何 青 楊巧玉 劉 敏 聶漢祥 張固琴 丁續(xù)紅 黃 毅 余紅纓

(武漢大學(xué)人民醫(yī)院呼吸內(nèi)科，武漢430060)

自然殺傷(Natural killer，NK)T 細(xì)胞是一群獨(dú)特和數(shù)量較少的淋巴細(xì)胞亞群，分為Ⅰ型NKT 細(xì)胞和Ⅱ型NKT 細(xì)胞，兩者之間存在相互調(diào)節(jié)作用［1］。硫酸腦苷酯是來(lái)源于髓磷脂的一種脂類物質(zhì)，可以被Ⅱ型NKT 細(xì)胞的T 細(xì)胞受體(TCRs)特異性識(shí)別，并活化Ⅱ型NKT 細(xì)胞［2］。我們的初步研究顯示硫酸腦苷酯可以抑制哮喘小鼠氣道炎癥［3］，但機(jī)制尚不清楚。因此，我們觀察硫酸腦苷酯對(duì)哮喘小鼠肺Ⅱ型NKT 細(xì)胞數(shù)量和活性的影響，并了解過(guò)繼轉(zhuǎn)移硫酸腦苷酯活化的Ⅱ型NKT 細(xì)胞對(duì)哮喘小鼠氣道炎癥的影響，探討硫酸腦苷酯抑制哮喘小鼠氣道炎癥的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和主要試劑 6 周齡健康雌性BALB/c 小鼠購(gòu)自武漢大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，無(wú)特定病原菌(SPF)環(huán)境飼養(yǎng)。雞卵清白蛋白(OVA，Grade，V)和氫氧化鋁凝膠(美國(guó)Sigma 公司)，硫酸腦苷酯(美國(guó)Matreya 公司)，IL-4 和IL-5 ELISA 試劑盒(美國(guó)Ebioscience 公司)，大鼠抗小鼠IgE 抗體(美國(guó)Biolegend 公司)，親和素連接的辣根過(guò)氧化物酶(美國(guó)Sigma 公司)，小鼠CD1d 單體由美國(guó)國(guó)家衛(wèi)生研究院(National Institutes of Health)贈(zèng)送。

1.2 小鼠分組與哮喘模型的建立 32 只BALB/c小鼠按隨機(jī)數(shù)字表法隨機(jī)分為對(duì)照組、哮喘組、硫酸腦苷酯治療組和過(guò)繼轉(zhuǎn)移組，每組8 只。建立小鼠哮喘模型的方法為:哮喘組、硫酸腦苷酯治療組和過(guò)繼轉(zhuǎn)移組小鼠于第0 天和第7 天腹腔注射含100 μg OVA 和20 μg 氫氧化鋁凝膠的PBS 200 μl，并于第25 天、第26 天和第27 天以1%戊巴比妥鈉麻醉，使用含100 μg OVA 的PBS 50 μl 鼻腔滴入。正常對(duì)照組小鼠在相應(yīng)時(shí)間內(nèi)腹腔注射等量的PBS 并以PBS 鼻腔滴入。

1.3 硫酸腦苷酯/CD1d 四聚體的制備 參照文獻(xiàn)［4］制備硫酸腦苷酯/CD1d 四聚體。將硫酸腦苷酯溶于含0.5%Tween20 的PBS 中，硫酸腦苷酯與生物素連接的CD1d 單體按摩爾比3∶1混合室溫靜置過(guò)夜;第2 天按每200 μg 硫酸腦苷酯/CD1d 混合物中加入80 μg PE 標(biāo)記的鏈酶親和素，室溫避光4 h后獲得PE 標(biāo)記的硫酸腦苷酯/CD1d 四聚體，于4℃避光保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 硫酸腦苷酯治療方法 硫酸腦苷酯治療組小鼠于第25 天鼻腔滴入OVA 前1 h 每只小鼠腹腔注射含硫酸腦苷酯20 μg 的PBS 200 μl。

1.5 硫酸腦苷酯體外活化Ⅱ型NKT 細(xì)胞的制備與過(guò)繼轉(zhuǎn)移 參照文獻(xiàn)［4］將正常小鼠脾單個(gè)核細(xì)胞制備成單細(xì)胞懸液，按1 ×107個(gè)/孔在六孔板中培養(yǎng)，每孔加入1640 完全培養(yǎng)基3 ml。正常小鼠脾細(xì)胞經(jīng)硫酸腦苷酯刺激3 h 后流式細(xì)胞儀分選Ⅱ型NKT 細(xì)胞(Sulfatide/CD1d 四聚體+TCR-β+細(xì)胞)。于第25 天OVA 激發(fā)前1 h，將硫酸腦苷酯體外活化的Ⅱ型NKT 細(xì)胞經(jīng)尾靜脈注射到過(guò)繼轉(zhuǎn)移組小鼠體內(nèi)，每只注入3 ×106個(gè)。

1.6 標(biāo)本的收集和處理與細(xì)胞學(xué)、組織學(xué)檢測(cè) 各組小鼠于末次激發(fā)48 h 后眼球取血2 ml，分離血清分裝，-80℃保存，用于檢測(cè)血清OVA 特異性IgE。隨后分離氣管，插入套管針，暴露胸腔，結(jié)扎右肺門，用含1 mmol/L EDTA 的冷PBS 0.5 ml 灌洗，每次在肺內(nèi)停留30 s，回抽灌洗液，共3 次，回抽率在80%以上視為成功。支氣管肺泡灌洗液(BALF)在4℃下1 500 r/min 離心5 min，收集上清液，-80℃保存，用于檢測(cè)IL-4 和IL-5 水平。用含1% BSA 的PBS 重懸細(xì)胞沉淀，調(diào)整細(xì)胞濃度為1 ×106ml-1，取100 μl 細(xì)胞懸液離心涂片，姬姆薩染色檢測(cè)各細(xì)胞分類計(jì)數(shù)。取右肺組織，充分切碎，Ⅰ型膠原酶消化，通過(guò)50 μm 細(xì)胞濾網(wǎng)過(guò)濾獲得肺組織單細(xì)胞混懸液，以密度梯度離心法分離肺組織單細(xì)胞混懸液中單個(gè)核細(xì)胞(MNCs)，調(diào)整濃度為1 ×106ml-1，以流式細(xì)胞液檢測(cè)硫酸腦苷酯/小鼠CD1d 四聚體+TCR-β+細(xì)胞(Ⅱ型NKT 細(xì)胞)以及IL-4+和IFN-γ+硫酸腦苷酯/小鼠CD1d 四聚體+TCR-β+細(xì)胞(IL-4+和IFN-γ+Ⅱ型NKT 細(xì)胞)的百分比。取左肺組織，以10%中性甲醛溶液固定，常規(guī)石蠟包埋、切片，HE 和PAS 染色，觀察肺組織炎癥和氣道基底膜PAS+細(xì)胞(杯狀細(xì)胞)。

1.7 血清OVA 特異性IgE 以及BALF 中細(xì)胞因子的檢測(cè) 采用ELISA 法檢測(cè)小鼠血清OVA 特異性IgE 的水平，結(jié)果以O(shè)D 值表示為相對(duì)水平，其檢測(cè)步驟簡(jiǎn)述如下:96 孔板每孔加入200 μg/ml 的OVA 50 μl，37℃，1 h;洗板1 次，每孔加含10%血清的PBS，200 μl 每孔，37℃，1 h;洗板1 次，加待測(cè)血清，4℃，過(guò)夜;洗板6 次，每孔加入0.5 μg/ml 的生物素連接的大鼠抗小鼠IgE 抗體100 μl，室溫，1 h;洗板6 次，每孔加入親和素連接的辣根過(guò)氧化物酶(按說(shuō)明書稀釋)100 μl，室溫，1 h;洗板6 次，每孔加入100 μl TMB，室溫，15 min;每孔加入50 μl 終止液，450 nm 波長(zhǎng)讀數(shù)得到各孔OD 值。參考試劑說(shuō)明書，采用ELISA 法檢測(cè)BALF 中的IL-4 和IL-5 的水平。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS13.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。數(shù)據(jù)以±s 表示，采用單因素方差分析，P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組HE 和PAS 染色 對(duì)照組小鼠肺組織無(wú)炎癥表現(xiàn)，氣道基底膜無(wú)PAS+細(xì)胞;哮喘組小鼠肺組織炎癥浸潤(rùn)明顯，氣道基底膜可見大量PAS+細(xì)胞;硫酸腦苷酯治療組和過(guò)繼轉(zhuǎn)移組小鼠肺組織炎癥浸潤(rùn)減輕，氣道基底膜PAS+細(xì)胞減少(圖1)。

2.2 各組小鼠BALF 中細(xì)胞分類百分比比較 硫酸腦苷酯治療組和過(guò)繼轉(zhuǎn)移組小鼠BALF 中嗜酸性粒細(xì)胞百分比明顯低于哮喘組(均P ＜0.01);但明顯高于對(duì)照組(均P ＜0.01)(表1，圖2)。

圖1 各組小鼠肺組織病理表現(xiàn)Fig.1 Lung tissue pathology of mice in each group

表1 各組BALF 中各細(xì)胞分類百分比比較(n=8，±s，%)Tab.1 Comparison of percentages of differential cell counts in BALF between each group(n=8，±s，%)

表1 各組BALF 中各細(xì)胞分類百分比比較(n=8，±s，%)Tab.1 Comparison of percentages of differential cell counts in BALF between each group(n=8，±s，%)

Note:1)P ＜0.01，compared with normal control group;2)P ＜0.05，3)P ＜0.01，compared with asthma group.

圖2 各組小鼠肺泡灌洗液中細(xì)胞分類比較Fig.2 Comparison of percentages of differential cell counts in BALF between each group

2.3 各組小鼠血清OVA 特異性IgE 和BALF 中IL-4、IL-5 水平 對(duì)照組小鼠血清中未檢測(cè)到OVA 特異性IgE。硫酸腦苷酯治療組和過(guò)繼轉(zhuǎn)移組小鼠血清OVA 特異性IgE 的OD 值分別為(0.397 2±0.116 8)和(0.423 2±0.060 7)，明顯低于哮喘組(0.603 8±0.123 1)(均P ＜0.01)。硫酸腦苷酯治療組和過(guò)繼轉(zhuǎn)移組小鼠BALF 中IL-4 和IL-5 水平明顯低于哮喘組(均P ＜0.05)，但明顯高于對(duì)照組(均P ＜0.01)(表2)。

2.4 硫酸腦苷酯治療組與正常對(duì)照組、哮喘組小鼠肺Ⅱ型NKT 細(xì)胞的百分比和活性 硫酸腦苷酯治療組小鼠肺Ⅱ型NKT 細(xì)胞百分比與哮喘組和對(duì)照組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＞0.05)。以分泌細(xì)胞因子的水平表示肺Ⅱ型NKT 細(xì)胞的活性，硫酸腦苷酯治療組小鼠肺IL-4+和IFN-γ+Ⅱ型NKT 細(xì)胞的百分比明顯高于對(duì)照組和哮喘組(均P ＜0.01)(圖3、4，表3)。

表2 各組BALF 中IL-4、IL-5 水平比較(n=8，±s，pg/ml)Tab.2 Comparison levels of IL-4 and IL-5 in BALF between each group(n=8，±s，pg/ml)

表2 各組BALF 中IL-4、IL-5 水平比較(n=8，±s，pg/ml)Tab.2 Comparison levels of IL-4 and IL-5 in BALF between each group(n=8，±s，pg/ml)

Note:1)P ＜0.01，compared with normal control group;2)P ＜0.05，3)P ＜0.01，compared with asthma group.

圖3 肺Ⅱ型NKT 細(xì)胞占肺MNCs 的百分比比較Fig.3 Comparison of percentage of type ⅡNKT cells in lung mononuclear cells(MNCs)between each group

圖4 肺IL-4 +和IFN-γ+Ⅱ型NKT 細(xì)胞占肺Ⅱ型NKT 細(xì)胞的百分比比較Fig.4 Comparison of percentages of IL-4 + type ⅡNKT cells and IFN-γ+ NKT cells in lung type ⅡNKT cells

表3 各組肺MNCs 中Ⅱ型NKT 細(xì)胞、IL-4 +和IFN-γ+Ⅱ型NKT 細(xì)胞的百分比(n=8，±s，%)Tab.3 Comparison of percentages of type ⅡNKT cells，IL-4 +type ⅡNKT cells and IFN-γ+type ⅡNKT cells between each group(n=8，±s，%)

表3 各組肺MNCs 中Ⅱ型NKT 細(xì)胞、IL-4 +和IFN-γ+Ⅱ型NKT 細(xì)胞的百分比(n=8，±s，%)Tab.3 Comparison of percentages of type ⅡNKT cells，IL-4 +type ⅡNKT cells and IFN-γ+type ⅡNKT cells between each group(n=8，±s，%)

Note:1)P ＜ 0.01，compared with normal control group;2)P ＜ 0.01，compared with asthma group.

3 討論

硫酸腦苷酯(Sulfatide)，即3'硫酸半乳糖神經(jīng)酰胺(3'-sulfated galactosyl ceramide)是來(lái)源于髓磷脂的一種脂類物質(zhì)，由Ⅱ型NKT 細(xì)胞的TCRs 識(shí)別，硫酸腦苷酯可以活化大部分Ⅱ型NKT 細(xì)胞［2］。Jahng等［5］研究發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎鼠模型中樞神經(jīng)系統(tǒng)組織中硫酸腦苷酯反應(yīng)性NKT 細(xì)胞數(shù)量增高;硫酸腦苷酯活化Ⅱ型NKT 細(xì)胞防止野生鼠產(chǎn)生抗原誘導(dǎo)的實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎。Halder 等［6］研究發(fā)現(xiàn)硫酸腦苷酯活化ConA 誘導(dǎo)性肝炎小鼠肝組織Ⅱ型NKT 細(xì)胞可以誘導(dǎo)Ⅰ型NKT細(xì)胞免疫無(wú)能，防止炎癥性肝病的形成。我們的初步研究發(fā)現(xiàn)硫酸腦苷酯可以減輕哮喘小鼠肺組織炎癥浸潤(rùn)［3］。本研究發(fā)現(xiàn)硫酸腦苷酯治療組哮喘小鼠肺組織炎癥浸潤(rùn)減輕，氣道基底膜PAS+細(xì)胞(杯狀細(xì)胞)減少，BALF 中嗜酸性粒細(xì)胞百分比明顯減少，血清OVA 特異性IgE 和BALF 中IL-4、IL-5 水平降低，同時(shí)肺IL-4+和IFN-γ+Ⅱ型NKT 細(xì)胞的數(shù)量明顯高于對(duì)照組和哮喘組，結(jié)果提示硫酸腦苷酯可以抑制哮喘小鼠氣道炎癥，同時(shí)伴隨肺Ⅱ型NKT 細(xì)胞活化。進(jìn)一步觀察發(fā)現(xiàn)過(guò)繼轉(zhuǎn)移硫酸腦苷酯體外活化的Ⅱ型NKT 細(xì)胞可以明顯抑制哮喘小鼠氣道炎癥，表現(xiàn)為肺組織炎性細(xì)胞浸潤(rùn)和氣道基底膜PAS+細(xì)胞減少;BALF 中的嗜酸性粒細(xì)胞百分比明顯降低;BALF 中IL-4、IL-5 的水平和血清OVA 特異性IgE 的水平明顯降低。上述研究說(shuō)明硫酸腦苷酯可能通過(guò)活化Ⅱ型NKT 細(xì)胞抑制哮喘小鼠氣道炎癥。

硫酸腦苷酯活化的Ⅱ型NKT 細(xì)胞抑制哮喘小鼠氣道炎癥的機(jī)制尚不清楚。NKT 細(xì)胞分為Ⅰ型NKT 細(xì)胞和Ⅱ型NKT 細(xì)胞，兩者之間存在相互調(diào)節(jié)［1］。目前認(rèn)為Ⅰ型NKT 細(xì)胞參與哮喘氣道高反應(yīng)性和氣道炎癥的形成［7］。硫酸腦苷酯活化的Ⅱ型NKT 細(xì)胞通過(guò)調(diào)節(jié)Ⅰ型NKT 細(xì)胞的功能抑制肝臟和腎臟的缺血再灌注損傷以及ConA 誘導(dǎo)的炎癥性肝病的炎癥反應(yīng)［6，8，9］。因此，我們推測(cè)硫酸腦苷酯活化的Ⅱ型NKT 細(xì)胞可能通過(guò)調(diào)節(jié)Ⅰ型NKT 細(xì)胞的功能抑制哮喘小鼠的氣道炎癥。研究發(fā)現(xiàn)硫酸腦苷酯活化的Ⅱ型NKT 細(xì)胞可以調(diào)節(jié)炎癥性肝病鼠模型和非肥胖小鼠Ⅰ型糖尿病模型樹突狀細(xì)胞的功能［6，10］。由于Ⅰ型NKT 細(xì)胞需要樹突狀細(xì)胞的CD1d 分子遞呈脂類抗原誘導(dǎo)其活化［11］。因此，我們推測(cè)硫酸腦苷酯活化的Ⅱ型NKT 細(xì)胞可能通過(guò)調(diào)節(jié)樹突狀細(xì)胞的功能抑制Ⅰ型NKT 細(xì)胞的活化進(jìn)一步影響哮喘小鼠氣道炎癥，但需進(jìn)一步研究。

綜上所述，硫酸腦苷酯可以抑制哮喘小鼠氣道炎癥，可能由其活化肺Ⅱ型NKT 細(xì)胞所致。因此，激活哮喘肺Ⅱ型NKT 細(xì)胞可能成為哮喘治療的新靶點(diǎn)。

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