吳 亮 ，李 聞 ，郭明洲

中國人民解放軍總醫(yī)院消化內(nèi)科，北京100853

食管癌是嚴(yán)重威脅人類健康的常見惡性腫瘤之一，其發(fā)病率和死亡率在我國分別位居惡性腫瘤的第五位和第四位［1］。食管癌的兩個主要病理類型是鱗狀細(xì)胞癌(鱗癌)和腺癌，約占所有食管腫瘤病理類型的90%以上［2］。西方國家以腺癌多見，而我國則以鱗癌為主［3］。近年來，盡管食管癌的治療方法有了較大進(jìn)展，但是食管癌患者的預(yù)后仍然很差，5年生存率仍低于20%［4］。食管癌的發(fā)生是多階段、多基因參與的過程，其發(fā)生呈累積性改變［2］。越來越多的研究表明，遺傳學(xué)(基因突變、雜合子丟失、純合子缺失等)和表觀遺傳學(xué)(DNA甲基化、組蛋白修飾、基因組印跡、非編碼RNA等)的改變是腫瘤發(fā)生的主要原因［5］，而DNA甲基化被認(rèn)為是表觀遺傳學(xué)改變最常見的改變之一［6］。本文主要介紹了食管癌發(fā)生、發(fā)展過程中一些關(guān)鍵抑癌基因的啟動子甲基化改變，以及相關(guān)改變在食管鱗癌早期診斷、預(yù)后評估以及治療等方面的應(yīng)用。

1 DNA甲基化

DNA甲基化是指DNA在甲基轉(zhuǎn)移酶的作用下，以S-腺苷甲硫氨酸為甲基供體，將甲基與基因CpG二核苷酸中的胞嘧啶結(jié)合，形成5＇甲基胞嘧啶［7］。DNA甲基化主要發(fā)生在CpG二核苷酸，而人類基因組中CpG二核苷酸分布并不均一，其中位于基因啟動子區(qū)的CpG二核苷酸富集區(qū)(長度＞200 bp，CG含量＞50%)被稱為CpG島，大約50%的人類基因含有CpG島，且多位于基因的5＇端［8］。人類正常組織中，大多數(shù)CpG島都是非甲基化的，并由多種轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控基因表達(dá)。正常情況下，啟動子區(qū)CpG島甲基化與胚胎發(fā)生、細(xì)胞分化以及某些等位基因的特異性失活有關(guān)，如X染色體失活［9］;而在癌變組織中則往往表現(xiàn)為全基因組序列的低甲基化及啟動子區(qū)域的高甲基化［7］。

2 抑癌基因啟動子高甲基化與食管鱗癌的發(fā)生、發(fā)展

在食管癌發(fā)生、發(fā)展過程中，多種抑癌基因由于啟動子區(qū)CpG島高甲基化而導(dǎo)致表達(dá)下降或缺失。以下主要介紹近年來報(bào)道得較多的一些抑癌基因在食管鱗癌中的甲基化改變及其功能研究。

2.1 細(xì)胞周期調(diào)控相關(guān)基因 P16(INK4a/MTS1/CDKN2A)基因:定位于染色體9p21，又稱作細(xì)胞周期素依賴激酶4的抑制物(CDK4I)，全長8.5 kb，是一種細(xì)胞周期調(diào)控基因。p16可以通過與cyclinD競爭結(jié)合CDK 4/6，抑制CDK 4/6的活性，使pRb處于非磷酸化或低磷酸化狀態(tài)，抑制細(xì)胞周期從G1期向 S期過渡［10］。食管鱗癌組織中，p16基因啟動子區(qū)甲基化率為10% ～88%［11-12］。王凡等［13］發(fā)現(xiàn)，p16 基因在正常食管上皮組織中未見明顯甲基化改變，但是38.1%的食管不典型增生以及46.2%的食管鱗癌組織中存在p16基因啟動子高甲基化以及表達(dá)下降，而且該基因的甲基化表達(dá)下降跟食管鱗癌的侵襲和轉(zhuǎn)移相關(guān)［14］。提示該基因在食管鱗癌的發(fā)生、發(fā)展中具有重要作用。

2.2 侵襲、轉(zhuǎn)移相關(guān)基因 CDH1(Cadherin 1，E-cadherin)基因:定位于染色體16q24。該基因編碼的上皮型鈣粘蛋白(E-cadherin，E-cad)屬于跨膜糖蛋白家族成員，是介導(dǎo)同型細(xì)胞間黏附的黏附因子，在維持正常上皮細(xì)胞的細(xì)胞間連接方面起著重要作用［15］。食管鱗狀細(xì)胞癌中，CDH1表達(dá)缺失跟腫瘤的侵襲、轉(zhuǎn)移和不良預(yù)后相關(guān)［16］。CDH1啟動子區(qū)高甲基化發(fā)生率為34% ～80%［17-18］。CDH1高甲基化的食管鱗癌組織中，97.5%伴隨著 E-cad表達(dá)降低［19］，并且跟早期食管癌的復(fù)發(fā)相關(guān)［20］。體外研究發(fā)現(xiàn)，CDH1在完全甲基化的細(xì)胞株表達(dá)缺失，而去甲基化藥物可以恢復(fù)其表達(dá)［17，19］。進(jìn)一步證實(shí) CDH1基因甲基化是導(dǎo)致其表達(dá)下調(diào)的重要機(jī)制。

2.3 增殖、分化相關(guān)基因 RARβ(Retinoic acid receptor beta)基因，定位于染色體3p24。人類RARβ基因包括三種亞型(β1，β2和β4)，分別編碼相應(yīng)的維甲酸受體亞型蛋白，通過介導(dǎo)維甲酸信號通路調(diào)控細(xì)胞的增殖和分化［21］。RARβ在啟動子區(qū)高甲基化的食管鱗癌細(xì)胞株中表達(dá)降低，經(jīng)去甲基化藥物處理可以恢復(fù)其表達(dá)［22-23］，提示啟動子區(qū)高甲基化是導(dǎo)致RARβ表達(dá)下調(diào)的重要機(jī)制。食管鱗癌組織中，RARβ基因啟動子區(qū)甲基化率為22% ～72%［24-25］。Wang等［22］發(fā)現(xiàn)，12%的正常食管上皮、58%的食管不典型增生上皮以及70%的食管鱗癌組織中有RARβ基因啟動子區(qū)CpG島甲基化。食管鱗癌患者外周血DNA中RARβ基因甲基化率為63.2%，并且在術(shù)后明顯下降［25］。提示該基因啟動子高甲基化與食管鱗癌的疾病進(jìn)程密切相關(guān)。

2.4 DNA修復(fù)相關(guān)基因 FHIT(Fragile histidine triad)基因，即脆性組氨酸三聯(lián)體基因，定位于染色體3p14.2，基因全長約1 Mb，由10個外顯子組成，覆蓋FRA3B脆性位點(diǎn)、腎癌相關(guān)t(3;8)斷裂點(diǎn)、抑癌基因PTPRG的5＇末端及HPV16整合位點(diǎn)［26］。在食管鱗癌中，F(xiàn)HIT基因啟動子區(qū)甲基化率為6.4% ～84%［11，27］，F(xiàn)HIT 基因高甲基化是導(dǎo)致 FHIT 表達(dá)降低的主要機(jī)制之一。食管鱗癌組織中FHIT基因啟動子高甲基化與患者吸煙史高度相關(guān)，而且FHIT高甲基化的早期食管癌患者預(yù)后不良［28］。在正常食管鱗狀上皮細(xì)胞中，尼古丁也可以通過增加DNMT3B的表達(dá)，引起FHIT基因高甲基化以及蛋白表達(dá)下調(diào)［29］。FHIT表達(dá)缺失的食管鱗狀細(xì)胞癌呈現(xiàn)出侵襲力和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移能力增加［30-31］。

2.5 細(xì)胞凋亡相關(guān)基因 DAPK(death associated protein kinase)基因:定位于染色體9q21.33。該基因編碼一種促凋亡絲/蘇氨酸激酶，在多種凋亡信號通路中發(fā)揮作用［32-33］。食管鱗癌中DAPK甲基化率為26%～51%［18，24］，但是在正常食管上皮中卻鮮有甲基化發(fā)生。此外，DAPK在食管鱗癌組織中的表達(dá)較癌旁組織明顯降低。提示該基因的甲基化及表達(dá)下調(diào)是食管鱗癌的重要事件。

3 抑癌基因啟動子高甲基化與食管鱗癌的早期診斷和預(yù)后評估

與傳統(tǒng)的病理學(xué)檢查方法比較，抑癌基因啟動子的甲基化檢測用于食管鱗癌早期診斷和預(yù)后評估具有明顯的優(yōu)勢。一方面，比起RNA和蛋白質(zhì)，DNA要穩(wěn)定得多，而且取材方便，無論是組織DNA還是外周血DNA都可以用于甲基化檢測［25，34］;另一方面，甲基化特異性PCR(MSP)技術(shù)作為DNA甲基化檢測的常用方法，具有非常高的檢測靈敏度，例如，MSP技術(shù)可以將1個甲基化的DNA拷貝從混有1 000個非甲基化的 DNA 拷 貝 中 檢 測 出 來［35］。 p16［13］、ENG［36］、HIN［37］、SOX17［38］、TAC1［39］等抑癌基因啟動子甲基化改變往往在早期食管鱗癌、甚至在不典型增生等食管癌的癌前病變中就已經(jīng)出現(xiàn)，并且甲基化程度隨著疾病的進(jìn)展而升高，提示這些抑癌基因的啟動子甲基化狀態(tài)檢測可以用于食管鱗癌的早期診斷。食管鱗癌患者術(shù)前外周血DNA中p16和RARβ基因甲基化率分別高達(dá)71.1%和63.2%，而在術(shù)后兩種基因的甲基化程度均明顯下降［25］，提示p16和RARβ基因甲基化水平對于食管鱗癌手術(shù)效果評價有重要價值。此外，CDH1和ITGA4基因啟動子高甲基化與食管鱗癌的臨床分期有重要關(guān)系，這兩個基因的高甲基化狀態(tài)分別與Ⅰ期和Ⅱ期食管鱗癌患者術(shù)后較高的復(fù)發(fā)風(fēng)險以及較低的無病生存率高度相關(guān)［20］。而 Lee等［24］也發(fā)現(xiàn)，不伴有p14、DCC和CADM1啟動子高甲基化改變的Ⅰ期食管鱗癌患的五年無病生存率，是p14、DCC和(或)CADM1基因啟動子同時出現(xiàn)高甲基化的Ⅰ期食管鱗癌患者的7.13倍。提示這些抑癌基因啟動子高甲基化可以作為Ⅰ期或Ⅱ期食管鱗癌患者術(shù)后復(fù)發(fā)的預(yù)后評價指標(biāo)。

4 抑癌基因啟動子區(qū)高甲基化與食管鱗癌的治療

表觀遺傳學(xué)改變與遺傳學(xué)改變的一個最大不同點(diǎn)就在于前者往往是可逆的，這就意味著表觀遺傳學(xué)所導(dǎo)致的基因表達(dá)改變可以通過一定的方法使之恢復(fù)正常表達(dá)，為腫瘤的防治提供了一條新的思路［40］。DNA甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑由于可以通過抑制DNA甲基轉(zhuǎn)移酶的活性，阻斷DNA的高度甲基化，對于腫瘤的表觀遺傳學(xué)治療具有重要意義。2004年，胞嘧啶核苷類似物阿扎胞苷獲得美國食品藥物管理局批準(zhǔn)用于骨髓異常綜合癥的治療［41］，成為歷史上最先進(jìn)入臨床應(yīng)用的DNA甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑。2006年，作為阿扎胞苷脫氧核糖類似物，5-氮雜-2＇-脫氧胞苷(5Aza-dc，又名地西他濱)也獲得美國食品藥物管理局批準(zhǔn)用于臨床治療。目前，很多新的DNA甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑正在開發(fā)中，其中一些已經(jīng)進(jìn)入臨床前研究，包括Zebularine(又名折布拉林)、RG108、EGCG、鹽酸肼屈嗪和普魯卡因胺等［42］。食管鱗癌細(xì)胞株中，原來存在甲基化表達(dá)沉默的 ENG［36］、CDH1［19］、RARβ［43］和 SOX17［38］等基因在5Aza-dc處理后得以恢復(fù)表達(dá)，并發(fā)揮抑制細(xì)胞侵襲［30］、細(xì)胞增殖、克隆形成以及裸鼠體內(nèi)成瘤［38，43］等抑癌功能。盡管核苷類DNA甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑可能在腫瘤的表觀遺傳學(xué)治療方面發(fā)揮重要作用，但是目前尚沒有關(guān)于該類藥物用于食管鱗癌臨床治療的報(bào)道。該類藥物固有的細(xì)胞毒性作用以及作用靶點(diǎn)的非選擇性等缺陷，可能是制約其臨床應(yīng)用的重要因素［42］。因此，開發(fā)非核苷類的DNA甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑以及進(jìn)一步研究作用靶點(diǎn)高選擇性的核苷類抑制劑，可能是今后腫瘤表觀遺傳學(xué)治療藥物研究的重要方向。

5 展望

食管鱗癌中大量抑癌基因因?yàn)閱幼痈呒谆鴮?dǎo)致表達(dá)下調(diào)或失活，提示多個抑癌基因的遺傳學(xué)和表觀遺傳學(xué)改變共同導(dǎo)致了食管鱗癌的發(fā)生，對這些基因的甲基化檢測有利于食管鱗癌的早期診斷、預(yù)后評估以及靶向治療。但是，一方面，單個抑癌基因甲基化檢測靈敏度在不同研究報(bào)道中存在較大的波動，這與目前所應(yīng)用的硫化修飾后的檢測方法較復(fù)雜，不易掌握有關(guān)。因此，研發(fā)新的不需要硫化修飾的檢測方法，將改善DNA甲基化檢測在臨床檢測中的應(yīng)用。聯(lián)合檢測多基因甲基化可能用于食管鱗癌的早期診斷、鑒別診斷和預(yù)后評估。另一方面，目前針對抑癌基因甲基化改變的研究積累尚不足，進(jìn)一步對食管鱗癌甲基化組的研究有望揭開表觀遺傳在食管癌發(fā)生發(fā)展中的秘密，為食管癌的表觀遺傳治療奠定基礎(chǔ)。

［1］Chen W，Zheng R，Zhang S，et al.Report of incidence and mortality in china cancer registries，2009 ［J］.Chin J Cancer Res，2013，25(1):10-21.

［2］Enzinger PC，Mayer RJ.Esophageal cancer［J］.N Engl J Med，2003，349(23):2241-2252.

［3］Jemal A，Bray F，Center MM，et al.Global cancer statistics［J］.CA Cancer J Clin，2011，61(2):69-90.

［4］Siegel R，Naishadham D，Jemal A.Cancer statistics，2012［J］.CA Cancer J Clin，2012，62(1):10-29.

［5］Choo KB.Epigenetics in disease and cancer［J］.Malays J Pathol，2011，33(2):61-70.

［6］Dawson MA，Kouzarides T.Cancer epigenetics:from mechanism to therapy［J］.Cell，2012，150(1):12-27.

［7］Baylin SB，Herman JG.DNA hypermethylation in tumorigenesis:Epigenetics joins genetics［J］.Trends Genet，2000，16(4):168-174.

［8］Lander ES，Linton LM，Birren B，et al.Initial sequencing and analysis of the human genome［J］.Nature，2001，409(6822):860-921.

［9］Sato F，Meltzer SJ.Cpg island hypermethylation in progression of esophageal and gastric cancer［J］.Cancer，2006，106(3):483-493.

［10］Dyson N.The regulation of e2f by prb-family proteins［J］.Genes Dev，1998，12(15):2245-2262.

［11］Kim YT，Park JY，Jeon YK，et al.Aberrant promoter cpg island hypermethylation of the adenomatosis polyposis coli gene can serve as a good prognostic factor by affecting lymph node metastasis in squamous cell carcinoma of the esophagus［J］.Dis Esophagus，2009，22(2):143-150.

［12］Wang J，Sasco AJ，F(xiàn)u C，et al.Aberrant DNA methylation of p16，mgmt，and hmlh1 genes in combination with mthfr c677t genetic polymorphism in esophageal squamous cell carcinoma［J］.Cancer Epidemiol Biomarkers Prev，2008，17(1):118-125.

［13］Wang F，Xie XJ，Piao YS，et al.Methylation of p16 and hmlh1 genes in esophageal squamous cell carcinoma and reflux esophagitis［J］.Zhonghua Bing Li Xue Za Zhi，2011，40(8):537-541.王凡，謝新紀(jì)，樸穎實(shí)，等.食管鱗癌和反流性食管炎中p16和hmlh1基因甲基化的探討［J］.中華病理學(xué)雜志，2011，40(8):537-541.

［14］Maesawa C，Tamura G，Nishizuka S，et al.Inactivation of the cdkn2 gene by homozygous deletion and de novo methylation is associated with advanced stage esophageal squamous cell carcinoma［J］.Cancer Res，1996，56(17):3875-3878.

［15］Cavallaro U，Christofori G.Cell adhesion and signalling by cadherins and ig-cams in cancer［J］.Nat Rev Cancer，2004，4(2):118-132.

［16］Sato F，Shimada Y，Watanabe G，et al.Expression of vascular endo-thelial growth factor，matrix metalloproteinase-9 and e-cadherin in the process of lymph node metastasis in oesophageal cancer［J］.Br J Cancer，1999，80(9):1366-1372.

［17］Si HX，Tsao SW，Lam KY，et al.E-cadherin expression is commonly downregulated by cpg island hypermethylation in esophageal carcinoma cells［J］.Cancer Lett，2001，173(1):71-78.

［18］Guo M，Ren J，House MG，et al.Accumulation of promoter methylation suggests epigenetic progression in squamous cell carcinoma of the esophagus［J］.Clin Cancer Res，2006，12(15):4515-4522.

［19］Ling ZQ，Li P，Ge MH，et al.Hypermethylation-modulated downregulation of cdh1 expression contributes to the progression of esophageal cancer［J］.Int J Mol Med，2011，27(5):625-635.

［20］Lee EJ，Lee BB，Han J，et al.Cpg island hypermethylation of e-cadherin(cdh1)and integrin alpha4 is associated with recurrence of early stage esophageal squamous cell carcinoma［J］.Int J Cancer，2008，123(9):2073-2079.

［21］Xu XC.Tumor-suppressive activity of retinoic acid receptor-beta in cancer［J］.Cancer Lett，2007，253(1):14-24.

［22］Wang Y，F(xiàn)ang MZ，Liao J，et al.Hypermethylation-associated inactivation of retinoic acid receptor beta in human esophageal squamous cell carcinoma［J］.Clin Cancer Res，2003，9(14):5257-5263.

［23］Liu ZM，Ding F，Guo MZ，et al.Downregulation of retinoic acid receptor-beta(2)expression is linked to aberrant methylation in esophageal squamous cell carcinoma cell lines［J］.World J Gastroenterol，2004，10(6):771-775.

［24］Lee E，Lee BB，Ko E，et al.Cohypermethylation of p14 in combination with cadm1 or dcc as a recurrence-related prognostic indicator in stage i esophageal squamous cell carcinoma［J］.Cancer，2013，119(9):1752-1760.

［25］Wang CC，Mao WM，Ling ZQ.DNA methylation status of rarbeta2 and p16(ink4alpha)in peripheral blood and tumor tissue in patients with esophageal squamous cell carcinoma ［J］.Zhonghua Zhong Liu Za Zhi，2012，34(6):441-445.王長春，毛偉敏，凌志強(qiáng).維甲酸受體β2和p16ink4α基因甲基化在食管鱗癌患者腫瘤組織和外周血中的表達(dá)［J］.中華腫瘤雜志，2012，34(6):441-445.

［26］Ohta M，Inoue H，Cotticelli MG，et al.The fhit gene，spanning the chromosome 3p14.2 fragile site and renal carcinoma-associated t(3;8)breakpoint，is abnormal in digestive tract cancers ［J］.Cell，1996，84(4):587-597.

［27］Li B，Wang B，Niu LJ，et al.Hypermethylation of multiple tumor-related genes associated with dnmt3b up-regulation served as a biomarker for early diagnosis of esophageal squamous cell carcinoma［J］.Epigenetics，2011，6(3):307-316.

［28］Lee EJ，Lee BB，Kim JW，et al.Aberrant methylation of fragile histidine triad gene is associated with poor prognosis in early stage esophageal squamous cell carcinoma ［J］.Eur J Cancer，2006，42(7):972-980.

［29］Soma T，Kaganoi J，Kawabe A，et al.Nicotine induces the fragile histidine triad methylation in human esophageal squamous epithelial cells［J］.Int J Cancer，2006，119(5):1023-1027.

［30］Noguchi T，Takeno S，Kimura Y，et al.Fhit expression and hypermethylation in esophageal squamous cell carcinoma［J］.Int J Mol Med，2003，11(4):441-447.

［31］Nie Y，Liao J，Zhao X，et al.Detection of multiple gene hypermethylation in the development of esophageal squamous cell carcinoma［J］.Carcinogenesis，2002，23(10):1713-1720.

［32］Bialik S，Kimchi A.Dap-kinase as a target for drug design in cancer and diseases associated with accelerated cell death［J］.Semin Cancer Biol，2004，14(4):283-294.

［33］Gozuacik D，Kimchi A.Dapk protein family and cancer［J］.Autophagy，2006，2(2):74-79.

［34］Ling ZQ，Zhao Q，Zhou SL，et al.Msh2 promoter hypermethylation in circulating tumor DNA is a valuable predictor of disease-free survival for patients with esophageal squamous cell carcinoma ［J］.Eur J Surg Oncol，2012，38(4):326-332.

［35］Cottrell SE.Molecular diagnostic applications of DNA methylation technology［J］.Clin Biochem，2004，37(7):595-604.

［36］Jin Z，Zhao Z，Cheng Y，et al.Endoglin promoter hypermethylation identifies a field defect in human primary esophageal cancer［J］.Cancer，2013，119(20):3604-3609.

［37］Guo M，Ren J，Brock MV，et al.Promoter methylation of hin-1 in the progression to esophageal squamous cancer ［J］.Epigenetics，2008，3(6):336-341.

［38］Jia Y，Yang Y，Zhan Q，et al.Inhibition of sox17 by microrna 141 and methylation activates the wnt signaling pathway in esophageal cancer［J］.J Mol Diagn，2012，14(6):577-585.

［39］Jin Z，Olaru A，Yang J，et al.Hypermethylation of tachykinin-1 is a potential biomarker in human esophageal cancer［J］.Clin Cancer Res，2007，13(21):6293-6300.

［40］Zhao R，Casson AG.Epigenetic aberrations and targeted epigenetic therapy of esophageal cancer［J］.Curr Cancer Drug Targets，2008，8(6):509-521.

［41］Kaminskas E，F(xiàn)arrell AT，Wang YC，et al.Fda drug approval summary:Azacitidine(5-azacytidine，vidaza)for injectable suspension ［J］.The Oncologist，2005，10(3):176-182.

［42］Kristensen LS，Nielsen HM，Hansen LL.Epigenetics and cancer treatment［J］.Eur J Pharmacol，2009，625(1-3):131-142.

［43］Liu Z，Zhang L，Ding F，et al.5-aza-2＇-deoxycytidine induces retinoic acid receptor-beta(2)demethylation and growth inhibition in esophageal squamous carcinoma cells ［J］.Cancer Lett，2005，230(2):271-283.