李涵依, 車晨, 耿亞, 劉福音, 郝葆青

（西南民族大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院, 成都 610041）

雞白痢沙門氏菌O12特異性噬菌體的分離及生物學(xué)特性研究

李涵依, 車晨, 耿亞, 劉福音, 郝葆青

（西南民族大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院, 成都 610041）

采用雙層平板培養(yǎng)法從成都某養(yǎng)雞場的污水樣本中分離得到一株雞白痢沙門氏菌O12(宿主菌)的噬菌體(Ph-1),并對菌斑形態(tài)及理化特性進(jìn)行了初步研究. 試驗(yàn)結(jié)果顯示, 純化后該噬菌體的噬菌斑直徑約3mm; 經(jīng)高于60℃溫度處理1h 后噬菌體失活; PH5-7時該噬菌體可保持較高效價和較強(qiáng)的紫外線耐受性; 該噬菌體的最佳感染復(fù)數(shù)(MOI)為0.01-0.001; 一步生長曲線顯示該噬菌體的潛伏期為40min, 裂解期持續(xù)60min.

雞白痢; 噬菌體; 沙門氏菌

雞白痢在我國大部分地區(qū)頻繁發(fā)生, 為養(yǎng)雞場中一種常見的細(xì)菌性傳染病, 其雛雞致死率可高達(dá)80%[1]. 雞白痢的病原菌是雞白痢沙門氏菌, 分類上屬于腸科沙門氏菌. 沙門氏菌定殖在動物腸道內(nèi), 在胴體加工中若處理不當(dāng), 極易污染食品, 造成食品安全隱患, 危害人類健康[2]. 近些年來, 隨著養(yǎng)殖戶和飼料生產(chǎn)商抗生素的濫用導(dǎo)致該病菌出現(xiàn)越來越多的耐藥菌株, 使眾多的治療沙門氏菌感染病癥的抗生素失效. 據(jù)報道[3], 中國沙門氏菌對磺胺類抗生素的耐藥性已經(jīng)接近100%, 人們不得不尋求別的、能有效對抗該病菌感染的防治方法.

噬菌體是一類專性寄生或感染細(xì)菌的病毒, 它們廣泛存在于自然界中. 一般而言, 存在某種病原細(xì)菌的場所中往往也可能存在能對其裂解的特異性噬菌體[4]. 烈性噬菌體可以在敏感宿主菌胞內(nèi)增殖, 最后裂解宿主菌釋放出子代噬菌體, 從而達(dá)到破壞宿主菌的作用. 早在1934年, 美國科學(xué)家就報道了用噬菌體進(jìn)行腸球菌感染的治愈率可達(dá)90%[5].

本次實(shí)驗(yàn)隨機(jī)采取成都郊區(qū)某養(yǎng)雞場地面污水的30份試樣, 從中分離得到了一株雞白痢沙門氏菌O12特異性噬菌體, 并對其進(jìn)行純化, 增殖和一系列理化特性的研究, 以期為噬菌體防治雞白痢新途徑的探索提供參考數(shù)據(jù).

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 實(shí)驗(yàn)菌株

雞源沙門氏菌O12(保藏于本實(shí)驗(yàn)室); 30份地面污水樣本采集于成都郊區(qū)某養(yǎng)雞場.

1.2 培養(yǎng)基.

SS瓊脂培養(yǎng)基(成都科龍化工試劑廠).

LB液體培養(yǎng)基: 10g蛋白胨, 5g氯化鈉, 5g酵母提取物, 蒸餾水定容至1000ml.

LB瓊脂培養(yǎng)基: LB液體培養(yǎng)基+1%瓊脂;

雙層瓊脂平板培養(yǎng)基: 上層——半固體培養(yǎng)基(LB液體培養(yǎng)基+0.7%瓊脂), 下層——固體培養(yǎng)基(LB 液體培養(yǎng)基 +1.5%瓊脂).

以上培養(yǎng)基配制完成后調(diào)PH至7.2-7.5, 121℃高壓滅菌20min.

1.3 主要儀器

恒溫水浴鍋; 離心機(jī); 721分光光度計; 0.22μm無菌過濾器; 自動PH計等.

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 宿主菌的復(fù)蘇與準(zhǔn)備

取斜面保存的沙門氏菌O12, 將其放入無菌EP管中, 用蒸餾水稀釋. 稀釋后, 接種于SS瓊脂培養(yǎng)基, 恒溫水浴培養(yǎng)箱中倒臵 37℃培養(yǎng)16h. 觀察并挑取中等大小, 中央呈灰褐色的典型沙門氏菌菌落接種于LB液體培養(yǎng)基, 空氣浴振蕩180r/min, 37 ℃, 培養(yǎng)8h得到宿主菌懸液, 備用.

2.2 噬菌體的分離與鑒定

30份養(yǎng)雞場污水樣, 每份取5ml, 5000r/min離心10min, 吸取上清經(jīng)0.22μm微孔濾膜過濾除去雜菌后接種于加入有20ml LB液體培養(yǎng)基的滅菌三角瓶中, 再按體積比1:1.5加入對數(shù)生長期的宿主菌(沙門氏菌O12)懸液, 37℃, 80r/min, 振蕩培養(yǎng)8h, 再次經(jīng)0.22μm 微孔濾膜過濾去除宿主菌得到噬菌體原液. 然后, 采用雙層瓊脂平板法進(jìn)行噬菌體鑒定. 具體方法如下: 下層培養(yǎng)基倒板后4℃冷藏, 上層培養(yǎng)基倒板后50℃保溫備用. 取菌懸液300μl和300μl噬菌體原液混合, 40℃水浴30min使噬菌體充分吸附于宿主菌表面. 將混合液加入盛有4mlLB上層瓊脂培養(yǎng)基的EP管中, 混勻后迅速倒入上層平板培養(yǎng)基, 旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)皿使其均勻分布, 待充分冷卻凝固后倒臵培養(yǎng)4-8h. 若噬菌體原液中沙門氏菌O12特異性噬菌體存在, 則在下層培養(yǎng)基中出現(xiàn)不規(guī)則形狀蠶蝕狀噬菌斑.

2.3 噬菌體純化

選擇直徑較大, 邊緣清晰, 噬菌斑中央無菌落的初次培養(yǎng)噬菌斑, 用接種環(huán)刮取上層培養(yǎng)基的噬菌斑, 放于含有宿主菌菌液(菌量約108)的4ml LB液體培養(yǎng)基的EP管中, 臵于水浴鍋中40℃度水浴1h, 使噬菌體充分吸附于宿主菌, 搖床80r/min培養(yǎng)8h后進(jìn)行雙層平板噬菌斑培養(yǎng)試驗(yàn). 重復(fù)數(shù)次以上實(shí)驗(yàn)步驟, 直至觀察到噬菌斑形態(tài)呈現(xiàn)較規(guī)則、統(tǒng)一的大小為止.

2.4 噬菌體增殖

純化后的噬菌體效價較低, 需經(jīng)過反復(fù)增殖來增加噬菌體濃度來進(jìn)行后續(xù)研究. 方法如下: 用接種環(huán)刮取純化后的噬菌斑, 臵于5mlLB液體培養(yǎng)基中用移液槍反復(fù)吹打, 40℃水浴1h, 10000r/min離心5min后收集上清,過濾去除宿主菌即為噬菌體浸出液. 取1ml 浸出液加入5ml宿主菌增菌液37℃過夜培養(yǎng), 可見培養(yǎng)液較之前變澄清, 離心過濾除菌后得到噬菌體增殖液. 通常將增殖過程重復(fù)4-8次以得到較大效價的噬菌體液.

分別各取5ml噬菌體浸出液和宿主菌懸液(對照)在721分光光度計上測定650波長的OD值, 以快速檢測噬菌體的增殖效果和大致密度.

2.5 效價測定

將噬菌體增殖液用LB液體培養(yǎng)基做10倍梯度稀釋10 次. 將3-10次的稀釋度各取100μl, 加入過夜培養(yǎng)的300μl宿主菌增菌液, LB液體培養(yǎng)基補(bǔ)至4ml充分混勻, 40℃水浴1h后做雙層平板, 取噬菌斑適宜(個數(shù)約50-200)的平板計算噬菌斑個數(shù), 平行實(shí)驗(yàn)取平均值. 效價(PFU/ml)=噬菌斑個數(shù)×稀釋倍數(shù)×10.

2.6 噬菌體PH穩(wěn)定性的測定

配制不同PH(3、4、5、6、7、8、9、10)的LB培養(yǎng)基, 滅菌后分別取4ml加入400μl噬菌體液浸出液中, 室溫20℃放臵30min, 取1ml加入300μl宿主菌菌液, , 40℃恒溫水浴箱中水浴1h, PH 為7的LB培養(yǎng)基補(bǔ)至4ml雙層平板法過夜培養(yǎng)測定噬菌體效價, 做平行實(shí)驗(yàn), 效價取平均值.

2.7 噬菌體熱穩(wěn)定性的測定

取5支無菌EP管, 各加100μl純化噬菌體液, 分別40℃、50℃、60℃、70℃和80℃水浴1h, 加入300μl宿主菌混合后40℃水浴1h, 然后LB培養(yǎng)基補(bǔ)至4ml, 采用雙層平板法過夜培養(yǎng)測定噬菌體效價.

2.8 最佳感染復(fù)數(shù)(MOI)的測定

宿主菌過夜培養(yǎng)8h至對數(shù)增長期, 平板法測定菌液濃度, 然后稀釋至約107CFU/ml, 按0.001(菌液1000μl噬菌體液1μl)、0.01(菌液1000μl噬菌體液10μl)、0.1(菌液300μl噬菌體液30μl)、1(菌液300μl噬菌體液300μl)的比例加入經(jīng)稀釋的噬菌體液(107PFU/ml), 然后加液體LB培養(yǎng)基至4ml, 37℃搖床80r/min培養(yǎng)4h, 10000r/min離心5min, 取上清, 雙層平板法測效價. 各比例均設(shè)平行實(shí)驗(yàn)組取平均值, 以產(chǎn)生最高噬菌體效價比例為最佳感染復(fù)數(shù).

2.9 紫外線耐受性實(shí)驗(yàn)

取噬菌體液10ml于培養(yǎng)皿下蓋中, 采用超凈臺20w紫外線燈35cm處照射, 間隔10min取樣, 共取9次. 取樣后立即做雙層平板計算噬菌體效價. 設(shè)對照組, 同樣時間取樣, 不經(jīng)紫外線照射.

2.10 一步生長曲線的繪制

取過夜培養(yǎng)的宿主菌, 稀釋調(diào)滴度至107CFU/ml, 按照感染復(fù)數(shù)(MOI)0.01 加入梯度稀釋的噬菌體(105PFU/ml)5ml和宿主菌5ml. 40℃水浴孵育15min, 10000r/min離心5min, 棄上清以去除游離的噬菌體后加入適量LB培養(yǎng)基, 迅速開始37℃, 80r/min搖床培養(yǎng). 培養(yǎng)每隔10min搖勻取樣200μl, 10000r/min離心2min, 取上清梯度稀釋后, 做雙層平板測定噬菌體滴度, 共取樣12次. 以取樣時間為橫坐標(biāo), 噬菌體滴度的對數(shù)值為縱坐標(biāo), 繪制一步生長曲線.

3 結(jié)果

3.1 噬菌體分離與噬菌斑形態(tài)

第一次培養(yǎng)噬菌體原液做雙層平板培養(yǎng)8h后, 平板上出現(xiàn)大量形狀不規(guī)則的噬菌斑, 呈蠶蝕狀(圖1A), 證明噬菌體原液中存在沙門氏菌O12的特異性噬菌體. 經(jīng)過6次純化后, 獲得大小和形狀基本一致的噬菌斑, 直徑約2-3mm, 即為一株純化的噬菌體, 命名為Ph1.

圖1 沙門氏菌O12噬菌體噬菌斑(A純化前; B 純化后)

3.2 噬菌體效價測定

經(jīng)增殖后獲得噬菌體原液, 梯度稀釋后選擇適宜噬菌斑個數(shù)的平板計數(shù). 其中第6次稀釋的噬菌體液產(chǎn)生的噬菌斑數(shù)較適宜, 約為80個, 計算效價為8.4×108.

3.3 噬菌體的熱穩(wěn)定性

溫度對噬菌體Ph1的影響見表1. 可以發(fā)現(xiàn)在40-50℃是能較好得保持活性, 效價沒有明顯下降, 當(dāng)溫度高于60℃時, 噬菌體效價大幅下降, 70℃以上水浴1h可使噬菌體全部滅活.

表1 噬菌體熱穩(wěn)定性測定結(jié)果

3.4 噬菌體PH穩(wěn)定性

環(huán)境PH值對該噬菌體影響見表2和圖2. 結(jié)果表明噬菌體在PH5-8時保持較高的活性. 在PH低于5時, 活性大幅下降. 在PH為6-7時能夠保持最大效價.

表2 噬菌體PH 穩(wěn)定性測定結(jié)果

圖2 噬菌體的PH值穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.5 噬菌體紫外線耐受性實(shí)驗(yàn)

圖3和表3顯示了噬菌體Ph1對紫外線照射的耐受性. 實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明, 實(shí)驗(yàn)組和對照組兩組數(shù)據(jù)的 P(T<=t)值=0.17>0.05, 兩組數(shù)據(jù)無明顯顯著性差異, 說明紫外線照射對噬菌體并無明顯影響, 照射90min以后噬菌體效價仍保持初始效價108PFU/ml.

表3 噬菌體Ph1紫外線耐受性測定結(jié)果

圖3 噬菌體紫外線耐受性實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.6 最佳感染復(fù)數(shù)

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明, 在四個不同的感染復(fù)數(shù)中, 0.01和0.001實(shí)驗(yàn)組中培養(yǎng)的噬菌體滴度最高, 為108PFU/ml, 故此噬菌體的最佳感染復(fù)數(shù)在0.01-0.001之間.

表4 噬菌體最佳MOI實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.7 噬菌體一步生長曲線

每10min取樣測噬菌體效價, 繪制噬菌體Ph1的一步生長曲線如圖4 , 可以看出噬菌體侵染宿主菌的前50min內(nèi), 噬菌體效價幾乎沒有上升, 即此段時間為噬菌體的潛伏期, 在60min效價出現(xiàn)大幅上升, 為噬菌體裂解期, 裂解期持續(xù)約40min.

圖4 噬菌體的一步生長曲線

4 討論

雞白痢沙門氏菌廣泛存在于禽類養(yǎng)殖場所, 是雞群爆發(fā)性腹瀉主要原因之一, 死亡率較高[6]. 禽類腸道內(nèi)的沙門氏菌極易污染食品, 是主要食品衛(wèi)生和安全的隱患. 另外, 該病原菌易變異產(chǎn)生耐藥菌株, 抗生素防治在逐漸失去其效果. 噬菌體作為一種能夠高效裂解細(xì)菌的病毒, 將有可能替代抗生素?fù)?dān)當(dāng)防治細(xì)菌性感染疾病的重任.[7]噬菌體有較高的特異性, 針對特定病原細(xì)菌的噬菌體分離、鑒別及特性研究正在受到廣泛的重視, 并且這些研究將有助于開發(fā)噬菌體在防治細(xì)菌性感染疾病方面的潛力和臨床應(yīng)用.

本次實(shí)驗(yàn)采用雙層平板法分離法從成都某養(yǎng)雞場地面污水樣本中獲得了一株雞白痢沙門氏菌噬菌體(Ph1).該噬菌體在平板上形成直徑2-3mm的圓形噬菌斑, 邊緣清晰透亮, 說明該噬菌體能對宿主菌進(jìn)行較徹底的裂解.經(jīng)過富集增殖實(shí)驗(yàn), 噬菌體的效價能達(dá)到108PFU/ml. 不同細(xì)菌的噬菌體也有不同的最佳感染復(fù)數(shù)(MOI), 本次實(shí)驗(yàn)分離的噬菌體最佳感染復(fù)數(shù)為0.01-0.001. 感染復(fù)數(shù)是病毒感染宿主菌能力的重要指標(biāo), 在最佳感染復(fù)數(shù)時,噬菌體的感染率是最高.[8]對噬菌體感染復(fù)數(shù)的研究將可為后續(xù)噬菌體制劑的制備和臨床應(yīng)用劑量的確定都有重要指導(dǎo)意義.

噬菌體感染宿主菌的第一個步驟是吸附, 在吸附過程中, 環(huán)境的溫度和PH都會影響噬菌體的吸附效率.[9]溫度過高和PH過高或過低都會引起噬菌體失活. 本實(shí)驗(yàn)中, 噬菌體Ph1侵染宿主菌的最佳溫度為40-50℃. 溫度高于70℃時, 噬菌體失活; PH高于7時, PH1噬菌體效價大幅下降.

先前研究表明, 紫外線對一部分大腸桿菌噬菌體有較強(qiáng)的滅活作用.[10]然而, 本次紫外照射實(shí)驗(yàn)中對照組和實(shí)驗(yàn)組的P值>0.05, 數(shù)據(jù)無顯著性差異, 說明紫外線照射對噬菌體PH1活性并無明顯影響. 噬菌體PH1對紫外線有較強(qiáng)耐受性, 原因可能是該噬菌體PH1由于化學(xué)、物理和生物因子比如環(huán)境壓力的長期作用下導(dǎo)致變異所致. 大部分病毒的生長期都呈現(xiàn)“一步生長”的特點(diǎn), 即子代噬菌體的釋放呈現(xiàn)爆發(fā)的狀態(tài). 一般認(rèn)為潛伏期短、且裂解期長的噬菌體其裂解能力較強(qiáng).[11]本實(shí)驗(yàn)顯示, 噬菌體Ph1的潛伏期為60min, 裂解期持續(xù)約40min,表明該噬菌體的裂解能力較強(qiáng), 可用于后續(xù)噬菌體防治細(xì)菌性感染疾病的研究.

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Study on isolation and biological characterization of bacteriophage of salmonella O12for pullorum

LI Han-yi, CHE Chen, GENG Ya, LIU Fu-yin, HAO Bao-qing
(College of Life Science & Technology, Southwest University for Nationalities, Chengdu 610041, P.R.C.)

One bacteriophage, named Ph1, was isolated from waste-water samples collected from a Chengdu hennery by the double-agar method, and was to be obligate on the salmonella O12pullorum (Bacillary white diarrhea) that was as host bacteria. The biological catheterization was explored on this bacteriophage. The results indicated that the diameter of Ph1 phages was about 3mm. When incubated in 60℃ or higher for 1h, the phage was inactivated. It was able to keep a high activity at a range of pH5-7. In the UV-test it was demonstrated that Ph1 possesses a strong ant-UV ability. The best MOI of Ph1 was 0.01-0.001. It showed that the latent phase and rise phase were 40min and 60 min respectively on the one-step growth curve.

pullorum; bacteriophage; salmonella.

S852.61

A

1003-4271(2014)02-0186-06

10.3969/j.issn.1003-4271.2014.02.05

2014-01-10

郝葆青(1956-), 男, 教授, 研究方向: 藥物載體, Email:1296714389@qq.com.

西南民族大學(xué)研究生創(chuàng)新項(xiàng)目.