陳思柴志欣，2王永，2鐘金城，2

（1.西南民族大學(xué) 動(dòng)物遺傳育種學(xué)國(guó)家民委-教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，成都 610041；2.西南民族大學(xué)青藏高原研究院，成都 610041）

牦牛MC1R基因的多態(tài)性研究

陳思1柴志欣1，2王永1，2鐘金城1，2

（1.西南民族大學(xué) 動(dòng)物遺傳育種學(xué)國(guó)家民委-教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，成都 610041；2.西南民族大學(xué)青藏高原研究院，成都 610041）

旨在為探究牦牛MC1R基因多態(tài)性與毛色形成的相關(guān)性，利用PCR-SSCP和DNA測(cè)序技術(shù)，對(duì)64頭牦牛（33頭黑色九龍牦牛，31頭白色天祝白牦牛）的MC1R基因多態(tài)性進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果表明：天祝白牦牛和九龍牦牛均有3種基因型（AA、BB、AB），但天祝白牦牛的多態(tài)性較低，而九龍牦牛表現(xiàn)為中度多態(tài)。經(jīng)χ2適合性檢驗(yàn)，2個(gè)牦牛品種在該基因多態(tài)位點(diǎn)上均偏離Hardy-Weinberg平衡。測(cè)序結(jié)果表明BB型與AA型在該片段的第179位堿基處存在C→A單堿基突變；第214位堿基處發(fā)生T→C突變。

牦牛 MC1R基因 PCR-SSCP 基因多態(tài)性

牦牛（Bos grunniens）是分布于海拔3 000-5 500 m，以我國(guó)青藏高原為中心及其毗鄰的高山、亞高山地區(qū)的特有牛種之一。我國(guó)現(xiàn)有牦牛1 470余萬(wàn)頭，占世界牦?？倲?shù)的95%，占我國(guó)牛只總數(shù)的1/6，為當(dāng)?shù)啬撩裉峁┠獭⑷?、毛、役力、燃料等生活生產(chǎn)必需品。其中牦牛毛是傳統(tǒng)特產(chǎn)，產(chǎn)量大，質(zhì)量好，除供應(yīng)國(guó)內(nèi)需要外，是我國(guó)出口暢銷的畜產(chǎn)品之一，并以白牦牛毛最為馳名。牦牛毛、絨制品深受喜愛，但是由于大多數(shù)牦牛為黑色、黑白色和褐色等，顏色較深不易染色，導(dǎo)致牦牛毛制品出現(xiàn)顏色單一，不能滿足廣大消費(fèi)者的需求［1-3］。因此，從基因水平探究控制牦牛毛色遺傳的主效基因具有重要的意義。

黑色素皮質(zhì)素受體Ⅰ（melanoccortin receptorⅠ，MC1R）在黑色素細(xì)胞中表達(dá)MC1R，與天然配體α-促黑素細(xì)胞激素（α-MSH）相互作用，經(jīng)由G蛋白耦合的CAMP信號(hào)通路，調(diào)節(jié)黑色素細(xì)胞內(nèi)的一系列級(jí)聯(lián)反應(yīng)，最終經(jīng)多巴或多巴胺合成各自的衍生物——褐黑素或真黑色素，使動(dòng)物呈現(xiàn)不同的毛色或羽色［4］。目前，研究表明在人、馬、牛、綿羊、豬、犬、狐貍和鼠等哺乳動(dòng)物中均發(fā)現(xiàn)了MC1R基因的突變與黑色素性狀變異或皮膚癌等疾病有關(guān)。且作為影響動(dòng)物黑色素的重要基因廣泛用于相關(guān)研究。本研究選擇兩個(gè)不同毛色的牦牛品種為研究對(duì)象，應(yīng)用PCR-SSCP技術(shù)對(duì)牦牛MC1R基因進(jìn)行多態(tài)性分析，以期為牦牛毛色形成規(guī)律的研究提供一些參考資料。

1 材料與方法

1.1 材料

選取健康成年的九龍牦牛、天祝白牦牛作為試驗(yàn)動(dòng)物（表1），采集耳組織，75%乙醇保存帶回實(shí)驗(yàn)室，-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

表1 試驗(yàn)動(dòng)物、采樣地點(diǎn)及毛色

1.2 方法

1.2.1 基因組DNA提取及檢測(cè) 采用動(dòng)物組織基因組DNA提取試劑盒（Tiangen生物技術(shù)有限公司）提取基因組DNA，用10 g/L的瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計(jì)雙重檢測(cè)DNA的純度和濃度，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 引物設(shè)計(jì)與PCR擴(kuò)增 根據(jù)普通牛MC1R基因組序列（GenBank Accession No：NC_007316），綜合利用軟件primer5.0、Oligo6.0設(shè)計(jì)引物，覆蓋片段長(zhǎng)度為268 bp。引物：PF：5'-GGAGAACGTGCTGGTAGTG-3'，PF：5'-GGGCGTAGAAGATGGAGATG-3'，由上海英駿生物技術(shù)有限公司合成，去離子水稀釋（100 pmol/μL），-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

PCR反應(yīng)采用25 μL體系：10×TaqBuffer 2.5 μL，dNTP Mixture（10 mmol/L）1.5 μL，上下游引物(10 pmol/mL) 1.0 μL，DNA Template (25 ng/μL) 1.5 μL，TaqPolymerase（5 U/μL）0.25 μL，ddH2O 17.25 μL。PCR反應(yīng)程序：94℃預(yù)變性5 min；94℃變性45 s，60℃退火30 s，72℃延伸30 s，35個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸3 min，8℃保存。

1.2.3 PCR產(chǎn)物SSCP分析 采用0.1 g/mL（Arc∶Bis質(zhì)量比為29∶1，緩沖液為1×TBE）的非變性丙烯酰胺凝膠電泳檢測(cè)：取5 μL PCR產(chǎn)物，加入8 μL上樣緩沖液（φ=95%去離子甲酰胺、0.25 g/L二甲苯青、2.5 g/L溴酚藍(lán)），98℃變性10 min，立即置于冰浴中放置10 min。變性后的PCR產(chǎn)物，200 V電壓電泳10 min后140 V恒壓電泳4 h，銀染顯帶后，觀察結(jié)果。

1.2.4 測(cè)序分析 選取純合基因型個(gè)體進(jìn)行克隆測(cè)序，運(yùn)用BioEdit、DNAMAN軟件對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行校對(duì)分析。

1.2.5 統(tǒng)計(jì)分析

1.2.5.1 基因頻率及基因型頻率 一個(gè)基因座位上具有兩個(gè)等位基因的情況下，基因頻率計(jì)算公式如下［5］：

p=（2nAA+nBB）/[2（nAA+nAB+nBB）]

q=（2nAA+nBB）/[2（nAA+nAB+nBB）]

其中：p是等位基因A的基因頻率，q是等位基因B的基因頻率，nAA、nAB、nBB分別是群體中基因型AA、AB和BB型的個(gè)體數(shù)。

1.2.5.2 群體雜合度（Heterozygosity，H） 雜合度，即某一基因位點(diǎn)上等位基因間雜合的程度。平均雜合度是衡量群體內(nèi)遺傳變異的有效指標(biāo)。平均雜合度越大，群體內(nèi)遺傳變異程度越大。雜合度計(jì)算公式為：

其中：m為等位基因數(shù)，Pi為第i個(gè)等位基因頻率。

1.2.5.3 多態(tài)信息含量（PIC） PIC用于對(duì)標(biāo)記基因多態(tài)性的估計(jì)，是表示DNA變異程度的高低的一個(gè)指標(biāo)，PIC＞0.5為高度多態(tài)，0.25＜PIC＜0. 5為中度多態(tài)，PIC＜0.25為低度多態(tài)。PIC可根據(jù)Bostein等［6］的公式進(jìn)行計(jì)算。

其中：m為等位基因數(shù)目，Pi和Pj分別為第i個(gè)和第j個(gè)等位基因在群體中的頻率。

1.2.5.4 Hardy-Weinberg平衡檢驗(yàn)［7，8］檢驗(yàn)公式為：

其中：Ei：理論值，Oi：實(shí)際觀察值，n為等位基因數(shù)。

2 結(jié)果

2.1 PCR擴(kuò)增結(jié)果

凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果（圖1，圖2）顯示，擴(kuò)增產(chǎn)物片段大小268 bp左右，與設(shè)計(jì)的產(chǎn)物大小一致，擴(kuò)增結(jié)果良好，可用于SSCP分析。

圖1 天祝白牦牛PCR擴(kuò)增的瓊脂糖凝膠電泳圖

圖2 九龍牦牛PCR擴(kuò)增的瓊脂糖凝膠電泳圖

2.2 牦牛的PCR-SSCP多態(tài)性

對(duì)天祝白牦牛、九龍牦牛MC1R基因的擴(kuò)增片段進(jìn)行單鏈構(gòu)象多態(tài)性分析，銀染后在凝膠成像系統(tǒng)中的檢測(cè)結(jié)果見圖3和圖4。

圖3 天祝白牦牛PCR-SSCP檢測(cè)

圖4 九龍牦牛PCR-SSCP檢測(cè)

2.3 PCR-SSCP結(jié)果的測(cè)序分析

將天祝白牦牛和九龍牦牛中AA、BB型個(gè)體的PCR產(chǎn)物進(jìn)行克隆測(cè)序。序列比對(duì)結(jié)果發(fā)現(xiàn)：BB型與AA型相比在該片段的第179堿基處存在C→A的單堿基突變；在第214堿基處有一個(gè)T→C的單堿基突變（圖5）。

圖5 天祝白牦牛與九龍牦牛AA、BB型比對(duì)圖

2.4 牦牛品種的遺傳多樣性

在天祝白牦牛和九龍牦牛中均檢測(cè)到3種基因型，分別定義為AA型、BB型、AB型（圖3，圖4）。在31頭天祝白牦牛中檢測(cè)到15頭AA型、4頭BB型、12頭AB型；在33頭九龍牦牛中檢測(cè)到7頭AA型、5頭BB型、21頭AB型。結(jié)果（表2）顯示，天祝白牦牛AA型頻率為0.483 9、BB型頻率為0.1290、AB型頻率為0.387 1；九龍牦牛中AA型頻率為0.212 1、BB型頻率為0.151 5、AB型頻率為0.636 4。

天祝白牦牛的雜合度為0.321 2，多態(tài)信息含量為0.201 6；九龍牦牛的雜合度為0.498 2，多態(tài)信息含量為0.374 1（表2）。按Bostein等提出的衡量基因變異程度高低的多態(tài)信息含量指標(biāo)，天祝白牦牛的多態(tài)信息含量為低度多態(tài)（PIC＜0.25）；九龍牦牛的多態(tài)信息含量為中度多態(tài)（0.25＜PIC＜0.5），且雜合度較高，遺傳變異較大。

Hardy-Weinberg平衡的χ2適合性檢驗(yàn)結(jié)果表明，天祝白牦牛的χ2值為6.04，差異顯著，偏離Hardy-Weinberg平衡（P＜0.01）；九龍牦牛的χ2值為11.33，差異極顯著，也不符合Hardy-Weinberg平衡（P＜0.01）。推測(cè)這2個(gè)牦牛品種在該位點(diǎn)上受到較大選擇、突變等因素的影響。

3 討論

近年來，就MC1R基因遺傳多態(tài)性對(duì)家畜毛色影響方面，李洪濤等［9］利用PCR-SSCP和實(shí)時(shí)熒光定量技術(shù)研究哈薩克綿羊MC1R和ASIP基因多態(tài)性及表達(dá)量與被毛顏色表型的相關(guān)性，發(fā)現(xiàn)MC1R基因的多態(tài)位點(diǎn)（P.M73K）與被毛顏色極顯著的相關(guān)（P＜0.01）且黑色被毛中MC1R基因的表達(dá)量與白色被毛中差異極顯著（P＜0.01），與棕色被毛差異顯著（P＜0.05）。姜俊兵等［10］通過對(duì)中國(guó)羊駝種群MC1R基因的PCR-SSCP檢測(cè)發(fā)現(xiàn)AA和AB基因型，且AA基因型均存在于有色被毛羊駝個(gè)體中。唐賀等［11］研究發(fā)現(xiàn)在文山黃牛、昭通黃牛和短角牛中發(fā)現(xiàn)E+和e2種等位基因，檢測(cè)到E+/E+、E+/e 和

e/e 3種基因型，而在迪慶黃牛中存在E+/E+、ED/ED、E+/ED、E+/e 和ED/e 5種基因型；與所研究個(gè)體的毛色相聯(lián)系發(fā)現(xiàn)，E+和ED等位基因與黑色表型有關(guān)，而e等位基因與紅色表型有關(guān)，但黃色、棕色和紅色表型還與其它座位基因相關(guān)聯(lián)。

表2 牦牛品種MC1R的基因頻率和基因型頻率及遺傳分析

本研究通過PCR-SSCP分析方法顯示，九龍牦牛、天祝白牦牛的MC1R基因部分序列存在多態(tài)性。其擴(kuò)增片段均存在AA、AB和BB 3種基因型，其中A為優(yōu)勢(shì)等位基因。且該片段存在兩個(gè)突變位點(diǎn)：179 bp處C→A突變，214 bp處T→C突變，但這些突變?cè)诤谏?、白色牦牛中均出現(xiàn)。所以該基因的核苷酸及相應(yīng)蛋白水平上的差異是否導(dǎo)致牦牛毛色的差異，有待進(jìn)一步深入研究。

從群體遺傳多態(tài)性角度分析，多態(tài)信息含量和群體雜合度都是對(duì)群體內(nèi)遺傳變異大小的衡量指標(biāo)。本研究中九龍牦牛的雜合度為0.498 2，多態(tài)信息含量為0.374 1，處于中度多態(tài)，遺傳變異較豐富，且雜合度較高，選擇潛力大。天祝白牦牛的多態(tài)信息含量、雜合度較九龍牦牛的低，說明兩個(gè)牦牛品種在MC1R基因該片段上有一定的多態(tài)性差異，但多態(tài)性水平均較低，這與近年來對(duì)這兩個(gè)品種在體態(tài)外貌、生理生化、細(xì)胞（染色體）、分子等不同水平和層次以及生產(chǎn)性能、產(chǎn)區(qū)地形地貌、水熱條件等自然和社會(huì)生態(tài)環(huán)境方面的綜合研究和分析結(jié)果相吻合，反映了其各自的遺傳特性?？ǚ竭m合性檢驗(yàn)結(jié)果表明，兩個(gè)牦牛品種在該突變區(qū)域均偏離Hardy-Weinberg平衡狀態(tài)，說明經(jīng)過長(zhǎng)期的進(jìn)化和選擇，目前這兩個(gè)品種在該位點(diǎn)仍受選擇、突變、遺傳漂變等因素的影響。進(jìn)一步開展牦牛MC1R基因的相關(guān)研究，對(duì)深入了解該基因的功能，尋找控制牦牛毛色的深層機(jī)理有重要意義。

4 結(jié)論

九龍牦牛和天祝白牦牛MC1R基因部分序列存在兩個(gè)突變位點(diǎn)，第179位的C→A突變，第214位的T→C突變。群體遺傳學(xué)分析顯示九龍和天祝白牦牛均存在遺傳變異。

［1］ 中國(guó)畜禽遺傳資源狀況編委會(huì). 中國(guó)畜禽遺傳資源狀［M］.北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社, 2004.

［2］ 《中國(guó)牦牛學(xué)》編寫委員會(huì).中國(guó)牦牛［M］.成都：四川科學(xué)技術(shù)出版社, 1989.

［3］ 鐘金城.牦牛遺傳與育種［M］.成都：四川科學(xué)技術(shù)出版社, 1996.

［4］ 湯寧.基因突變檢測(cè)方法進(jìn)展［J］.國(guó)外醫(yī)學(xué)衛(wèi)生學(xué)分冊(cè), 1994（4）：200-203.

［5］ Southern E, Mir K, Shchepinov M. Molecular interactionson microarrays［J］. Nature Genetics, 1999（S）：529.

［6］ Limonen M, Hello T, Ebeling T, et al. Screening mutations in the exon 26 of the applipoprote in B gene in hypercholest-erdmic finnish familes by the single-strand polymorphism method［J］. Human Mutation, 1994, 4：217-223.

［7］ 劉平華, 李奎, 彭中鎮(zhèn), 等.豬生長(zhǎng)激素基因的PCRR-FLP與PCR-SSCP研究概況［J］.畜牧獸醫(yī)雜志, 1994（3）：16-18.

［8］ 李鵬飛, 董常生, 杜海燕, 等.黑素皮質(zhì)素受體1（MC1R）基因與哺乳動(dòng)物毛色［J］.畜牧獸醫(yī)雜志, 2006, 25（1）：21-22.

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［10］ 姜俊兵, 任杰, 于秀菊, 等.中國(guó)羊駝種群MC1R基因的PCRSSCP分析［J］.家畜生態(tài)學(xué)報(bào), 2010, 31（3）：15-18.

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（責(zé)任編輯 馬鑫）

The Polymorphism of MC1R Gene in Yak

Chen Si1Chai Zhixin1，2Wang Yong1，2Zhong Jincheng1，2
（1. Key Laboratory of Animal Genetics and Breeding，Southwest University for Nationalities，State Ethnic Affairs Commission and Ministry of Education，Chengdu 610041；2. Institute of Tibetan Plateau Research，Southwest University for Nationalities，Chengdu 610041）

It was to explore the relationship between MC1R genotype and the coat color formation in yak, polymorphism of MC1R gene was detected by PCR-SSCP and DNA sequencing techniques in 64 yaks（33 white coat color and 31 black coat color）. The results showed that there were polymorphisms in the amplified region for the Tianzhu yak and Jiulong yak. In Tianzhu yak and Jiulong yak, three genotypes（AA, BB and AB）were detected. The result of χ2, three yak breeds were not fit for Hardy-Weinberg law. Sequencing revealed on single nucleotide mutation（C→A）at 179bp and（T→C）at 214 bp of the amplified region of Tianzhu yak and Jiulong yak.

Yak MCIR gene PCR-SSCP Polymorphism

2013-11-13

國(guó)家科技支撐計(jì)劃課題（2012BAD13B06），中央高校基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)資金項(xiàng)目（11NZYTH03）

陳思，女，碩士，研究方向：基因組學(xué)與生物信息學(xué)；E-mail：swunyak2525@163.com

鐘金城，男，博士，教授，研究方向：動(dòng)物遺傳學(xué)；E-mail：zhongjincheng518@126.com