nèi)，VEGF陽(yáng)性表達(dá)為棕黃色顆粒見(jiàn)于細(xì)胞質(zhì)及細(xì)胞核內(nèi)。②在倍數(shù)為100的顯微鏡下觀察細(xì)胞著色情況，根據(jù)著色程度由輕至重可分別計(jì)為0、1、2、3分。隨機(jī)選取5個(gè)視野點(diǎn)，采用倍數(shù)為400的顯微鏡進(jìn)行觀察，每個(gè)視野進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，以500個(gè)細(xì)胞作為一組計(jì)算單位，細(xì)胞陽(yáng)性百分率：1分為<10%，2分為10%～50%，3分為>50%。積分計(jì)算：①與②計(jì)算所得的分值相乘。0分為陰性“-”，1～3分為弱陽(yáng)性“+”，4～6分為中度陽(yáng)性“++”，7～9分為強(qiáng)陽(yáng)性“+++”[3]。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

應(yīng)用SPSS17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)數(shù)資料用相對(duì)數(shù)表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)，HIF-1α與VEGF相關(guān)性采用Spearman相關(guān)分析，P < 0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 microRNA的相對(duì)表達(dá)量分析

與口腔正常黏膜相比，口腔白斑microRNA相對(duì)表達(dá)量顯著增加，而口腔鱗癌與口腔白斑相比，microRNA相對(duì)表達(dá)量顯著增加，兩兩比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）。見(jiàn)表2。

2.2 HIF-1α與VEGF陽(yáng)性表達(dá)情況

正常黏膜、口腔白斑、口腔鱗癌中HIF-1α陽(yáng)性表達(dá)率分別為0、73.30%、100.00%，而正常黏膜、口腔白斑、口腔鱗癌中VEGF陽(yáng)性表達(dá)率分別為0、66.70%、100.00%。見(jiàn)表3。

表3 HIF-1α與VEGF陽(yáng)性表達(dá)情況

注：與對(duì)正常黏膜相比，口腔白斑χ2=5.487，aP < 0.05；與口腔白斑相比，χ2=4.212，bP < 0.05

2.3 microRNA與HIF-1α、VEGF相關(guān)性分析

經(jīng)相關(guān)性分析可知，microRNA與HIF-1α表達(dá)呈負(fù)相關(guān)（r=-0.452，P=0.000），與VEGF蛋白呈正相關(guān)（r=0.378，P=0.000）。

3 討論

口腔鱗狀細(xì)胞癌（OSCC）是口腔科中常見(jiàn)的惡性腫瘤，其臨床發(fā)生率約占全身惡性腫瘤發(fā)生率的3%～5%，約占口腔惡性腫瘤發(fā)生率的90%以上[2]。OSCC在我國(guó)是口腔頜面部中常見(jiàn)的惡性腫瘤，其臨床表現(xiàn)為早期淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、局部浸潤(rùn)性強(qiáng)、預(yù)后差等特點(diǎn)，且該疾病容易轉(zhuǎn)化為萎縮型、長(zhǎng)期糜爛型以及潰瘍型[3]。由于OSCC屬于上皮源性腫瘤，因此其發(fā)生經(jīng)歷了與其他上皮細(xì)胞組織癌的發(fā)展過(guò)程相同，其發(fā)展過(guò)程經(jīng)歷了正常細(xì)胞到癌前病變最后發(fā)展成為轉(zhuǎn)移性癌癥等系列動(dòng)態(tài)過(guò)程，其參與過(guò)程復(fù)雜、屬于多階段發(fā)生的過(guò)程，其病變過(guò)程是受到多種基因調(diào)控來(lái)完成。

目前普遍認(rèn)為，口腔白斑復(fù)發(fā)是由于內(nèi)外因素共同作用引起的，血管生成是腫瘤發(fā)展的首要條件[4]。李德超等[5]認(rèn)為，腫瘤周?chē)h(huán)境中抑制因子及促進(jìn)因子調(diào)控失衡是導(dǎo)致腫瘤血管生成的重要因素。VEGF是血管內(nèi)皮細(xì)胞有絲分裂素，屬于重要的血管生成促進(jìn)因子，其在血管生成過(guò)程中處于核心地位[6]。大量研究表明[7]，在正常成年人群中VEGF的表達(dá)水平非常低，而在惡性腫瘤患者中VEGF表達(dá)水平異常高。此外，VEGF可誘導(dǎo)血管、淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞遷移及增殖，促使淋巴血管及生成，并可增加淋巴血管通透性，加速淋巴血管轉(zhuǎn)移，因此與腫瘤惡性程度具有密切的關(guān)系。腫瘤患者體內(nèi)普遍存在免疫識(shí)別障礙的情況，機(jī)體在此情況下可將腫瘤組織誤認(rèn)為自身組織，從而產(chǎn)生應(yīng)激反應(yīng)，并誘導(dǎo)HIF-1α生成。HIF-1α表達(dá)增強(qiáng)可刺激腫瘤蛋白及基因轉(zhuǎn)錄，并促使VEGF大量生成。目前相關(guān)研究[8]表明，HIF-1α與腫瘤的發(fā)生發(fā)展具有密切的關(guān)系，在腫瘤發(fā)生發(fā)展過(guò)程中起到重要的調(diào)控作用。蔡勁等[9]研究指出，HIF-1α表達(dá)強(qiáng)度與癌癥患者總體生存期及術(shù)后復(fù)發(fā)率顯著相關(guān)，HIF-1α表達(dá)水平可作為，口腔白斑患者根治手術(shù)術(shù)后復(fù)發(fā)的預(yù)測(cè)指標(biāo)。吳洋[10]對(duì)口腔白斑患者預(yù)后情況進(jìn)行分析，其結(jié)果顯示口腔白斑患者己糖激酶-Ⅱ及HIF-1α表達(dá)強(qiáng)度與腫瘤大小、分化程度、臨床分期有密切關(guān)系，是影響患者術(shù)后預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。

本研究結(jié)果顯示，與口腔正常黏膜相比，口腔白斑microRNA相對(duì)表達(dá)量顯著增加，而口腔鱗癌與口腔白斑相比，microRNA相對(duì)表達(dá)量顯著增加，兩兩比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，經(jīng)相關(guān)性分析可知，microRNA與HIF-1α表達(dá)呈負(fù)相關(guān)（r=-0.452，P=0.000），與VEGF蛋白呈正相關(guān)（r=0.378，P=0.000），從而提示HIF-1α陽(yáng)性表達(dá)強(qiáng)度與患者生存率及生存期限具有密切的關(guān)系。正常黏膜、口腔白斑、口腔鱗癌中HIF-1α陽(yáng)性表達(dá)率分別為0、73.30%、100.00%，而正常黏膜、口腔白斑、口腔鱗癌中VEGF陽(yáng)性表達(dá)率分別為0、66.70%、100.00%，從而提示通過(guò)測(cè)定口腔白斑患者HIF-1α陽(yáng)性表達(dá)情況，對(duì)預(yù)測(cè)患者病情進(jìn)展具有重要的意義。HIF-1α在口腔白斑及白斑癌組織中過(guò)度表達(dá)，其可作為判斷口腔黏膜組織發(fā)生白斑病變及白斑癌變的標(biāo)志物之一。

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（收稿日期：2013-11-01）