張艷萍 王 太 杜巖巖 虎永彪 婁忠玉 焦文龍

(甘肅省水產(chǎn)研究所, 甘肅省冷水性魚(yú)類(lèi)種質(zhì)資源與遺傳育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 蘭州 730030)

秦嶺細(xì)鱗鮭人工繁育群體與野生群體遺傳變異分析

張艷萍 王 太 杜巖巖 虎永彪 婁忠玉 焦文龍

(甘肅省水產(chǎn)研究所, 甘肅省冷水性魚(yú)類(lèi)種質(zhì)資源與遺傳育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 蘭州 730030)

研究利用線粒體DNA(細(xì)胞色素b基因序列和D-loop區(qū)序列)序列對(duì)秦嶺細(xì)鱗鮭(Brachymystax lenok tsinlingensis)野生群體和人工繁育群體的種群遺傳結(jié)構(gòu)進(jìn)行了分析。結(jié)果表明, 在86個(gè)個(gè)體擴(kuò)增出的線粒體D-loop區(qū)730 bp片段中, A+T含量(63.5%)明顯高于G+C含量(36.5%)。Cyt b基因序列擴(kuò)增1141 bp, A+T含量(52.8%)明顯高于G+C含量(47.2%)。野生群體43個(gè)個(gè)體共檢測(cè)到18個(gè)單倍型, 繁育群體43個(gè)個(gè)體中共檢測(cè)到 24個(gè)單倍型, 兩個(gè)群體共享 8個(gè)單倍型; 秦嶺細(xì)鱗鮭野生群體的單倍型多樣性和核苷酸多樣性(h=0.907±0.026; π=0.00287±0.00074)低于繁育群體(h=0.917±0.035; π=0.00349±0.00083), AMOVA分析顯示, 98.37%的分子差異位于群體內(nèi), 1.63%的分子差異位于群體間, 兩群體之間的遺傳分化水平較低(Fst=0.01631, P=0.1075; Nm=30.16)。采用鄰接法構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)和單倍型網(wǎng)絡(luò)圖分析表明, 各群體內(nèi)的個(gè)體不形成單系群, 兩者之間互有交叉?？傊? 秦嶺細(xì)鱗鮭野生群體與繁育群體之間基因交流充分, 未出現(xiàn)遺傳分化。

秦嶺細(xì)鱗鮭; 線粒體D-loop區(qū); 線粒體細(xì)胞色素b基因; 遺傳多樣性

細(xì)鱗鮭(Brachymystax lenok)隸屬于鮭形目鮭科鮭亞科。在我國(guó)主要分布在東北地區(qū)黑龍江流域、綏芬河、圖們江、鴨綠江, 新疆的額爾齊斯河, 河北省北部白河及灤河上游以及秦嶺北麓渭河流域[1,2]。李思忠[3]根據(jù)幽門(mén)盲囊、側(cè)線鱗和最小性成熟年齡等形態(tài)學(xué)和生理學(xué)特征, 把分布在秦嶺地區(qū)的細(xì)鱗鮭定名為細(xì)鱗鮭的一個(gè)新亞種-秦嶺亞種(Brachymystax lenok tsinlingensis Li), 為我國(guó)特有種。由于其肉質(zhì)鮮美、營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高, 早在1938年就被人工引入到 湑水河中進(jìn)行人工養(yǎng)殖[4,5]。近年來(lái)環(huán)境污染加劇、不當(dāng)?shù)拈_(kāi)發(fā)和過(guò)度捕撈等原因的影響,秦嶺細(xì)鱗鮭資源量急劇減少, 呈點(diǎn)狀分布在渭河上游部分支流中。1998年秦嶺細(xì)鱗鮭被收錄于《中國(guó)瀕危動(dòng)物紅皮書(shū)-魚(yú)類(lèi)》中, 屬瀕危物種, 國(guó)家Ⅱ級(jí)保護(hù)水生野生動(dòng)物[6]。目前, 針對(duì)秦嶺細(xì)鱗鮭的資源調(diào)查[7]、生物學(xué)[8—10]、胚胎發(fā)育[11]和人工繁殖[12]等方面的研究已有大量的報(bào)道, 然而對(duì)其遺傳背景的研究較少, 僅見(jiàn)原居林等采用RAPD技術(shù)對(duì)黑河種群和 湑水河種群的遺傳多樣性進(jìn)行了分析[13]。為了逐步恢復(fù)和保護(hù)秦嶺細(xì)鱗鮭的種質(zhì)資源, 對(duì)其自然種群數(shù)量進(jìn)行合理的補(bǔ)充, 了解人工繁育群體和野生群體的遺傳背景是十分重要的。

線粒體DNA (mtDNA)由于結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、進(jìn)化速度快和幾乎不發(fā)生重組等特點(diǎn), 使其成為研究物種起源、系統(tǒng)發(fā)生和種內(nèi)遺傳結(jié)構(gòu)的有效遺傳標(biāo)記[14],其中一些基因被廣泛應(yīng)用在魚(yú)類(lèi)的種群遺傳變異和系統(tǒng)發(fā)育分析。王培欣等[15]利用線粒體D-loop區(qū)分析得出8個(gè)流域叉尾斗魚(yú)種群遺傳多樣性很低且存在地理差異; 高天翔等[16]利用線粒體Cytb基因分析得出松江鱸8個(gè)群體的遺傳多樣性較高; 張迪等[17]利用線粒體COⅠ基因序列分析太湖新銀魚(yú)的遺傳多樣性, 得出有人工移植歷史種群遺傳多樣性較高。本研究利用線粒體D-loop區(qū)和Cytb基因序列對(duì)秦嶺細(xì)鱗鮭人工繁育群體和野生群體的遺傳多樣性進(jìn)行比較分析, 以期為秦嶺細(xì)鱗鮭放流效果的跟蹤監(jiān)測(cè)、種質(zhì)資源遺傳保護(hù)提供重要依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣品采集和DNA提取

收集自渭河上游支流馬鹿河野生秦嶺細(xì)鱗鮭為野生群體, 將收集自馬鹿河和渭河另一支流西河的秦嶺細(xì)鱗鮭人工馴化后, 繁殖的子一代為繁育群體,各采集43個(gè)尾鰭樣品, 用無(wú)水乙醇固定帶回實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行分析, 采用酚/氯仿法提取基因組DNA[18]。

1.2 PCR擴(kuò)增和序列測(cè)定

擴(kuò)增 mtDNA控制區(qū)序列的引物: 正向引物為: LRBT-25: 5′-AGAGCGCCGGTGTTGTAATC-3′; 反向引物為: LRBY-1195:5′-GCTAGCGGGACTTTC TAGGGT-3′[19]。PCR反應(yīng)體系為25 μL, 其中包括1 U TaqDNA聚合酶(TaKaRa), 1 μL dNTPs (2.5 mmol/L), 5 μL 10×Taq buffer (TaKaRa, 含 Mg2+), 兩條引物(10 mmol/L)各1 μL, 3 μL DNA模板, 其余雙蒸水補(bǔ)足。PCR反應(yīng)程序?yàn)? 94℃預(yù)變性3min; 94℃變性45s, 55℃退火45s, 72℃延伸45s, 共30個(gè)循環(huán); 反應(yīng)結(jié)束后在 72℃再延伸8min。PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后送上海美吉生物工程公司純化并測(cè)序, 測(cè)序引物為擴(kuò)增引物。

擴(kuò)增線粒體 Cytb基因序列的引物: L14724 (5′-GACTTGAAAAACCACCGTTG-3′); H15915 (5′-CTCCGATCTCCGGATTACAAGAC-3′)[20]。PCR反應(yīng)體系為 25 μL, 其中包括 1 U TaqDNA聚合酶(TaKaRa), 1 μL dNTPs (2.5 mmol/L), 5 μL 10×Taq buffer (TaKaRa, 含Mg2+), 兩條引物(10 mmol/L)各1 μL, 3 μL DNA模板, 其余雙蒸水補(bǔ)足。PCR反應(yīng)程序?yàn)? 94℃預(yù)變性5min; 94℃變性45s, 50℃退火45s, 72℃延伸 45s, 共 35個(gè)循環(huán);反應(yīng)結(jié)束后在72℃再延伸 10min。PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后送上海美吉生物工程公司純化并測(cè)序, 測(cè)序引物為擴(kuò)增引物。

1.3 數(shù)據(jù)分析

測(cè)序獲得的序列通過(guò)Chromas 1.45軟件獲得原始序列數(shù)據(jù); 利用CLUSTAL X2軟件對(duì)所有序列進(jìn)行比對(duì), 參照測(cè)序圖進(jìn)行人工校正。利用PAUP*V4.0軟件進(jìn)行同質(zhì)性檢驗(yàn)(Parition homogeneity test)序列片段聯(lián)合分析的可靠性; 用 DnaSP 5.0軟件計(jì)算單倍型數(shù)、單倍型多樣性和核苷酸多樣性等; 運(yùn)用Arlequin 3.1軟件中的分子變異(AMOVA)方法估算遺傳變異在群體內(nèi)和群體間的分布及遺傳分化指數(shù)Fst值及其P值(用排列測(cè)驗(yàn)法, 1000次重排后的顯著性檢驗(yàn)), 根據(jù) Nm=(1–Fst)/2Fst得到種群間的基因流值; 用Mega 4.0軟件統(tǒng)計(jì)堿基組成, 并基于Kimura 2-papamter模型計(jì)算單倍型及群體間的遺傳距離, 用鄰接法(Neighbor-joining, NJ)構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù), 系統(tǒng)樹(shù)中節(jié)點(diǎn)的自舉置信水平應(yīng)用自引導(dǎo)估計(jì), 循環(huán)次數(shù)為1000次。Network軟件構(gòu)建單倍型網(wǎng)絡(luò)圖, 用以檢測(cè)單倍型之間的進(jìn)化關(guān)系。

2 結(jié)果

2.1 序列分析

對(duì)野生群體和繁育群體的線粒體控制區(qū)序列進(jìn)行比對(duì)排序后, 得到730 bp的同源序列。43尾繁育群體所得序列共包含20個(gè)核苷酸變異位點(diǎn), 其中簡(jiǎn)約信息位點(diǎn)15個(gè), 單突變位點(diǎn)5個(gè)。所有序列間沒(méi)有出現(xiàn)缺失與插入, 4個(gè)轉(zhuǎn)換位點(diǎn), 1個(gè)顛換位點(diǎn), 平均轉(zhuǎn)換與顛換數(shù)比值為4.3。在野生群體中, 43個(gè)個(gè)體共檢測(cè)到 26個(gè)變異位點(diǎn), 其中簡(jiǎn)約信息位點(diǎn) 21個(gè), 單突變位點(diǎn) 5個(gè), 平均轉(zhuǎn)換與顛換數(shù)比值為3.3。在秦嶺細(xì)鱗鮭養(yǎng)殖群體與野生群體中, 86個(gè)個(gè)體共檢測(cè)到 27個(gè)變異位點(diǎn), 其中簡(jiǎn)約信息位點(diǎn) 26個(gè), 單突變位點(diǎn) 1個(gè), 平均轉(zhuǎn)換與顛換數(shù)比值為3.4。堿基組成分析顯示, A、T、C和G堿基平均含量分別為31.9%、31.6%、20.8%和15.7%, 其中A+T含量(63.5%)明顯高于 G+C含量(36.5%), 表現(xiàn)出明顯的AT偏好和反G偏倚, 與其他脊椎動(dòng)物線粒體控制區(qū)核苷酸的組成特點(diǎn)相一致[21]。

獲得 86尾個(gè)體線粒體 Cytb基因全序列共1141 bp。所得的序列共包含25個(gè)變異位點(diǎn), 其中簡(jiǎn)約信息位點(diǎn)24個(gè), 單突變位點(diǎn)1個(gè)。A、T、C和G堿基平均含量分別為24.6%、28.2%、31.6%和15.6%,其中A+T含量(52.8%)明顯高于G+C含量(47.2%)。43尾野生群體所含序列共有 23個(gè)變異位點(diǎn), 其中簡(jiǎn)約信息位點(diǎn)16個(gè), 單突變位點(diǎn)7個(gè)。43尾繁育群體所含序列共有10個(gè)變異位點(diǎn), 其中簡(jiǎn)約信息位點(diǎn)9個(gè), 單突變位點(diǎn)1個(gè)。

2.2 遺傳多樣性

對(duì)86尾個(gè)體的控制區(qū)片段和Cytb基因片段進(jìn)行同質(zhì)性檢驗(yàn), 結(jié)果顯示兩者之間是一致的(P=0.13)。基于1871 bp線粒體基因聯(lián)合片段分析秦嶺細(xì)鱗鮭野生群體與繁育群體的遺傳多樣性信息見(jiàn)表1, 由表1中可以看出86尾個(gè)體共檢測(cè)出34個(gè)單倍型, 顯示出較高的單倍型多樣性和較低的核苷酸多樣性(h=0.919±0.022; π=0.00321±0.00077)。繁育群體與野生群體相比較, 繁育群體的單倍型多樣性和核苷酸多樣性(h=0.917±0.035; π=0.00349±0.00083)都 高 于 野 生 群 體 (h=0.907±0.026; π=0.00287± 0.00074)。在秦嶺細(xì)鱗鮭繁育群體43尾個(gè)體中共檢測(cè)出24個(gè)單倍型, 野生群體43尾個(gè)體中共檢測(cè)出18個(gè)單倍型, 其中兩群體共享 8個(gè)單倍型, 占總單倍型個(gè)數(shù)的23.5%。

2.3 群體遺傳分化

通過(guò)計(jì)算兩群體間的遺傳距離得出, 繁育群體和野生群體內(nèi)的遺傳距離分別為0.004和0.003,繁育群體和野生群體之間的遺傳距離為 0.003, 略低于繁育群體內(nèi)的遺傳距離, 與野生群體的遺傳距離相近。分子變異(AMOVA)結(jié)果顯示(表 2), 秦嶺細(xì)鱗鮭群體內(nèi)的存在較高的遺傳變異, 占98.37%, 而群體間的變異僅占 1.63%, 表明分子之間遺傳變異主要來(lái)自于群體內(nèi)的個(gè)體之間。兩群體之間的 Fst=0.01631(P=0.1075), Nm=30.16, 也顯示出秦嶺細(xì)鱗鮭繁育群體和養(yǎng)殖群體之間的遺傳分化不顯著。

表1 秦嶺細(xì)鱗鮭野生與繁育群體遺傳多樣性參數(shù)Tab. 1 Parameters of genetic diversity in cultured and wild Brachymystax lenok tsinlingensis populations

表2 秦嶺細(xì)鱗鮭群體AMOVA分析結(jié)果Tab. 2 Results of AMOVA analysis of Brachymystax lenok tsinlingensis

2.4 系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)

由秦嶺細(xì)鱗鮭繁育群體24個(gè)單倍型和野生群體18個(gè)單倍型構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)(圖1)可以看出, 各野生群體和繁育群體的個(gè)體均為形成單系群, 兩者之間互有交叉, 表明兩群體的遺傳相似性較高, 親緣關(guān)系較近。由 network軟件形成秦嶺細(xì)鱗鮭群體34個(gè)單倍型的簡(jiǎn)約網(wǎng)絡(luò)圖(圖2)也顯示出發(fā)散狀態(tài)勢(shì),兩群體未形成各自的單系群。單倍型H3位于網(wǎng)絡(luò)圖的中心, 且享有該單倍型的個(gè)體數(shù)量在種群中所占的比例明顯高于其他單倍型所占比例, 表明H3可能是原始單倍型。

3 討論

3.1 群體的遺傳多樣性

物種遺傳多樣性的高低是評(píng)判物種能否長(zhǎng)期存在的依據(jù), 核苷酸多樣性是衡量一個(gè)種群 mtDNA的遺傳多樣性的重要指標(biāo), 表示各種線粒體 DNA單倍型在群體中所占的比例[22]。由實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知,秦嶺細(xì)鱗鮭 86尾個(gè)體的單倍型多樣性(h=0.919± 0.022)較高, 但核苷酸多樣性(π=0.00321±0.00077)較低, 在銀鯧[23]、鲇魚(yú)[24]和松江鱸[16]等魚(yú)類(lèi)中也存在這種現(xiàn)象, 這種單倍型多樣性較高核苷酸多樣性較低的現(xiàn)象表明秦嶺細(xì)鱗鮭群體可能是由一個(gè)較小種群經(jīng)歷奠基者效應(yīng)或瓶頸效應(yīng)后迅速擴(kuò)張, 隨著個(gè)體數(shù)量的增多, 導(dǎo)致單倍型多樣性提高, 但缺少足夠的時(shí)間來(lái)積累核苷酸序列的變異[25], 這種推測(cè)與秦嶺細(xì)鱗鮭的起源歷程相一致[2]。但本文中得到的秦嶺細(xì)鱗鮭單倍型多樣性較高的結(jié)論與夏穎哲等[26]分析黃河地區(qū)細(xì)鱗鮭的單倍型多樣性(0.622)的結(jié)果不符, 這可能由于夏穎哲等[26]采集樣本數(shù)量(n=10)較少影響了遺傳多樣性的正確評(píng)估。

在本研究中繁育群體的單倍型多樣性和核苷酸遺傳多樣性(h=0.917±0.035; π=0.00349±0.00083)都高于野生群體(h=0.907±0.026; π=0.00287±0.00074),與原居林等[13]湑對(duì)黑河種群和 水河種群的遺傳多樣性進(jìn)行分析得出秦嶺細(xì)鱗鮭繁殖群體后代遺傳多樣性降低的結(jié)論不相符, 這可能是由于本實(shí)驗(yàn)繁殖群體親本來(lái)源分布較廣, 且每年都會(huì)補(bǔ)充一定數(shù)量的親本, 有效避免了近親繁殖和瓶頸效應(yīng), 保持了秦嶺細(xì)鱗鮭人工繁育群體的遺傳多樣性。而原居林等所采集樣本為20世紀(jì)30 年代引入到 湑水河中進(jìn)行馴養(yǎng)的群體, 在長(zhǎng)期的人工繁殖過(guò)程中, 由于基礎(chǔ)繁育群體數(shù)量較少、近親繁殖和遺傳漂變等因素,使得養(yǎng)殖群體喪失一些多態(tài)等位基因造成遺傳多樣性水平降低。

圖1 基于線粒體基因聯(lián)合片段構(gòu)建秦嶺細(xì)鱗鮭的NJ樹(shù)(繁育群體H、野生群體W)Fig. 1 The neighbor-joining tree obtained by combining the control region and cytochrome b sequences (1871 bp) of Brachymystax lenok tsinlingensis population (H. Cultured population; W. Wild population)

圖2 基于線粒體基因聯(lián)合片段構(gòu)建秦嶺細(xì)鱗鮭34個(gè)單倍型的簡(jiǎn)約網(wǎng)絡(luò)圖Fig. 2 The statistical parsimony network based on the combined sequence data for the 34 haplotypes of Brachymystax lenok tsinlingensis population

3.2 群體的遺傳結(jié)構(gòu)分析

群體間的遺傳距離和遺傳分化指數(shù)是評(píng)價(jià)一個(gè)群體多態(tài)程度的重要指標(biāo)。種群間遺傳距離D值的范圍是 0—0.05, 亞種間的遺傳距離 D值范圍是0.02—0.2[26]。本研究結(jié)果表明, 秦嶺細(xì)鱗鮭 2個(gè)種群內(nèi)的遺傳距離為(0.003—0.004), 繁育群體與野生群體之間的遺傳距離為 0.003, 表明秦嶺細(xì)鱗鮭繁育群體與野生群體之間的遺傳變異程度低, 分化程度不明顯。秦嶺細(xì)鱗鮭群體單倍型之間的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)和網(wǎng)絡(luò)進(jìn)化圖分析結(jié)果表明, 繁育群體和野生群體之間無(wú)明顯的遺傳分化, 兩者的遺傳相似程度較高。根據(jù) Wright關(guān)于遺傳分化程度的理論認(rèn)為 Fst值在 0—0.05表示低度遺傳分化[27], 秦嶺細(xì)鱗鮭繁育群體和野生群體之間的遺傳分化指數(shù)(Fst)為0.01631, 表明兩群體之間存在低度遺傳分化, 分子變異(AMOVA)的分析結(jié)果顯示, 98.37%的遺傳變異來(lái)源與群體內(nèi), 僅有 1.63%的變異來(lái)源與兩群體之間。由基因流Nm值來(lái)看, 基因流是指基因從一個(gè)群體遷移至另一個(gè)群體時(shí)產(chǎn)生的基因流動(dòng), 一般認(rèn)為Nm＞1, 表明群體間的基因流水平較高, 遺傳分化較小。秦嶺細(xì)鱗鮭野生群體與繁育群體之間的基因流Nm值達(dá)到30.16, 遠(yuǎn)大于1, 也同樣表明了兩群體之間的遺傳分化較小, 這可能是由于兩者之間共享單倍型較多有關(guān)。秦嶺細(xì)鱗鮭資源量的減少可以通過(guò)人工增殖手段來(lái)恢復(fù), 但如果其種群遺傳多樣性的降低卻難以彌補(bǔ)。目前秦嶺細(xì)鱗鮭的繁育群體主要用于增殖放流, 保持其較高的種群遺傳多樣性具有重要意義。

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ANALYSIS OF THE GENETIC DIVERSITY OF CULTURED AND WILD BRACHYMYSTAX LENOK TSINLINGENSIS POPULATIONS BASED ON MTDNA D-LOOP AND CYT B

ZHANG Yan-Ping, WANG Tai, DU Yan-Yan, HU Yong-Biao, LOU Zhong-Yu and JIAO Wen-Long
(Gansu Key Laboratory of Cold Water Fishes Germplasm Resources and Genetics Breeding, Gansu Fishers Research Institute, Lanzhou 730030, China)

Brachymystax lenok tsinlingensis is one type of endemic fishes distributed in Qinling Mountains. Due to the environmental deterioration and overfishing, the size of its population has decreased sharply. To rescue this species it is necessary to study its genetic structure and phylogeography and hereby obtain better understanding of the population. In this study, we determined the genetic diversity of cultured and wild Brachymystax lenok tsinlingensis populations by analyzing their mtDNA Cyt b and D-loop genes. The results showed that the average contents of A, T, C and G in D-loop were 31.9%, 31.6%, 20.8% and 15.7%, respectively. The contents of A+T (63.5%) were higher than those of C+G (36.5%). In the Cyt b gene, the average contents of A, T, C and G were 24.6%, 28.2%, 31.6% and 15.6%, respectively. The contents of A+T (52.8%) were also higher than those of G+C (47.2%). We observed that 43 wild individuals had 18 haplotypes, and that 43 cultured individuals had 24 haplotypes. The two populations shared 8 haplotypes in common. The average haplotype diversity and nucleotide diversity of the wild population (h=0.907±0.026; π=0.00287±0.00074) were lower than those of the cultured population (h=0.917±0.035; π=0.00349±0.00083). The AMOVA analysis showed that the molecular variation between the two populations was 98.37%, and the variation within a population was 1.63%. The level of genetic differentiation was low (Fst=0.01631, P=0.1075; Nm=30.16). Phylogenetic tree based on NJ and minimum spanning network for Brachymystax lenok tsinlingensis showed that individuals within the two populations did not form a monophyletic clade. Our results suggested that there was an efficient gene flow between the cultured and the wild populations, and there was no significant genetic differentiation between the two populations.

Brachymystax lenok tsinlingensis; mtDNA D-loop; mtDNA Cyt b; Genetic diversity

Q346

A

1000-3207(2014)05-0828-06

10.7541/2014.124

2013-07-01;

2014-01-26

國(guó)家自然科學(xué)基金(31160529); 甘肅省自然科學(xué)基金(1208RJYA033)資助

張艷萍(1966—), 女, 甘肅武威人; 博士; 主要從事冷水魚(yú)類(lèi)養(yǎng)殖。E-mail: zypfish@sina.com

王太, E-mail: aqhongqi@qq.com