肖 璜，馬仕洪，崔 強，胡昌勤*

(1.中國食品藥品檢定研究院，北京 100050;2.華瑞制藥有限公司，江蘇 無錫 214092)

世界各地每年都有因滅菌不徹底造成的感染事件的報道。因此，國內(nèi)外對于滅菌監(jiān)測都給予了高度重視并制定相應(yīng)的法規(guī)進行支持保障［1］。滅菌監(jiān)測主要有3種形式:物理監(jiān)測、化學(xué)監(jiān)測和生物監(jiān)測。物理監(jiān)測通過對時間、溫度、壓力等物理參數(shù)進行測量，能夠確認滅菌工藝運行狀態(tài)是否符合設(shè)定要求，可估測滅菌工藝對微生物的致死性［2］?；瘜W(xué)監(jiān)測是使用某些熱敏化學(xué)物質(zhì)配成印墨后印制成指示劑，通過其顏色改變反映所經(jīng)歷的溫濕度及壓力變化［3］，從而反映被滅菌器物是否經(jīng)歷設(shè)定的滅菌過程。生物監(jiān)測是通過標(biāo)準(zhǔn)化的菌株和合乎要求的抗性來考察微生物的殺滅情況，直接體現(xiàn)了整個滅菌過程是否達到需求，被認為是滅菌效果成功與否的最終判定［4］。本文對生物監(jiān)測所使用的生物指示劑進行分析綜述。

1 生物指示劑的研究歷史

19世紀(jì)末，一名英國醫(yī)生報告了使用雞蛋作為生物指示劑進行滅菌效果判定的案例，主要是通過雞蛋的凝固來判定滅菌效果，雖然這種方法較為粗糙且可靠性存在問題，但首次從概念上引入了生物指示劑，使人們開始意識到需要開展滅菌監(jiān)測活動。因為嗜熱脂肪芽胞桿菌所產(chǎn)芽胞無致病性、無熱原、無毒，且對壓力蒸汽的抗性強于大多數(shù)微生物［5］，美國國立衛(wèi)生研究院(National Institutes of Health，NIH)于1955年開始使用它來制備生物指示劑。生物指示劑的商品化則是從1957年一家美國公司在芝加哥的全美醫(yī)院協(xié)會上推薦使用開始。

2 生物指示劑的應(yīng)用現(xiàn)狀

衛(wèi)生醫(yī)療領(lǐng)域?qū)θ揪锲凡捎眠^度殺滅的滅菌方法，而某些熱穩(wěn)定性較低產(chǎn)品則需按產(chǎn)品特性經(jīng)過完備的滅菌工藝開發(fā)和確認環(huán)節(jié)后才能確定其滅菌工藝。由于能夠直觀反應(yīng)微生物在經(jīng)歷滅菌過程后的存活程度，生物指示劑的應(yīng)用并不局限于滅菌監(jiān)測，還能夠應(yīng)用在程序開發(fā)中的關(guān)鍵參數(shù)設(shè)定、系統(tǒng)適應(yīng)性實驗、變更控制等環(huán)節(jié)［6-7］。目前國內(nèi)已經(jīng)開始探索應(yīng)用生物指示劑驗證滅菌工藝。

3 生物指示劑的類型劃分

美國藥典(The United States Pharmacopeia，USP)將生物指示劑分為3類:①由微生物孢子和載體(可能是碟狀或條狀的濾紙、玻璃、塑料以及其他材料的)包裝而成的第一類生物指示劑;②由可接種在產(chǎn)品表面或內(nèi)部的孢子懸液構(gòu)成的第二類生物指示劑;③將微生物恢復(fù)的生長培養(yǎng)基包含其中的第三類生物指示劑，也稱為自含式生物指示劑［8］。

市場上有標(biāo)準(zhǔn)推薦的相關(guān)菌株銷售，開展工作時基于經(jīng)濟因素考慮，有部分用戶自行制備第一類或第二類生物指示劑，但操作的不便利性(需要無菌以及轉(zhuǎn)種等技術(shù))使得更多的用戶選擇使用第三類生物指示劑。相比于前2種指示劑，第三類生物指示劑具有不需自配培養(yǎng)液、取材簡單不易造成二次污染、培養(yǎng)結(jié)果明顯、生物檢測合格率高的優(yōu)點［9］，但需要觀測24～48 h才能得到最終結(jié)果。為了提高使用快捷性，市場上出現(xiàn)了快速生物指示劑?；谘堪L初始階段某類酶的激活可促使非熒光基質(zhì)轉(zhuǎn)化為熒光物質(zhì)的原理［10］，快速生物指示劑能夠?qū)z測時長縮短至幾個小時，也有人將其作為第四類生物指示劑。

4 菌株使用

目前，嗜熱脂肪芽胞桿菌被各國藥典作為熱力滅菌生物指示劑的標(biāo)準(zhǔn)菌株收錄且被大規(guī)模商品化使用。其他耐熱芽胞菌，如生孢梭菌等也被報道用于濕熱滅菌工藝的驗證［6］。芽胞形成階段所產(chǎn)生的名為吡啶二羧酸的特殊物質(zhì)與DNA以及細胞內(nèi)的酶形成復(fù)合物，使得處于惡劣環(huán)境的芽胞休眠存活［11］。因此，推薦菌株多采用芽胞類細菌。近年出現(xiàn)了其他暴露條件(VHP)下非芽胞類細菌抗性更高的相關(guān)報道［12］，但在濕熱滅菌條件下，芽胞類細菌作為生物指示劑仍是標(biāo)準(zhǔn)化的選擇。

5 考察因素

生物指示劑有2項主要性能:孢子數(shù)量和以D值表征的對滅菌工藝的抗性。

5.1 孢子數(shù)量

滅菌是指殺滅微生物的過程。微生物存活概率(也稱無菌保證水平，Sterility Assurance Level，SAL)常常被用來評價醫(yī)療產(chǎn)品的滅菌程度。各國藥典均對滅菌制劑進行了量化描述:SAL≤10－6，即經(jīng)滅菌后產(chǎn)品中污染微生物存活概率不大于百萬分之一。目前商品化濕熱滅菌用生物指示劑的孢子數(shù)量基本控制在106的數(shù)量級。2010年版中國藥典中規(guī)定“對滅菌手段耐受性差的產(chǎn)品，設(shè)計滅菌程序時，根據(jù)經(jīng)驗預(yù)計在該生產(chǎn)工藝中產(chǎn)品微生物污染的水平，選擇生物指示劑的菌種和孢子數(shù)量”。由于孢子數(shù)量是衡量滅菌工藝生物殺滅力的重要參數(shù)，故需事先確定其適用性，方可應(yīng)用于產(chǎn)品滅菌工藝的開發(fā)和驗證。

孢子數(shù)量同時是基于商品化產(chǎn)品穩(wěn)定性考察所需要嚴格控制的內(nèi)容，USP要求生物指示劑生產(chǎn)廠家應(yīng)能提供效期內(nèi)的微生物總數(shù)數(shù)值;生物指示劑使用者在應(yīng)用前能夠?qū)γ渴褂脝挝坏钠骄鋽?shù)進行測定［8］。然而國內(nèi)市場上某些商品化產(chǎn)品在效期內(nèi)的微生物總數(shù)不能達到其標(biāo)稱。

5.2 D 值

5.2.1 D值的影響因素 D值是生物指示劑需要考察的關(guān)鍵因素。D值定義為在規(guī)定的暴露條件下，滅活90%的試驗菌所需的時間或輻射劑量［13］，它是微生物對于暴露損傷抵抗力強弱最直接的表征。D值的影響因素較多，在制備形成階段，各種營養(yǎng)成分往往對微生物自身的D值產(chǎn)生影響［14-15］;在應(yīng)用過程中，生物指示劑 D值受到外部因素影響，例如第一類生物指示劑中菌片的外包裝材料［16］、第二類生物指示劑中孢子懸液所加入的各種介質(zhì)［17］和第三類生物指示劑整體包裝材質(zhì)。

5.2.2 D值的測定 D值的測定可采用2種方法，一是直接計數(shù)法，二是部分陰性法［13］。前者需使用不同的暴露時間下存活芽胞數(shù)的對數(shù)值做回歸方程;后者需統(tǒng)計不同暴露時間的存活或死亡樣本數(shù)，選擇不同統(tǒng)計公式計算。無論采用哪種方法，都需要進行平行樣本的測定。但傳統(tǒng)的滅菌器由于腔體內(nèi)存在冷點和升降溫過程每個循環(huán)不同，樣本的平行性難以保證。因此，D值測定需使用專門的儀器——抗力儀或油浴裝置［18］。不同于普通的滅菌器，抗力儀是被設(shè)計用于建立精確的、可復(fù)現(xiàn)的滅菌環(huán)境的測試設(shè)備。由于其對于準(zhǔn)確測量、精確控制及快速變化速率的要求，已經(jīng)接近商用過程控制和校準(zhǔn)儀器準(zhǔn)確度的極限［19］。目前，國內(nèi)已能夠自主研發(fā)和生產(chǎn)應(yīng)用于濕熱滅菌的抗力儀。

USP要求生物指示劑生產(chǎn)廠家應(yīng)能提供包括D值、D值測定方法等相關(guān)信息;生物指示劑使用者在應(yīng)用前能夠?qū)ι镏甘緞〥值進行評估［8］。然而，國內(nèi)生產(chǎn)廠家所提供的D值僅為使用菌株的參考D值而非測量值，而使用方也往往不能對D值進行評估。出現(xiàn)了使用中基于化學(xué)監(jiān)測發(fā)現(xiàn)滅菌程序異常而生物監(jiān)測并未發(fā)現(xiàn)問題的相關(guān)報道［20］，從側(cè)面佐證了目前某些商品化生物指示劑產(chǎn)品的質(zhì)量存在著問題。

6 結(jié) 語

目前，在生物指示劑制備、銷售、使用整體環(huán)節(jié)中，針對產(chǎn)品評估尤其是D值的測定與評估存在技術(shù)領(lǐng)域上的空白，可以由第三方提供相關(guān)服務(wù)進行彌補，最終銜接完善整體環(huán)節(jié)。同時，應(yīng)加大對生物指示劑的探索和開發(fā)力度，實現(xiàn)生物指示劑在滅菌工藝驗證的整體流程中應(yīng)用。

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