辛德莉 李丹 米佳

1 首都醫(yī)科大學(xué)附屬友誼醫(yī)院北京熱帶病研究所 （北京 100050）

2 北京藍(lán)譜生物科技有限公司 （北京 100081）

與傳統(tǒng)的核酸擴(kuò)增檢測(cè)的方法聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）相比，LAMP?方法具有操作簡(jiǎn)便、靈敏度高、特異性強(qiáng)，反應(yīng)結(jié)果判定簡(jiǎn)單，檢測(cè)成本低等特點(diǎn)。LAMP?方法的檢測(cè)靈敏度高于普通PCR 2～3 個(gè)數(shù)量級(jí)，而且，LAMP?的擴(kuò)增是一個(gè)等溫過(guò)程（60～65?C），擴(kuò)增時(shí)間短（1h），對(duì)設(shè)備的要求簡(jiǎn)單，只需要一個(gè)水浴鍋或恒溫裝置即可完成。LAMP?反應(yīng)結(jié)果的檢測(cè)也很簡(jiǎn)單，不需要像普通PCR 那樣進(jìn)行凝膠電泳，只需要通過(guò)肉眼直接觀察白色渾濁或者綠色熒光即可，是一種簡(jiǎn)便、快捷、適合進(jìn)行臨床及大量樣品的高通量檢測(cè)方法。

LAMP?技術(shù)已在醫(yī)療、動(dòng)植物、水產(chǎn)、食品、環(huán)境領(lǐng)域的病毒、細(xì)菌、寄生蟲(chóng)等方面得到廣泛應(yīng)用，如Yiyue et., al 利用LAMP?技術(shù)快速檢測(cè)H7N9 病毒，靈敏度可達(dá)10 拷貝，具有非常好的特異性[2]。Jianyu et., al 利用環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增法，耐甲氧西林金黃色葡萄球菌的mecA 基因?yàn)榘谢?，特異的檢測(cè)出耐甲氧西林金黃色葡萄球菌的，靈敏度能達(dá)到10 拷貝DNA 或10CFU/反應(yīng)[3]。Jaymin C et., al 采用環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增法特異的檢測(cè)瘧原蟲(chóng)，靈敏度和特異性均與金標(biāo)準(zhǔn)槽式PCR 一致[4]。但是在支原體上的研究較少，李鵬等建立了豬肺炎支原體的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增診斷方法，其靈敏度可達(dá)6 拷貝，且具有很好的特異性[5]。謝秀蘭等建立的羊絲狀支原體簇的快速環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)方法，檢出限為10pg/μl[6]。

肺炎支原體是一種介于病毒和細(xì)菌之間，能獨(dú)立生活的最小微生物，缺乏細(xì)胞壁，呈現(xiàn)出高度多型性，是人類(lèi)支原體肺炎的病原體。肺炎支原體（Mycoplasma pneumonia, MP）是引起支原體肺炎的主要病原體，支原體肺炎約占各種肺炎的10%，已成為發(fā)病率最高的傳染疾病，嚴(yán)重者可導(dǎo)致死亡，潛伏期一般為2～3 周，常見(jiàn)于兒童和青少年，秋冬發(fā)病較多。

圖1. 使用鈣黃綠素檢測(cè)LAMP?反應(yīng)原理圖

支原體肺炎的臨床表現(xiàn)主要為持續(xù)發(fā)熱、咳嗽、咳痰等，臨床表現(xiàn)和胸部X 線檢查并不具特征性，單憑臨床表現(xiàn)和胸部X 線檢查無(wú)法做出診斷，若要明確診斷，需要進(jìn)行肺炎支原體的檢測(cè)。目前，國(guó)內(nèi)肺炎支原體的診斷主要依靠病原體培養(yǎng)、血清學(xué)檢測(cè)和PCR 法。

肺炎支原體培養(yǎng)較困難，存在臨床標(biāo)本中病原體含量較少、呼吸道污染的雜菌較多、耗時(shí)及陽(yáng)性率低等缺點(diǎn)，目前的臨床檢測(cè)中已很少應(yīng)用。血清學(xué)檢查主要有補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)，冷凝集試驗(yàn)，凝集試驗(yàn)和酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）。血清學(xué)技術(shù)主要依靠抗體進(jìn)行檢測(cè)，有明顯的滯后性，且受個(gè)體免疫差異影響較大，檢測(cè)靈敏度和特異性較低。隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，PCR 技術(shù)已在臨床診斷中得到較好應(yīng)用，但也存在靈敏度較低，耗時(shí)較長(zhǎng)，操作較復(fù)雜，對(duì)技術(shù)人員的要求較高，對(duì)設(shè)備的要求較高，無(wú)法實(shí)現(xiàn)基層化及現(xiàn)場(chǎng)化等缺點(diǎn)。

近年來(lái)，支原體肺炎占了小兒肺炎的20%以上，隨著診斷技術(shù)的發(fā)展，其檢出率增高，發(fā)現(xiàn)它也是小兒呼吸道感染的重要病原體，日益得到重視。研究出一種快速、準(zhǔn)確、簡(jiǎn)便的檢測(cè)方法將有助于及時(shí)發(fā)現(xiàn)、及時(shí)治療。

圖3. MP-LAMP? 法特異性實(shí)驗(yàn)結(jié)果

圖4. MP-LAMP? 法靈敏度實(shí)驗(yàn)結(jié)果

本研究將環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)應(yīng)用于肺炎支原體的檢測(cè)中，首先從NCBI 上查找肺炎支原體特異基因序列，使用LAMP?專(zhuān)用引物設(shè)計(jì)（http://primerexplorer.jp/elamp4.0.0/index.html）設(shè)計(jì)多組引物。為了能特異的對(duì)引物進(jìn)行篩選，以及對(duì)引物工作濃度、反應(yīng)時(shí)間進(jìn)行控制，本實(shí)驗(yàn)采用日本榮研LAMP?技術(shù)的專(zhuān)用產(chǎn)品——Loopamp?DNA 擴(kuò)增試劑盒（圖2-A）和Loopamp?實(shí)時(shí)濁度基因快速擴(kuò)增檢測(cè)系統(tǒng)（圖2-B）篩選出最佳引物，將最佳引物進(jìn)行特異性、靈敏度實(shí)驗(yàn)。

將收集的臨床樣本肺炎支原體及解脲支原體、人型支原體、大腸桿菌、陰溝腸桿菌、金黃色葡萄球菌和肺炎可雷白桿菌樣本進(jìn)行特異性實(shí)驗(yàn)，采用MP-LAMP?方法進(jìn)行檢測(cè)，只有肺炎支原體顯示為陽(yáng)性，其他菌均顯示為陰性（圖3），表明MP-LAMP?方法具有較好的特異性。

將定量的MP 質(zhì)粒進(jìn)行10 倍梯度稀釋后（6000copy，600copy，60copy，6copy，0.6copy）作為模板進(jìn)行靈敏度實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，MPLAMP?方法的靈敏度可達(dá)6 拷貝（圖4）。

傳統(tǒng)進(jìn)行肺炎支原體檢測(cè)的方法費(fèi)時(shí)，準(zhǔn)確度、靈敏度較低，容易漏檢或誤檢，而MPLAMP?方法在一個(gè)小時(shí)內(nèi)即可得到結(jié)果，且靈敏度和特異性高，為臨床上快速、準(zhǔn)確診斷肺炎支原體提供可能。

[1] Notomi T，Okayama H，Masubuchi H，et al. Loop-mediated isothermal amplification of DNA［J］.Nucleic Acids Res，2000，28( 12) : e63.

[2] Yiyue Ge, Bin Wu, Xian Qi.et al., Rapid and Sensitive Detection of Novel Avian-Origin Influenza A (H7N9) Virus by Reverse Transcription Loop-Mediated Isothermal Amplification Combined with a Lateral-Flow Device，Pols one，8（8）：e69941

[3] Jianyu Su, Xiaochen Liu, Hemiao Cui, et al., Rapid and simple detection of methicillin resistance staphylococcus aureus by orfX loop-mediated isothermal amplification assay. BMC Biotechnology 2014, 14:8

[4] Jaymin C. Patel, Jenna Oberstaller, Maniphet Xayavong, et al., Real-Time Loop-Mediated Isothermal Amplification (RealAmp) for the Species-Specific Identification of Plasmodium vivax，Pols one，8（1）e54986）

[5] 李鵬，馬艷嬌，于劍等，豬肺炎支原體環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)方法的建立. 中國(guó)生物制品學(xué)雜志，2011，4：21-24.

[6] 謝秀蘭，康曉冬，儲(chǔ)岳峰等，羊絲狀支原體簇環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)方法的建立. 中國(guó)畜牧獸醫(yī)，2012,39（12）