于廣金 張博 楊?yuàn)?張?jiān)?任天瑞

上海師范大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院（上海 200234）

上海師范大學(xué)資源化學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（上海200234）

技術(shù)進(jìn)步

氟蟲腈為配基的親和介質(zhì)制備及魚類GABA受體純化

于廣金 張博 楊?yuàn)?張?jiān)?任天瑞

上海師范大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院（上海 200234）

上海師范大學(xué)資源化學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（上海200234）

以瓊脂糖凝膠（Sepharose）CL-6B為載體，衍生化的氟蟲腈為親和配基，制備親和層析介質(zhì)，對(duì)其進(jìn)行FT-IR和XPS表征。用制備的親和層析介質(zhì)分離魚類腦組織中的GABA（γ-氨基丁酸）受體，研究分離蛋白質(zhì)的效率。結(jié)果表明，成功將氟蟲腈作為配體偶聯(lián)到親和介質(zhì)上，偶聯(lián)量為36.68 μmol/g膠；SDS－聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）顯示兩條蛋白質(zhì)條帶，其相對(duì)分子質(zhì)量約為44 kD和55 kD。

GABA受體氟蟲腈親和層析

γ-氨基丁酸（gama-aminobutyric acid,GABA）受體是昆蟲和哺乳動(dòng)物神經(jīng)系統(tǒng)中主要的抑制性神經(jīng)遞質(zhì)受體[1-2]，它不僅是氟蟲腈、阿維菌素和林丹等殺蟲劑的作用靶標(biāo)[3-4]，還與人的癲癇、精神分裂癥、失眠、帕金森綜合癥等神經(jīng)性疾病密切相關(guān)[5-8]。因此，分離純化GABA受體并研究其立體結(jié)構(gòu)具有重要的科學(xué)意義。

親和層析技術(shù)具有高收率、高純度并能保持生物大分子的天然狀態(tài)等優(yōu)點(diǎn)，廣泛應(yīng)用于生物大分子的分離純化。親和配基是親和色譜中最為關(guān)鍵的分子識(shí)別部分。親和配基的選擇與篩選是發(fā)展新的親和色譜填料或構(gòu)建一個(gè)新的親和色譜體系所必須解決的首要問(wèn)題。Sigel[9]、Sawyer[10]、Gavish[11]等用Ro7-1986/1作為親和配基，從牛腦中成功分離出GABA/苯二氮卓受體復(fù)合物，純化倍數(shù)分別為200倍、150～200倍、200倍。Taguchi等[12]用1012-S作為親和配基，從大鼠腦中分離得到GABA/苯二氮卓受體復(fù)合物，蛋白回收率為33.4%，純化倍數(shù)為60倍。Martini等[13]以地洛西泮作為親和配基，純化得到大鼠腦中的苯二氮卓受體，蛋白回收率為40%～50%，純化倍數(shù)達(dá)5200倍。

氟蟲腈作為一種芳基吡唑類殺蟲劑，其作用機(jī)理是抑制GABA受體氯離子通道，但對(duì)蜜蜂和魚類具有高毒性。本課題選用氟蟲腈作為配基制備親和層析柱，并從魚腦中分離純化GABA受體蛋白，對(duì)研究氟蟲腈與GABA受體蛋白的相互作用，探索氟蟲腈對(duì)魚類的毒性機(jī)理具有重要意義。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 試劑與儀器

試劑：氟蟲腈，江蘇優(yōu)士化學(xué)有限公司；瓊脂糖凝膠（Sepharose）CL－6B，北京鼎國(guó)生物制品有限公司；4－二甲氨基吡啶（DMAP)、四丁基溴化銨（TBAB）、N,N－二甲基甲酰胺（DMF）、溴乙酰溴，均為分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；l,4－丁二醇二縮水甘油醚、蔗糖、醋酸鎂、Triton X-100、磷酸鉀（K3PO4）、牛血清蛋白（BSA）、蛋白質(zhì)標(biāo)記物，上海生工生化有限公司；鳙魚，購(gòu)于當(dāng)?shù)厥袌?chǎng)；超純水、氟西泮，實(shí)驗(yàn)室自制。

儀器：Nicolet 6700傅里葉變換紅外光譜儀，美國(guó)ThermoFisher公司；TU 21201型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)，北京普析通用儀器設(shè)備有限公司；S-4800場(chǎng)發(fā)射掃描電鏡，日本日立公司；PHI-5000 Versaprobe II X射線光電子能譜儀（XPS），日本ULVAC-PHI公司；LC-10P高效液相色譜輸液泵，大連江申分離科學(xué)技術(shù)公司；L-80XP超速離心機(jī)，美國(guó)Beckman公司；24-DN制膠器、DYY-3C電泳儀，北京六一儀器廠；WD-9413B凝膠成像分析儀、層析系統(tǒng)，上海滬西分析儀器廠；超濾管，美國(guó)Millipore公司；優(yōu)普超純水制造系統(tǒng)，成都超純科技有限公司。

1.2 氟蟲腈親和配基的合成[14-16]

氟蟲腈親和配基的合成過(guò)程如圖1所示。

圖1 氟蟲腈親和配體的合成路線

中間產(chǎn)物1的合成：向100 mL三口燒瓶中加入4.40 g（10 mmol）氟蟲腈和30 mLCH2Cl2，在冰浴和氮?dú)獗Ｗo(hù)下加入1.2 g DMAP和4 mL三乙胺，攪拌30 min后，滴加溴乙酰溴4 mL（約46 mmol），室溫下反應(yīng)8 h。將反應(yīng)液倒入40 mL冰水中，用CH2Cl2（20 mL×3）萃取，合并有機(jī)相，無(wú)水MgSO4干燥過(guò)夜，減壓脫溶，經(jīng)硅膠層析分離［石油醚∶乙酸乙酯＝8∶1（體積比）］得到淡黃色固體1，產(chǎn)率為70%，m.p.（熔點(diǎn)）為167～169℃；1H NMR(CDCl3，600 MHz)，δ: 9.22(s,1H,NH)，7.73～7.80(s,2H,Ar-H)，4.11～4.12(s,2H, CH2)。

中間產(chǎn)物2的合成：向100 mL三口燒瓶中加入2.32 g（0.004 mol）中間產(chǎn)物1、7.4 g（0.04 mol）鄰苯二甲酰亞胺鉀鹽、0.8 g TBAB及40 mL DMF，80℃下反應(yīng)6 h。將反應(yīng)液倒入40 mL冰水中,用CH2Cl2（20 mL×3）萃取，合并有機(jī)相，無(wú)水MgSO4干燥過(guò)夜，減壓脫溶，得中間產(chǎn)物2，產(chǎn)率為65%。

目標(biāo)產(chǎn)物3（親和配基）的合成：向100 mL三口燒瓶中加入26.23 g（0.01 mol）中間產(chǎn)物和30 mL乙醇，70℃下滴加1.18 g（0.02 mol）85%水合肼，滴加完畢后70℃下反應(yīng)5 h。將反應(yīng)液降溫至室溫，用乙醚（30 mL×3）萃取，合并有機(jī)相，用飽和食鹽水洗至中性，無(wú)水Na2SO4干燥，減壓脫溶，經(jīng)硅膠層析分離［石油醚∶乙酸乙酯＝6∶1（體積比）］得目標(biāo)產(chǎn)物3，產(chǎn)率為40%，m.p.為197～199℃。1H NMR(600 MHz,CDCl3)，δ:8.41(1H,s,NH)，7.72～7.70(2H,d,Ar-H/ H’)，3.10(2H,s,CH2)，2.81(2H,s,NH2)。

1.3 瓊脂糖凝膠CL-6B環(huán)氧活化

取20 mL瓊脂糖凝膠CL-6B基質(zhì)，在砂芯漏斗中用大量去離子水沖洗、抽干，轉(zhuǎn)移至250 mL帶塞磨口錐形瓶中，依次加入20 mL濃度為0.6 mol/L的NaOH溶液（含2 g/L NaBH4），20 mL 1,4－丁二醇二縮水甘油醚，30℃下在恒溫振蕩器中反應(yīng)8 h。基質(zhì)依次用20%乙醇、去離子水和20%乙醇洗滌，最后用大量去離子水洗滌后，于20%乙醇溶液中保存。

1.4 氟蟲腈親和配基與活化瓊脂糖凝膠CL-6B的偶聯(lián)

氟蟲腈親和配基與環(huán)氧活化瓊脂糖凝膠CL-6B偶聯(lián)反應(yīng)過(guò)程如圖2所示。具體過(guò)程如下：取環(huán)氧活化瓊脂糖凝膠CL-6B 30 mL，在砂芯漏斗中用大量去離子水沖洗、抽干，轉(zhuǎn)移到250 mL帶塞磨口錐形瓶中。在錐形瓶中依次加入氟蟲腈親和配基、40 mL(pH=9.0)濃度為0.1 mol/L的碳酸鈉緩沖液和10 mL DMSO，37℃下在恒溫振蕩器中反應(yīng)12 h。將料液轉(zhuǎn)移至砂芯漏斗中，去離子水淋洗至無(wú)配基檢出，抽干，留取淋洗液備用。

圖2 氟蟲腈親和配體對(duì)瓊脂糖凝膠的修飾過(guò)程

在抽干的凝膠中加入1 mol/L乙醇胺，37℃振蕩反應(yīng)4 h；凝膠依次用去離子水、0.1 mol/L(pH=4.0)的乙酸-乙酸鈉緩沖液（含0.5 mol/L NaCl）、去離子水和0.1 mol/L(pH=8.5)的硼酸-四硼酸鈉緩沖液（含0.5 mol/L NaCl）洗滌，去離子水洗后抽干，于4℃下20%乙醇中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 環(huán)氧基及配體偶聯(lián)密度的測(cè)定

活化載體上的環(huán)氧基測(cè)定采用Na2S2O3滴定法[17]。

配體偶聯(lián)密度采用分光光度法測(cè)定，收集淋洗液并定容，用紫外光譜測(cè)定淋洗液在279 nm處的吸光度，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上得到未偶聯(lián)配基的濃度即可計(jì)算出配體的偶聯(lián)密度。

1.6 鳙魚腦內(nèi)GABA受體的純化

采用Sigel[9]的方法得到鳙魚腦內(nèi)含GABA受體蛋白粗提液。將氟蟲腈親和層析介質(zhì)裝入層析柱（1.0 cm×10 cm），用100 mL緩沖溶液A［pH=7.5，含10 mmol K3PO4、2 mmol醋酸鎂、50 mmol KCl、蔗糖（質(zhì)量濃度為11 mg/mL）、1 mmol EGTA、Triton X-100（質(zhì)量濃度為0.3 mg/mL）］平衡后，將鳙魚腦內(nèi)含GABA受體蛋白粗提液加入柱中孵育15 min；使用緩沖溶液B［pH=7.5，含0.02 mmol K3PO4、蔗糖（質(zhì)量濃度為11 mg/mL）、2 mmol醋酸鎂、Triton X-100（質(zhì)量濃度為0.3 mg/mL）］進(jìn)行沖洗，設(shè)定流速為40 mL/h，洗出雜蛋白；使用緩沖溶液C［pH=7.5，含0.01 mmol K3PO4、10 mmol氟西泮、蔗糖（質(zhì)量濃度為11 mg/mL）、2 mmol醋酸鎂、Triton X-100（質(zhì)量濃度為0.3 mg/mL）］洗脫，流速為20 mL/h，洗出目的蛋白。

2 結(jié)果與討論

2.1 親和層析介質(zhì)的表征

2.1.1 親和層析介質(zhì)化學(xué)組成分析

圖3為樣品的XPS元素全譜掃描分析圖譜，其中(a)和(b)分別為瓊脂糖CL-6B和偶聯(lián)氟蟲腈后的親和介質(zhì)。由(a)中出現(xiàn)C1s、O1s、N1s、S2p，定量分析結(jié)果為C 37.74%、O 61.53%、N 0.53%和S 0.19%，可看出C和O為主要組成元素。(b)中元素定量分析的結(jié)果為C 37.55%、O 58.33%、N 2.37%、S 0.41%和F 1.33%。比較(a)和(b)可知，(b)中出現(xiàn)了F的峰，且元素含量為1.84%，同時(shí)N和S元素的含量大量增加。由以上分析可知，氟蟲腈親和配基已經(jīng)成功偶聯(lián)到瓊脂糖CL-6B上。

2.1.2 親和層析介質(zhì)的紅外分析

圖4為瓊脂糖CL-6B(a)和偶聯(lián)氟蟲腈后的親和介質(zhì)(b)的紅外分析圖譜。比較曲線(a)和(b)可看出，曲線(b)中增加了1650 cm-1處的—CONH—羰基峰、3 400 cm-1處的—NH—峰以及2 230 cm-1處的—CN峰等一系列氟蟲腈衍生物的特征峰，這與XPS元素全譜掃描分析一致，均證明氟蟲腈親和配基已成功偶聯(lián)到瓊脂糖CL-6B上。

2.1.3 環(huán)氧基修飾密度和親和氟蟲腈配基偶聯(lián)密度分析

Na2S2O3滴定法測(cè)定出瓊脂糖凝膠上環(huán)氧基平均修飾密度為68.65 μmol/g膠；紫外分光光度法測(cè)出氟蟲腈親和配基的偶聯(lián)密度為36.68 μmol/g膠。

2.2 氟蟲腈親和層析柱對(duì)鳙魚腦內(nèi)GABA受體的純化

2.2.1 GABA受體親和層析

利用氟蟲腈親和層析柱分離純化鳙魚腦內(nèi)含GABA受體蛋白粗提液時(shí)（見(jiàn)圖5），在1～2 h時(shí)間段，表示使用緩沖溶液B洗脫下的大峰為雜蛋白。在2.5～3.5 h時(shí)間段,表示使用含氟西泮的緩沖溶液C洗脫下的小峰為GABA受體。

2.2.2 蛋白質(zhì)分子量分析

圖6為GABA受體蛋白粗提液和經(jīng)氟蟲腈親和柱純化的受體蛋白的SDS-PAGE圖。由條帶A可看出粗提蛋白中有很多條帶分布，說(shuō)明粗提物中含有很多雜蛋白；而經(jīng)氟蟲腈親和柱純化的受體蛋白只有兩個(gè)條帶，其分子量分別為44 kD和55 kD。Johannes等[18]于1987年發(fā)現(xiàn)肺魚GABA受體其中一個(gè)亞基的分子量為47 kD,早期報(bào)道中所述的GABA受體各亞基分子量在50 kD左右[19-20]，Taguchi等[12]的實(shí)驗(yàn)證實(shí)了魚的兩個(gè)GABA受體亞基，分別是55 kD的β亞基和47 kD的α亞基。綜上分析可知，本實(shí)驗(yàn)得到的55 kD的條帶可能是鳙魚GABA受體的β亞基，44 kD的條帶可能是鳙魚GABA受體的α亞基。由圖6（b）也可看出，在相同上樣量的前提下，使用氟蟲腈衍生物親和層介質(zhì)得到的GABA受體條帶比Taguchi實(shí)驗(yàn)中所得到的條帶更寬，顏色更深，說(shuō)明氟蟲腈對(duì)魚類GABA受體的親和力較氟硝西泮強(qiáng)，間接說(shuō)明氟蟲腈對(duì)魚類具有較強(qiáng)的毒害性。

圖4 瓊脂糖CL-6B(a)和偶聯(lián)氟蟲腈后的親和介質(zhì)(b)的紅外分析圖譜

圖5 氟蟲腈親和層析柱對(duì)鳙魚腦內(nèi)GABA受體蛋白的分離純化

圖6 鳙魚GABA受體蛋白粗提液(a)和經(jīng)氟蟲腈親和柱純化的受體蛋白(b)的SDS-PAGE圖

2.2.3 氟蟲腈親和柱對(duì)鳙魚GABA受體分離純化效果評(píng)價(jià)

氟蟲腈親和層析柱對(duì)鳙魚GABA受體的各步分離純化效果評(píng)價(jià)見(jiàn)表1。由表1可知，經(jīng)過(guò)氟蟲腈親和層析這一純化步驟，蛋白質(zhì)回收率為3.27%。

表1 鳙魚腦內(nèi)GABA受體蛋白的純化率

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)將氟蟲腈偶聯(lián)到瓊脂糖凝膠上，得到了以氟蟲腈為配基的親和層析介質(zhì)，偶聯(lián)到瓊脂糖凝膠上的氟蟲腈密度為36.68 μmol/g膠。首次利用氟蟲腈衍生物修飾的親和層析柱分離純化得到鳙魚腦內(nèi)的GABA受體。其SDS-PAGE圖顯示兩個(gè)條帶，分子量分別為44 kD和55 kD。利用該親和層析介質(zhì)對(duì)鳙魚腦內(nèi)GABA受體蛋白進(jìn)行分離純化是有效的，其蛋白回收率為3.27%。

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Preparation of Affinity Medium with Fipronil Ligand
and Its Application in Purification of Fish GABA Receptors

Yu Guangjin Zhang Bo Yang Shan Zhang Yuan Ren Tianrui

Prepared the affinity chromatography medium with Sepharose CL-6B as affinity matrix and fipronil derivatives as affinity ligands,and characterized it with FT-IR and XPS.Separated and purified the GABA receptor in fish brain tissues with the affinity chromatography medium and evaluated the separation efficiency of protein.The results showed that the fipronil derivatives were successfully conjugated to the matrix,the conjugation amount was 36.68 μmol on one gram of Sepharose CL-6B.The SDS-PAGE showed two protein bands,the relative molecular weight was 44 kD and 55 kD respectively.

GABA;Receptor;Fipronil;Affinity chromatography

TQ450.1+1

2014年3月

陶氏攜領(lǐng)先光熱發(fā)電流體解決方案亮相2014中國(guó)光熱發(fā)電高峰論壇

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（21172147）；國(guó)家科技支撐基金資助項(xiàng)目（2011BAE0CL-6B06-4）；上海市科委基金資助項(xiàng)目（11ZR1426800）

于廣金男1987年生高分子化學(xué)與物理專業(yè)在讀碩士研究生

陶氏化學(xué)參加2014中國(guó)光熱發(fā)電高峰論壇活動(dòng)，為中國(guó)太陽(yáng)能產(chǎn)業(yè)發(fā)展提供持續(xù)支持。作為本次峰會(huì)的贊助商之一，陶氏化學(xué)集中展示了面向光熱發(fā)電（CSP）行業(yè)推出的各類創(chuàng)新型解決方案，其中包括全球領(lǐng)先的DOWTHERMTMA高溫導(dǎo)熱流體（HTTF），該產(chǎn)品已成功應(yīng)用于超過(guò)35個(gè)世界級(jí)的大型CSP項(xiàng)目。