王 燕 曾 燏

1.川北醫(yī)學(xué)院病原生物與免疫學(xué)教學(xué)實(shí)驗(yàn)中心，四川南充637000；2.西華師范大學(xué)生命科學(xué)院，四川南充637002

細(xì)菌鞭毛染色培養(yǎng)條件的研究

王 燕1曾 燏2

1.川北醫(yī)學(xué)院病原生物與免疫學(xué)教學(xué)實(shí)驗(yàn)中心，四川南充637000；2.西華師范大學(xué)生命科學(xué)院，四川南充637002

目的比較細(xì)菌在不同培養(yǎng)基和不同菌齡條件下鞭毛的染色效果，探索細(xì)菌鞭毛染色形態(tài)鑒定理想的培育基和培育時(shí)間。方法①將普通變形桿菌分別接種在肉湯培養(yǎng)基、瓊脂培養(yǎng)基、血瓊脂培養(yǎng)基3種不同培養(yǎng)基內(nèi)，37℃培養(yǎng)18 h后，染色鏡檢，選擇取出染色效果最好的理想培養(yǎng)基；②將普通變形桿菌接種到理想培養(yǎng)基上分別培育8、12、18、24 h不同時(shí)間后，染色鏡檢，選擇出細(xì)菌鞭毛染色效果最好的培育時(shí)間。結(jié)果①血瓊脂中培養(yǎng)的細(xì)菌鞭毛結(jié)構(gòu)清晰、形態(tài)完整、背景干凈，鏡檢效果最好；②12～18 h菌齡的細(xì)菌菌體中等大小，鞭毛清晰完整，鏡檢效果好。結(jié)論血瓊脂是鞭毛染色教學(xué)和形態(tài)鑒定理想的培養(yǎng)基；12～18 h是細(xì)菌在血瓊脂培養(yǎng)基中的最佳生長(zhǎng)時(shí)間。

鞭毛染色；培養(yǎng)基和培養(yǎng)時(shí)間；鍍銀染色；普通變形桿菌

細(xì)菌鞭毛是指存在于細(xì)菌細(xì)胞壁外的呈波浪彎曲的細(xì)長(zhǎng)絲狀物，是細(xì)菌的運(yùn)動(dòng)器官。細(xì)菌鞭毛在不同細(xì)菌中的著生位置和數(shù)量是不一樣的，是細(xì)菌種類鑒定和分類的重要依據(jù)之一[1-4]。細(xì)菌的鞭毛非常纖細(xì)，長(zhǎng)5～20μm，直徑僅10～20 nm，小于光學(xué)顯微鏡的0.2μm的分辨率，因此，鞭毛需經(jīng)過(guò)增粗直徑后再染色才能在光學(xué)顯微鏡下觀察[5]。鞭毛的染色效果與細(xì)菌的培養(yǎng)條件和培養(yǎng)基的類型密切相關(guān)，如劉少有等[6]發(fā)現(xiàn)嗜肺軍團(tuán)菌在BCYE培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的鞭毛較NYE培養(yǎng)基中數(shù)量多、生長(zhǎng)好；謝文熙[7]研究結(jié)果表明，8～12 h為細(xì)菌鞭毛染色的最佳觀察時(shí)間。

普通變形桿菌（proteus vulgaris），廣泛分布于自然界，為周鞭毛菌，易于觀察，是細(xì)菌鞭毛教學(xué)和實(shí)驗(yàn)的理想菌種之一。鞭毛染色步驟繁瑣且結(jié)果不穩(wěn)定，不同的培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件對(duì)細(xì)菌鞭毛的染色效果影響很大，如何選擇合適的培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件是細(xì)菌鞭毛形態(tài)學(xué)研究的熱點(diǎn)問(wèn)題之一[8-11]。同時(shí)由于操作過(guò)程復(fù)雜，影響因素多，成功率偏低，使得鞭毛染色在基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)教學(xué)中往往較難取得預(yù)期的效果。因此，本研究以普通變形桿菌為菌種，通過(guò)常規(guī)染色方法（鍍銀染色法）來(lái)比較普通變形桿菌在不同培養(yǎng)基（基礎(chǔ)肉湯培養(yǎng)基、普通瓊脂培養(yǎng)基、血瓊脂培養(yǎng)）和不同培育時(shí)間（8、12、18、24 h）下的鞭毛染色效果，探討適宜普通變形桿菌鞭毛培育的最佳條件（培養(yǎng)基和培育時(shí)間），以提高鞭毛染色的成功率，從而更好地服務(wù)于基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)的實(shí)驗(yàn)教學(xué)。

1 材料與方法

1.1 材料

菌種為普通變形桿菌，保存于川北醫(yī)學(xué)院病原生物與免疫學(xué)教學(xué)實(shí)驗(yàn)中心。實(shí)驗(yàn)中所用的試劑：肉浸膏、蛋白胨、瓊脂粉購(gòu)于杭州天和微生物試劑有限公司；NaCl、FeCl3購(gòu)于成都科龍化工試劑廠；硝酸銀購(gòu)于天津市博迪化工有限公司；兔血來(lái)源于川北醫(yī)學(xué)院動(dòng)物中心；培養(yǎng)箱購(gòu)于上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司（型號(hào)為SHP-250）。

1.2 培養(yǎng)基[12]

1.2.1 基礎(chǔ)肉湯培養(yǎng)基于1000 mL蒸餾水中加入固體物質(zhì)，包括3.0 g肉浸膏，10.0 g蛋白胨，5.0 g NaCl，1000 ml蒸餾水，混合加熱溶解；校正pH至7.4～7.6，煮沸3～5 min，用濾紙過(guò)濾；分裝于適當(dāng)試管內(nèi)，121℃高壓蒸汽滅菌20 min后，置陰暗處貯存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 基礎(chǔ)瓊脂培養(yǎng)基于基礎(chǔ)肉湯培養(yǎng)基中加入15%的瓊脂粉，121℃高壓蒸汽滅菌20 min后倒入平板上冷卻待用。

1.2.3 血瓊脂培養(yǎng)基將已滅菌的普通瓊脂培養(yǎng)基加熱融化，待其冷卻至50℃左右，在無(wú)菌條件下加入脫纖維兔血5%～10%，輕搖勻（勿使有氣泡）后倒入平板上冷卻待用。

1.3 菌種

從菌種庫(kù)取出普通變形桿菌，采用點(diǎn)接法將細(xì)菌接種于基礎(chǔ)培養(yǎng)基平板上，放入37℃恒溫培養(yǎng)箱里連續(xù)培養(yǎng)18～24 h，后再轉(zhuǎn)接于另一新鮮平板培養(yǎng)基中繼續(xù)培育，如此重復(fù)培育3代（次）后備用。

1.4 染液制作

媒染劑A[13]：3.0 g FeCl3·6H2O，溶于0.01 mol/L的HCl溶液100 mL中，室溫存放，長(zhǎng)期穩(wěn)定。

媒染劑B[13]：?jiǎn)螌幩?5.0 g溶解于100 mL蒸餾水中，加入37%甲醛1.0 mL。室溫存放，長(zhǎng)期穩(wěn)定。

銀染液C[14]：AgNO35.0 g溶于100 mL蒸餾水，取出10.0 mL備用，向余下的90 mL硝酸銀溶液緩慢滴加濃氨水，邊加邊搖動(dòng)，直至形成沉淀完全溶解重新形成澄清液為止，再將備用的AgNO3溶液緩慢回滴，直至形成穩(wěn)定薄霧狀溶液。

1.5 載玻片處理

將新載玻片放入洗衣粉水清潔液中煮沸10 min，取出冷卻后用自來(lái)水沖洗干凈，再用清潔液浸泡煮沸10 min，自來(lái)水沖洗干凈。使用前放入95%酒精浸泡24 h，用時(shí)取出用紗布擦干。

1.6 染色方法

1.6.1 細(xì)菌培養(yǎng)①將傳代后的普通變形桿菌分別以液體培養(yǎng)基接種法接種于肉湯管，點(diǎn)接法接種于基礎(chǔ)瓊脂平板和點(diǎn)接法接種于血瓊脂平板內(nèi)，37℃恒溫培養(yǎng)18 h，經(jīng)染色鏡檢后，選取染色效果最好的培養(yǎng)基。②將傳代的普通變形桿菌接種于染色效果最好的培養(yǎng)基上（隨機(jī)接種3份），分別在37℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)8、12、18、24 h后染色鏡檢，確定染色效果最好的培育時(shí)間。

1.6.2 制片于處理過(guò)的載玻片一端滴加2～3滴蒸餾水，用接種環(huán)以無(wú)菌操作法取菌落邊緣細(xì)菌一環(huán)，懸于蒸餾水中，待水滴稍變渾濁后立即移開(kāi)接種環(huán)，靜置5 min讓鞭毛舒張開(kāi)來(lái)，稍傾斜玻片，使菌液從玻片的一端流向另一端，放置臺(tái)上，自然干燥。

1.6.3 染色取A液1 mL滴入帶有塞的試管內(nèi)，再加入B液1 mL，充分混合，用酒精燈火焰微熱20 s，稍冷卻后取適量混合液滴于制片好的菌膜上并完全覆蓋菌膜染50 s，用蒸餾水沖洗干凈。因A、B混合物不穩(wěn)定，故要盡快使用，否則影響染色效果。

滴加銀染液C覆蓋住菌膜，加熱至蒸氣微冒（約持續(xù)20 s），用蒸餾水沖洗干凈，并保證染液不被蒸干。

1.7 鏡檢觀察

用吸水紙吸干已染色好的載玻片，后在顯微鏡（油鏡）下鏡檢、觀察、拍照。為了避免實(shí)驗(yàn)誤差，每次實(shí)驗(yàn)均在同等條件下重復(fù)3次，不同批次所得的染色玻片均由同一人進(jìn)行鏡檢觀察。

2 結(jié)果

2.1 培養(yǎng)基對(duì)細(xì)菌鞭毛染色效果的影響

分別比較接種于3種不同培育基（普通肉湯培養(yǎng)基、普通瓊脂培養(yǎng)基和普通血瓊脂培養(yǎng)基）上普通變形桿菌鞭毛的鏡檢效果可知，在血瓊脂培養(yǎng)基中培養(yǎng)的細(xì)菌鞭毛伸展性好，菌體形態(tài)完整，粗細(xì)均勻，總體效果好，而普通肉湯培養(yǎng)基和普通瓊脂培養(yǎng)基培養(yǎng)的鞭毛較稀疏，結(jié)果則相對(duì)較差。

2.2 菌種培育時(shí)間對(duì)細(xì)菌鞭毛染色效果的影響

培養(yǎng)時(shí)間長(zhǎng)短對(duì)普通變形桿菌的鞭毛生長(zhǎng)也有較大影響。將普通變形桿菌接種在培育效果較好的血瓊脂培養(yǎng)基中培育，分別培養(yǎng)8、12、18、24 h，比較不同的培養(yǎng)時(shí)間下普通變形桿菌的鏡下效果：8 h菌齡的細(xì)菌菌體粗大且很長(zhǎng)、鞭毛周身如毛絨狀，這可能是變形桿菌菌體還處于分裂繁殖階段，而鞭毛也正在發(fā)育；12 h菌齡細(xì)菌菌體中等大小，鞭毛清晰完整，效果好；18 h菌齡的細(xì)菌菌體較短小，鞭毛周身且完整，易于觀察，24 h菌齡細(xì)菌菌體短小，鞭毛比較稀疏，有些菌體的鞭毛已脫落。因此選用12～18 h菌齡的細(xì)菌做鞭毛染色效果好，易于觀察。見(jiàn)圖1。

圖1 培養(yǎng)不同時(shí)間的細(xì)菌鞭毛染色圖（1000×）

3 討論

鞭毛染色步驟較多、過(guò)程復(fù)雜，影響其染色效果的因子較多，且難以量化，使得細(xì)菌的鞭毛染色歷來(lái)被認(rèn)為是難點(diǎn)多、不易掌握的一種方法。筆者結(jié)合本研究結(jié)果及工作實(shí)踐中的多次試驗(yàn)，不斷總結(jié)，就如何提高細(xì)菌鞭毛染色效果提出以下建議和注意事項(xiàng)：①載玻片要處理干凈，不能有油漬，否則細(xì)菌游動(dòng)不開(kāi)堆積在一起，無(wú)法進(jìn)行觀察。較好的玻片標(biāo)準(zhǔn)：當(dāng)?shù)渭右坏握麴s水在上面時(shí)，水滴能快速均勻的擴(kuò)散開(kāi)來(lái)。②在平板上接種細(xì)菌采用點(diǎn)接法，一般一個(gè)平板點(diǎn)接3處。③培養(yǎng)時(shí)間要掌握好，一般培養(yǎng)時(shí)間控制在12～18 h內(nèi)，若時(shí)間太短，剛形成的鞭毛較小，且菌體較粗大不利于觀察鞭毛，若時(shí)間太長(zhǎng)則鞭毛易脫落也不利于觀察。④制片時(shí)，應(yīng)選取菌落邊緣的幼齡菌，且接種環(huán)應(yīng)先放入載玻片上的蒸餾水中靜置待用，當(dāng)細(xì)菌游動(dòng)開(kāi)來(lái)再拿出，切忌用涂抹法制片，否則易造成鞭毛脫落。⑤制得的片子只能自然干燥，不能加熱固定，否則細(xì)菌變形后鞭毛脫落不利于觀察。⑥染液A、B混合時(shí)要掌握好時(shí)間，且混合后盡快使用，不可久置，特別注意每一步染色后均需用蒸餾水進(jìn)行充分地漂洗，否則背景雜質(zhì)顆粒，不利于觀察。⑦用銀染液染色時(shí)要加熱，且加熱過(guò)程中應(yīng)及時(shí)添加染液，保證染液不干涸。

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The study of culture conditions in bacterial flagella staining

WANG Yan1ZENG Yu2
1.Experimental Teaching Center for Pathogenic Subject,North Sichuan Medical University,Sichuan Province,Nanchong 637000,China;2.College of Life Science,China West Normal University,Sichuan Province,Nanchong 637002,China

ObjectiveTo compare the bacterial flagella staining effect in different medium and different age conditions, and to explore the best medium and incubation time for bacterial flagella staining teaching and morphological identification.Methods①The Proteus vulgaris were inoculated in broth medium,agar medium,and blood agar medium 3 different media,cultured for 18 hours based on 37℃,then stained and checked with the microscopic,and the best medium was chosen.②The Proteus vulgaris were inoculated into the ideal medium culture for 8,12,18,24 h respectively,then stained and checked with microscopic,and the best time of cultivation in flagella staining effect was selected.Results①The bacterial growth on blood agar had good results,with complete structure,clear morphological and clean background.②12-18 hours age had the best effect with clear and complete flagella.ConclusionThe blood agar is the best medium for bacterial flagella staining teaching and morphological identification.Meanwhile,the best time of bacteria in culture is 12-18 hours.

Flagella staining;Media and incubation time;Silver staining;Proteus vulgaris

R446

A

1673-7210（2014）03（b）-0035-03

2013-12-01本文編輯：任念）

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（編號(hào)51309196）。

王燕（1981-），女，四川眉山人，碩士，主要從事病原生物實(shí)驗(yàn)教學(xué)和科研工作。

曾燏（1981-），男，湖北武穴人，博士，副教授，主要從事生物學(xué)教學(xué)和科研工作。