張艷霞，劉 虞，蔡夢(mèng)思，單琳琳，高建芳

（杭州師范大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，浙江 杭州310036）

蛇毒是多種酶類(lèi)和非酶類(lèi)蛋白的混合物，包括絲氨酸蛋白酶、金屬蛋白酶、L 氨基酸氧化酶、磷脂酶A2、去整合素和半胱氨酸富集蛋白等，有助于毒蛇捕殺和輔助消化獵物［1］.毒蛇咬傷會(huì)導(dǎo)致患者呼吸衰竭、組織壞死、腎衰竭和凝血系統(tǒng)障礙等多種臨床癥狀，是危害人類(lèi)健康的世界性問(wèn)題和重要急癥之一.統(tǒng)計(jì)顯示，全世界每年約有180萬(wàn)人被毒蛇咬傷，其中約9.4萬(wàn)人死亡.亞洲地區(qū)毒蛇資源豐富，蛇傷危害尤為嚴(yán)重，每年約有120萬(wàn)人中毒，導(dǎo)致約5.8萬(wàn)人死亡［2］，大部分致傷事件是由眼鏡蛇科和蝰科毒蛇造成的［3］.在中國(guó)，毒蛇致傷事件主要集中于長(zhǎng)江以南省份，其中蝰科毒蛇咬傷率高達(dá)65.7%［4］.據(jù)物種名錄記載，中國(guó)24種蝰科毒蛇，隸屬于8個(gè)屬.蝰科毒蛇分泌的毒液主要含血循毒，對(duì)血液循環(huán)系統(tǒng)的破壞嚴(yán)重，患者中毒后以出血和組織壞死為主要特征［5］.由于蛇毒在體內(nèi)擴(kuò)散較快，因而搶救越及時(shí)越好.臨床上，抗蛇毒血清能及時(shí)、有效地中和蛇毒，被世界公認(rèn)為是治療毒蛇咬傷的最佳藥品［6］.

蛇毒是蛇類(lèi)適應(yīng)進(jìn)化的產(chǎn)物，使毒蛇的捕食方式從單純的機(jī)械手段向化學(xué)手段轉(zhuǎn)變［7］.蛇毒組成與功能的差異備受毒理學(xué)家和爬行動(dòng)物學(xué)家的關(guān)注，迄今為止已在種上和種下水平的研究中取得了大量的進(jìn)展［8-9］.蛇毒種下水平的差異受季節(jié)、地理分布、年齡和性別等多種因素的影響，種上水平的差異主要受分類(lèi)地位差異的影響.一般而言，蛇毒組成的差異常表現(xiàn)為同類(lèi)毒素家族表達(dá)水平的不同，或者有限種毒素的有無(wú)［10］.近年來(lái)，蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)已成為蛇毒差異研究的主流手段，對(duì)種間、亞種間蛇毒組成差異的解析也更加透徹.Calvete等采用RP-HPLC、SDS-PAGE、ESI-MS和MALDI-TOF-MS技術(shù)分析了毒伊蛇（Toxicocalamuslongissimus）和青環(huán)海蛇（Hy drophiscyanocinctus）的蛇毒蛋白組構(gòu)成，發(fā)現(xiàn)兩種蛇毒主要由Ⅰ型磷脂酶A2和三指毒素構(gòu)成；但兩種組分的豐度存在明顯的種間差異，二者在毒伊蛇中分別占6.5%和92%，在青環(huán)海蛇中分別占19%和81%；此外，毒伊蛇毒中含1.4%的PIII-金屬蛋白酶，青環(huán)海蛇毒則不含此組分［11］.Castro等利用相同的蛋白組分析方法結(jié)合生理生化活性檢測(cè)研究了墨西哥響尾蛇（Crotalussimus）3個(gè)亞種蛇毒組成和活性的差異，發(fā)現(xiàn)其中具有神經(jīng)毒性的crotoxin毒素在不同亞種蛇毒中的含量存在顯著差異：Crotalussimussimus最高達(dá)14.3%，Crotalussimustzabcan次之，而Crotalus simuscalminatus幾乎不含這一成分；活性分析進(jìn)一步證實(shí)，組分的差異與C.s.simus具有較高的致死率、肌肉毒性和促凝劑活性相吻合［12］.

研究蛇毒不同水平的差異有助于了解蛇毒的進(jìn)化適應(yīng)意義，對(duì)于蛇傷治療時(shí)抗蛇毒血清的選擇以及抗血清制備策略的完善更具有重要的指導(dǎo)意義.目前，中國(guó)正式上市銷(xiāo)售的僅有抗蝮蛇毒血清和抗五步蛇毒血清可用于治療蝰科毒蛇所致蛇傷［13］.對(duì)于物種資源保有量較高的蝰科物種，其蛇毒與這兩種抗蛇毒血清的臨床前評(píng)估工作已有報(bào)道.早在1981年，蔣克賢等人就用免疫擴(kuò)散與交叉中和反應(yīng)研究了浙江蝮蛇毒抗血清對(duì)不同地理來(lái)源的蝮蛇毒和蝮亞科其它蛇毒之間的免疫關(guān)系，結(jié)果表明1 mg抗蝮蛇毒血清能中和4～5 mg各類(lèi)蝮蛇毒、1 mg五步蛇毒以及1.5 mg烙鐵頭蛇毒和竹葉青蛇毒［14］.宜全等用小鼠實(shí)驗(yàn)檢測(cè)了抗蝮蛇毒血清和抗五步蛇毒血清對(duì)烙鐵頭蛇毒的中和作用，發(fā)現(xiàn)兩種抗血清的中和效價(jià)有顯著差異，但對(duì)烙鐵頭蛇毒中毒小鼠的保護(hù)率不存在差異［15］.鄭穎等分別精制了針對(duì)國(guó)產(chǎn)9種蛇毒的抗血清，并檢測(cè)了其與蛇毒間的免疫交叉反應(yīng)，發(fā)現(xiàn)并非所有抗血清都具有普適性［16］.當(dāng)前，對(duì)蝰科其他毒蛇免疫原性的研究報(bào)道相對(duì)較少，對(duì)于國(guó)產(chǎn)抗蝮蛇毒血清和抗五步蛇毒血清在國(guó)產(chǎn)蝰科毒蛇咬傷臨床治療時(shí)的普適性評(píng)價(jià)仍有待完善.

本研究利用酶聯(lián)免疫吸附檢測(cè)（ELISA）和免疫印跡（western blot）兩種方法，比較了國(guó)產(chǎn)商用抗蝮蛇毒血清和抗五步蛇毒血清對(duì)國(guó)產(chǎn)6種蝰科小型毒蛇（亞洲蝮屬：短尾蝮、烏蘇里蝮和巖棲蝮；山烙鐵頭屬：山烙鐵頭；原矛頭蝮屬：原矛頭蝮；竹葉青屬：竹葉青）毒素的免疫中和能力，旨在探討這兩種抗血清在蛇傷臨床治療時(shí)的適用性.

1 材料與方法

1.1 蛇毒與商用抗血清

在2008-2013年期間，分別采集實(shí)驗(yàn)用短尾蝮（G.brevicaudus）、烏蘇里蝮（G.ussuriensis）、巖棲蝮（G.saxatilis）、竹葉青（T.stejnegeri）、山烙鐵頭（O.monticola）和原矛頭蝮（P.mucrosquamatus）成體，帶回杭州師范大學(xué)兩棲爬行動(dòng)物研究中心，飼養(yǎng)于人工氣候室內(nèi)，定期投飼小白鼠和泥鰍.蛇毒采集前，動(dòng)物禁食1～2周，期間保證足量飲水.隨后用咬膜皿法提取蛇毒，鮮毒經(jīng)10 000 r／min 4 ℃離心10 min去除雜質(zhì)后，真空冷凍干燥，存放于-80 ℃?zhèn)溆?商用抗蝮蛇毒血清和抗五步蛇毒血清購(gòu)自上海賽倫生物技術(shù)有限公司.

1.2 蛋白濃度測(cè)定

以馬免疫球蛋白和牛血清白蛋白作為標(biāo)準(zhǔn)蛋白，用Bradford法分別測(cè)定抗體和蛇毒的蛋白濃度，所有檢測(cè)均重復(fù)3次.

1.3 酶聯(lián)免疫吸附檢測(cè)

將濃度為2μg／m L的6種蛇毒分別包被96孔酶標(biāo)板，每孔100μL，用不含蛇毒的包被液作為對(duì)照，4 ℃包被過(guò)夜，每一反應(yīng)均設(shè)置3個(gè)檢測(cè)孔.用漂洗液洗去未結(jié)合蛇毒，隨后各孔用2%脫脂奶粉在37 ℃封閉1 h.漂洗液洗滌后，每孔加入梯度稀釋的商用抗蛇毒血清（初始質(zhì)量濃度4μg／m L），37 ℃溫育1 h.洗去未結(jié)合抗血清后，各孔加入HRP標(biāo)記的兔抗馬IgG（1∶13 500稀釋?zhuān)?7 ℃溫育1 h.漂洗液洗去未結(jié)合的酶標(biāo)二抗后，各孔加入100μL底物液（含0.5 mg／m L OPD 和0.006% H2O2的0.15 mol／L 檸檬酸鹽緩沖液，p H 5.0），反應(yīng)20 min后加入50μL 2.5 mol／L 的硫酸終止顯色.隨后，用Spectra Max 384酶標(biāo)儀在490 nm 下讀取各孔的吸光值.

1.4 SDS-PAGE和western blot檢測(cè)

蛇毒蛋白用12%分離膠進(jìn)行SDS-PAGE分離.電泳結(jié)束后，用0.1%考馬斯亮藍(lán)染液染色.Western blot檢測(cè)用膠經(jīng)半干轉(zhuǎn)印至PVDF膜（0.45μm）上，隨后用5% 脫脂奶粉4 ℃封閉過(guò)夜.PVDF膜經(jīng)PBS漂洗后，與適量體積的商用抗蛇毒血清（1∶1 000稀釋?zhuān)┰?7 ℃溫育1.5 h.溫育結(jié)束后，用PBS洗去未結(jié)合的抗血清，隨后加入AP標(biāo)記的兔抗馬IgG（1∶2 000稀釋?zhuān)┰?7 ℃結(jié)合1.5 h.洗去未結(jié)合的二抗后，加入底物液（含0.15 mg／m L BCIP和0.3 mg／m L NBT 的0.1 mol／L Tris-HCl p H 9.5緩沖液）避光顯色，最后放入去離子水中終止反應(yīng)，用UMax2100掃描儀記錄顯色結(jié)果，并用Tan4100軟件分析結(jié)果.

2 結(jié)果與分析

2.1 ELISA 檢測(cè)商用抗蛇毒血清對(duì)蛇毒的免疫中和能力

利用ELISA 檢測(cè)兩種商用抗蛇毒血清與6種蛇毒間的免疫反應(yīng)，結(jié)果顯示所有檢測(cè)均呈現(xiàn)顯著的陽(yáng)性效應(yīng)（圖1）.隨著抗蛇毒血清質(zhì)量濃度的升高，交叉反應(yīng)的強(qiáng)度增加.與異物種抗蛇毒血清和蛇毒相比，同物種抗蛇毒血清和蛇毒間的免疫反應(yīng)更為強(qiáng)烈.6種蛇毒與抗蝮蛇毒血清的免疫反應(yīng)顯示，短尾蝮結(jié)合力最強(qiáng)，烏蘇里蝮與巖棲蝮次之，竹葉青、山烙鐵頭和原矛頭蝮結(jié)合力依次減弱，且490 nm 下的OD 吸光值明顯低于前3種蛇（圖1a）.與抗五步蛇毒血清的免疫反應(yīng)顯示，相同質(zhì)量濃度下亞洲蝮屬3種蛇毒的抗體結(jié)合力要比與抗蝮蛇毒血清反應(yīng)時(shí)低，但其結(jié)合力依然比竹葉青、山烙鐵頭和原矛頭蝮強(qiáng)，后3種蛇毒的結(jié)合力減弱趨勢(shì)與抗蝮蛇毒血清反應(yīng)時(shí)相似（圖1b）.無(wú)論使用哪種抗血清作為待檢抗體，亞洲蝮屬3種蛇毒的抗體結(jié)合力都比較相近.

圖1 ELISA檢測(cè)兩種商用抗蛇毒血清與6種蛇毒免疫反應(yīng)Fig.1 Cross-reaction between two commercial antivenoms and six venoms by ELISA

2.2 Western blot檢測(cè)商用抗蛇毒血清對(duì)蛇毒的免疫中和能力

6種蛇毒蛋白SDS-PAGE 結(jié)果顯示，短尾蝮、烏蘇里蝮和巖棲蝮蛇毒的分子量分布相近，主要分布在25和45 k Da左右，在14～25 KDa之間分布較少（圖2a）.Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示，兩種商用抗蛇毒血清和6種蛇毒之間存在不同程度的免疫交叉反應(yīng)，且反應(yīng)區(qū)域與蛇毒分子量條帶特征相對(duì)應(yīng)（圖2）.

在抗蝮蛇毒血清檢測(cè)組中，短尾蝮蛇毒蛋白幾乎所有條帶均呈現(xiàn)出免疫原性；巖棲蝮和烏蘇里蝮有少量條帶未能呈現(xiàn)免疫原性，這些條帶主要為巖棲蝮低分子量條帶（約16 k Da）和烏蘇里蝮中分子區(qū)域（約34～36 k Da）.山烙鐵頭蛇毒的中低分子量區(qū)域（約13～40 k Da）多數(shù)條帶未能與抗蝮蛇毒血清發(fā)生免疫反應(yīng)，原矛頭蝮蛇毒的高分子量條帶（約187 k Da）和中低分子量區(qū)域（約25～41，13～22 k Da）也無(wú)法與抗蝮蛇毒血清發(fā)生免疫反應(yīng)，竹葉青蛇毒高分子量區(qū)域（約196 k Da）和低分子量區(qū)域（約17 k Da）同樣有少量條帶不能反應(yīng).在抗五步蛇毒血清檢測(cè)組中，表現(xiàn)出上述類(lèi)似的反應(yīng)性，但短尾蝮、巖棲蝮和烏蘇里蝮蛇毒的反應(yīng)條帶較抗蝮蛇毒血清檢測(cè)組少，短尾蝮蛇毒低分子量區(qū)域甚至有少量條帶未能呈現(xiàn)出免疫原性.Western blot檢測(cè)發(fā)現(xiàn)的蛇毒與抗蛇毒血清之間免疫反應(yīng)強(qiáng)度的變化趨勢(shì)與ELISA 檢測(cè)結(jié)果相一致.蛇毒組分的免疫原性與其豐富度相關(guān)，但未發(fā)現(xiàn)分子量大小與免疫反應(yīng)強(qiáng)度有關(guān).一些蛋白條帶（如短尾蝮蛇毒約20 k Da）在western blot檢測(cè)中發(fā)現(xiàn)具有高的免疫原性，但在SDS-PAGE圖譜中的含量較少；另一些蛋白條帶（如竹葉青蛇毒約17 k Da、原矛頭蝮蛇毒約15和18 k D）在SDS-PAGE 圖譜中的含量較為豐富，但western blot卻未能檢測(cè)到其免疫原性.在所有抗蛇毒血清與蛇毒反應(yīng)中，同物種來(lái)源的抗蛇毒血清與蛇毒間呈現(xiàn)最大的交叉中和效應(yīng)，抗蛇毒血清與同屬蛇毒間的交叉中和效應(yīng)也要高于其與非同屬蛇毒間的效應(yīng).

圖2 Western blot檢測(cè)兩種商用抗蛇毒血清與6種蛇毒免疫反應(yīng)Fig.2 Cross-reaction between two commercial antivenoms and six venoms by western blot

3 討 論

蛇毒與其對(duì)應(yīng)抗蛇毒血清間的免疫反應(yīng)可能與蛇毒組成和含量有關(guān)，但不受分子特征的影響［17］.Dong等也發(fā)現(xiàn)分子大小與免疫反應(yīng)之間沒(méi)有直接關(guān)系［18］.本實(shí)驗(yàn)中，蛇毒組分的免疫原性亦不能通過(guò)SDS-PAGE結(jié)果中顯示的分子大小來(lái)推測(cè)，但大部分組分都能與其對(duì)應(yīng)抗蛇毒血清結(jié)合，且反應(yīng)強(qiáng)度與組分的豐度有關(guān).蛇毒與異種抗蛇毒血清之間的交叉反應(yīng)普遍存在［17-19］.雖然構(gòu)成蝰科蛇毒的蛋白種類(lèi)繁多，但這些蛇毒蛋白僅屬于有限的幾種蛋白家族：酶（絲氨酸蛋白酶、Zn2＋金屬蛋白酶、L-氨基酸氧化酶、磷脂酶A2）和非酶蛋白（解離素、C-型類(lèi)凝集素、利鈉肽、肌毒素、富半胱氨酸分泌蛋白、神經(jīng)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子、胱抑素、kunits型蛋白酶抑制劑）.盡管各蛋白家族成員的藥理特性不同，但是相同蛋白家族成員有顯著的結(jié)構(gòu)相似性，享有共同抗原決定簇［20］.異種蛇毒既含有特異性抗原，也含有共同抗原，進(jìn)而與抗血清之間表現(xiàn)出免疫交叉現(xiàn)象.

本研究中，低濃度蛇毒與抗蛇毒血清間交叉反應(yīng)弱，但隨著濃度的增加，反應(yīng)也增強(qiáng)（圖1）.所選取的6種蛇同屬蝰科，其中短尾蝮、巖棲蝮和烏蘇里蝮都屬于亞洲蝮屬，ELISA 和western blot的結(jié)果均顯示這3種蛇毒與抗蛇毒血清之間的免疫交叉反應(yīng)強(qiáng)度明顯高于竹葉青、山烙鐵頭和原矛頭蝮，表明在近緣物種間，其蛇毒與抗蛇毒血清間交叉反應(yīng)強(qiáng)度更高，這與蛇毒間具有較多的共同抗原有關(guān).種系發(fā)生和蛇毒組分之間的關(guān)系之前也有文獻(xiàn)報(bào)道［21-22］，然而也有研究顯示出同一屬內(nèi)蛇毒組分的變異［23-24］.最近，Gibbs等對(duì)Sistrurus屬物種的研究發(fā)現(xiàn)，并無(wú)證據(jù)能表明蛇毒變異與種系發(fā)生之間有顯著的相關(guān)性［25］.Sousa等就拉丁美洲矛頭蝮屬6種蛇的種系發(fā)生、蛇毒組成和抗蛇毒血清對(duì)其免疫中和效果進(jìn)行了比較分析，結(jié)果也表明蛇的分類(lèi)地位和蛇毒組成的關(guān)聯(lián)較低［10］，進(jìn)而推測(cè)蛇毒組成的變異應(yīng)受到食性差異的顯著影響.

抗蛇毒血清的生產(chǎn)與使用，需要精確的臨床前實(shí)驗(yàn)及臨床評(píng)估，以保證其有效性和安全性.一系列實(shí)驗(yàn)室方法已經(jīng)被用來(lái)測(cè)定抗蛇毒血清對(duì)某種蛇毒相關(guān)性最高的毒性的中和能力［26］.但從現(xiàn)有的研究結(jié)果看，并不能單純地依據(jù)種屬關(guān)系來(lái)選用和制備抗血清，依據(jù)蛇毒中起主要免疫作用的蛋白家族來(lái)選用抗血清似乎更合理.本實(shí)驗(yàn)中，短尾蝮、巖棲蝮和烏蘇里蝮免疫原性比較接近，可能是其金屬蛋白酶含量比較相近.抗蝮蛇毒血清對(duì)短尾蝮、烏蘇里蝮和巖棲蝮蛇毒的免疫中和效價(jià)要高于抗五步蛇毒血清，在實(shí)際治療這3種毒蛇咬傷時(shí)，應(yīng)優(yōu)先選擇抗蝮蛇毒血清；兩種抗蛇毒血清中和山烙鐵頭、原矛頭蝮和竹葉青蛇毒的能力相近，在實(shí)際治療這3種毒蛇咬傷時(shí)，可隨機(jī)選擇這兩種抗蛇毒血清，另一種途徑是制備這3個(gè)物種針對(duì)性抗蛇毒血清.

綜上，盡管兩種抗蛇毒血清分別由單一蛇毒免疫制備而成，但由于這些蛇毒與近緣物種蛇毒組分的抗原決定簇間具有不同程度的相似性，因此抗血清與異種蛇毒間可以發(fā)生免疫反應(yīng).在國(guó)內(nèi)尚無(wú)針對(duì)上述蝰科所有毒蛇抗蛇毒血清的情況下，本研究對(duì)于臨床治療上述6種毒蛇咬傷時(shí)抗蛇毒血清的選擇無(wú)疑具有重要指導(dǎo)意義，還可為抗蛇毒血清制備策略的完善提供參考.

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