張澤生，孫東，徐夢瑩，田歡，潘季辰

（天津科技大學(xué)，食品工程與生物技術(shù)學(xué)院，天津300457）

銀耳多糖抗氧化作用的研究

張澤生，孫東，徐夢瑩，田歡，潘季辰

（天津科技大學(xué)，食品工程與生物技術(shù)學(xué)院，天津300457）

研究銀耳多糖的抗氧化活性。以銀耳為原料，經(jīng)簡單分離純化，制得銀耳多糖。將ICR小鼠隨機(jī)分為空白對(duì)照組、模型對(duì)照組、銀耳多糖低、中、高劑量組，通過每日皮下注射D-半乳糖建立亞急性衰老小鼠模型，空白對(duì)照組用生理鹽水代替。劑量組小鼠灌胃劑量分別為100、200、400mg/（kg·bw），空白對(duì)照組和模型對(duì)照組用生理鹽水代替，每日一次，持續(xù)八周。測定比較血清、肝臟、腦組織中超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化氫酶（CAT）與谷胱甘肽過氧化物酶（GSHPx）活性、丙二醛（MDA）含量、總抗氧化能力（T-AOC）和皮膚中的羥脯氨酸含量的差異。與模型組相比，銀耳多糖劑量組小鼠血清、肝臟、腦組織中的SOD、CAT、GSH-Px活性和總抗氧化能力顯著增強(qiáng)，MDA含量的異常上升受到明顯抑制，皮膚中的羥脯氨酸含量顯著提高，且以銀耳多糖中、高劑量組的效果更好。銀耳多糖對(duì)D-半乳糖致亞急性衰老小鼠具有較強(qiáng)的抗氧化活性。

銀耳多糖；D-半乳糖；抗衰老；抗氧化

植物性多糖多提取自我國傳統(tǒng)中醫(yī)藥中，因此在諸多方面有著其他生物功能因子不能比擬的優(yōu)勢。其在抗腫瘤、抗病毒、抗炎、抗衰老、抗氧化、抗?jié)?、降血糖[1-9]等方面的積極作用使多糖類物質(zhì)展示了誘人的前景。

目前，已有諸多關(guān)于銀耳多糖抗腫瘤、降血糖、抗氧化等生物活性的研究報(bào)道。進(jìn)一步的體外抗氧化實(shí)驗(yàn)表明，銀耳多糖可以有效的清除某些自由基，例如超氧陰離子自由基（O：2-）和羥自由基（·OH-）[10]，但關(guān)于銀耳多糖體內(nèi)抗氧化研究的報(bào)道卻不多，涉及到的體內(nèi)抗氧化指標(biāo)也較少，因此本研究通過D-半乳糖建立亞急性衰老模型，檢測多個(gè)體內(nèi)抗氧化指標(biāo)，從多個(gè)方面證明銀耳多糖的抗氧化作用，為銀耳多糖的保健功能提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 銀耳多糖溶液的制備

原料購于福建古田縣菌益食品有限公司，粉碎后過200目篩，采用熱水浸提，等電點(diǎn)法除蛋白，濃縮，乙醇沉淀，冷凍干燥得銀耳多糖。用生理鹽水復(fù)溶銀耳多糖干粉，配制成濃度為100、200、400mg/kg的溶液，4℃保存待用。

1.1.2 主要試劑

超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化氫酶（CAT）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）、總抗氧化能力（T-AOC）、丙二醛（MDA）、羥脯氨酸、考馬斯亮蘭蛋白測定試劑盒均購自南京建成生物工程研究所。

1.1.3 主要儀器

MODULYOD-230冷凍干燥機(jī)：Thermo公司；TDL-5-A低速離心機(jī)：上海安亭科學(xué)儀器廠；Z5高速離心機(jī)：SIGMA Germany；QL-901微型漩渦混合器：其林貝爾儀器制造公司；JD1000-2電子天平：沈陽龍騰電子有限公司；BS224S分析天平：北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司；HH.SY11-Ni2恒溫水浴鍋：天津市中環(huán)實(shí)驗(yàn)電爐有限公司；UV1800紫外可見分光光度計(jì)：日本島津公司。

1.1.4 動(dòng)物及實(shí)驗(yàn)方案選取

SPF級(jí)8周齡雄性ICR小白鼠50只，體重（18±2）g，由北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，適應(yīng)飼養(yǎng)一周后，按體重成S型隨機(jī)分為5組，每組10只，即：空白對(duì)照組（NC）、D-半乳糖模型對(duì)照組（DC）、銀耳多糖低（TPL）、中（TPM）、高劑量組（TPH）。造模小鼠均每日定時(shí)定點(diǎn)于頸背部皮下注射120mg/（kg·bw）的D-半乳糖滅菌生理鹽水溶液，空白對(duì)照組用滅菌生理鹽水代替，注射量0.1mL/20 g。自造模的第一天起，劑量組小鼠分別灌胃以相應(yīng)濃度的溶液，空白對(duì)照組和模型對(duì)照組用生理鹽水代替，灌胃量0.2mL/20 g，每日一次，連續(xù)8周。小鼠于末次給藥后禁食過夜，于處死前稱重并記錄。小鼠眼球取血、頸椎脫臼處死，快速分離肝臟和腦，準(zhǔn)確稱取待測組織，按重量（g）∶體積（mL）=1∶9的比例加生理鹽水，冰浴條件機(jī)械勻漿，5 000 r/min離心2次，每次10min，吸取上清液，，用生理鹽水稀釋制成適當(dāng)稀釋倍數(shù)勻漿液，于-80℃保存，待測。原血依次在3 500 r/min和5 000 r/min下離心，每次15min，吸取上清液，于-20℃下保存血清待檢測。按說明書方法測定SOD、CAT、GSH-Px活力，T-AOC和MDA含量。取小鼠背部皮膚，去毛，除脂，生理鹽水洗凈，前處理后按說明書方法測羥脯氨酸含量。

1.2 指標(biāo)測定方法

實(shí)驗(yàn)相關(guān)生化指標(biāo)的測定方法均為比色法。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

數(shù)據(jù)均用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行處理，用單因素方差分析ANOVA（one-way analysisofvariance），以Duncans多重比較檢驗(yàn)（Duncansmultiple range tests）。分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果以均值士標(biāo)準(zhǔn)偏差（Mean±SD）表示，采用組間t檢驗(yàn)，P＜0.05具有顯著性差異，P＜0.01具有極顯著性差異。

2 結(jié)果

2.1 小鼠體重變化

在連續(xù)皮下注射D-半乳糖8周的過程中，正常對(duì)照組小鼠毛色光亮，行為如常，靈活好動(dòng)；模型對(duì)照組小鼠則毛色松散缺乏光澤，并且逐漸產(chǎn)生精神萎靡，活動(dòng)遲緩等一系列衰老體征，此現(xiàn)象充分說明，D-半乳糖衰老模型小鼠造模成功；而其他給予銀耳多糖治療的3組小鼠，其一般情況較模型對(duì)照組相比，衰老體征明顯改善，以銀耳多糖中、高劑量組小鼠的表現(xiàn)尤為明顯。

小鼠的體重增長情況是反應(yīng)生長發(fā)育的一個(gè)重要指標(biāo)，每周于固定時(shí)間測定一次小鼠的體重，其結(jié)果如圖1所示。

圖1 小鼠的體重變化Fig.1 Bodyweight changesof theMice

所有實(shí)驗(yàn)組小鼠的體重變化展現(xiàn)了相同的趨勢，與空白對(duì)照組相比，模型對(duì)照組小鼠體重平均水平均低于正常小鼠，不僅前期增重緩慢，后期體重甚至有明顯下降趨勢，呈現(xiàn)衰老體征；銀耳多糖劑量組與模型對(duì)照組小鼠相比，前期體重上升趨勢較快，其后期體重下降趨勢也有所緩解。其中以銀耳多糖中劑量組效果最為明顯。

2.2 抗氧化生化指標(biāo)檢測

2.2.1 銀耳多糖對(duì)小鼠體內(nèi)SOD活性的影響

圖2 銀耳多糖對(duì)D-半乳糖致衰老模型小鼠（a）血清、（b）肝臟和（c）腦組織中SOD活性的影響（M±SD，n=10）Fig.2 Effectof TP on theactivity of SOD in（a）blood serum，（b）liver and（c）brain in agingMice（M±SD，n=10）

從圖2（a）可以看出，與空白對(duì)照組相比，模型對(duì)照組小鼠血清SOD的活性極顯著降低（P＜0.01）；與模型對(duì)照組相比，銀耳多糖3個(gè)劑量組均可顯著提高小鼠血清SOD活性，其中銀耳多糖中劑量組可極顯著提高小鼠血清SOD活性（P＜0.01），銀耳多糖低、高劑量組也具有顯著性差異（P＜0.05）。

從圖2（b）和圖2（c）可以看出，與空白對(duì)照組相比，模型對(duì)照組小鼠肝臟和腦組織SOD活性極顯著降低（P＜0.01）；與模型對(duì)照組比較，銀耳多糖中、高劑量組可顯著提高小鼠肝臟和腦組織SOD活性（P＜0.05），且兩個(gè)劑量組的增進(jìn)效果與受試物劑量呈量效關(guān)系。

2.2.2 銀耳多糖對(duì)小鼠體內(nèi)MDA活性的影響

MDA含量增加顯示出機(jī)體抗氧化能力下降，氧自由基大量產(chǎn)生，脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物增多，因而測試MDA的量常?？煞从硻C(jī)體內(nèi)脂質(zhì)過氧化的程度，間接地反映出細(xì)胞損傷的程度。從實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出，通過對(duì)D-半乳糖衰老小鼠灌以銀耳多糖可以降低其體內(nèi)MDA的含量，降低體內(nèi)脂質(zhì)過氧化程度。

圖3 銀耳多糖對(duì)D-半乳糖致衰老模型小鼠（a）血清、（b）肝臟和（c）腦組織中MDA含量的影響（M±SD，n=10）Fig.3 Effectof TP on the contentsofMDA in（a）blood serum，（b）liver and（c）brain in agingMice（M±SD，n=10）

從圖3可知，與空白對(duì)照組相比，模型對(duì)照組小鼠血清、肝臟和腦組織中的MDA極顯著增加（P＜0.01）；與模型對(duì)照組相比，小鼠血清、肝臟和腦組織中，銀耳多糖各劑量組MDA的含量逐漸降低，且改善效果與受試物劑量呈量效關(guān)系，其中，劑量組血清及肝臟中MDA含量均極顯著降低（P＜0.01）；中、高劑量腦組織中MDA含量顯著降低（P＜0.05）。

2.2.3 銀耳多糖對(duì)小鼠體內(nèi)CAT活性的影響

圖4 銀耳多糖對(duì)D-半乳糖致衰老模型小鼠（a）血清（b）肝臟和（c）腦組織中CAT活性的影響（M±SD，n=10）Fig.4 Effectof TP on theactivity of CAT in（a）blood serum（b）liver and（c）brain in agingMice（M±SD，n=10）

各組小鼠血清中CAT活性如圖4（a）所示，模型對(duì)照組與空白對(duì)照組相比，其血清CAT活性明顯降低，具有顯著性差異（P＜0.05）；與模型對(duì)照組相比，銀耳多糖中、高劑量組可顯著提高小鼠血清中CAT活性（P＜0.05）。

各組小鼠肝臟和腦組織中CAT活性如圖4（b）和4（c）所示。從圖可以看出，模型對(duì)照組與空白對(duì)照組相比，其肝、腦組織中CAT活性極顯著降低（P＜0.01）。與模型對(duì)照組相比，銀耳多糖中、高劑量組均可提高小鼠肝臟和腦組織中CAT活性，且具有顯著性差異（P＜0.05），其中銀耳多糖高劑量組中肝組織CAT活性極顯著性回升（P＜0.01），并表現(xiàn)出劑量依賴趨勢。

2.2.4 銀耳多糖對(duì)小鼠體內(nèi)T-AOC活性的影響

各組小鼠體內(nèi)T-AOC活性如圖5所示。

圖5 銀耳多糖對(duì)D-半乳糖致衰老模型小鼠（a）血清（b）肝臟和（c）腦組織中T-AOC活性的影響（M±SD，n=10）Fig.5 Effectof DCIon theactivity of T-AOC in（a）blood serum（b）liver and（c）brain in agingMice（M±SD，n=10）

對(duì)小鼠的血清進(jìn)行T-AOC活力的測試，結(jié)果如圖5（a）所示，模型對(duì)照組與空白對(duì)照組相比，其血清中T-AOC活性顯著降低（P＜0.05）；與模型對(duì)照組小鼠相比，不同劑量的銀耳多糖可在不同程度上提高小鼠血清中T-AOC的活性，銀耳多糖高劑量組小鼠血清中T-AOC活性顯著性提高（P＜0.05），并表現(xiàn)出劑量依賴性。

從圖5（b）和5（c）可以看出，模型對(duì)照組小鼠肝、腦組織中T-AOC活性與空白對(duì)照組相比，其T-AOC活性顯著降低（P＜0.05）；劑量組小鼠相比模型小鼠，TAOC有不同程度的增長，其增強(qiáng)效果與受試物劑量呈現(xiàn)量效關(guān)系，其中銀耳多糖中、高劑量組可顯著提高小鼠肝、腦組織中T-AOC活性（P＜0.05）。

2.2.5 銀耳多糖對(duì)小鼠體內(nèi)GSH-Px活性的影響

各組小鼠體內(nèi)GSH-Px活性如圖6所示。

圖6 銀耳多糖對(duì)D-半乳糖致衰老模型小鼠（a）血清（b）肝臟和（c）腦組織中GSH-Px活性的影響（M±SD，n=10）Fig.6 Effectof TP on theactivity of T-AOC in（a）blood serum（b）liver and（c）brain in agingMice（M±SD，n=10）

從圖6可以看出，銀耳多糖對(duì)小鼠血清、肝、腦組織中GSH-Px活力的影響均表現(xiàn)出相似的趨勢。模型對(duì)照組小鼠體內(nèi)GSH-Px活性與空白對(duì)照組相比極顯著降低（P＜0.01）；銀耳多糖各劑量組與模型對(duì)照組相比，均可提高小鼠血清、肝、腦組織中GSH-Px活性，且三個(gè)劑量組的增進(jìn)效果與受試物劑量呈現(xiàn)量效關(guān)系，其中銀耳多糖中、高劑量組可顯著提高小鼠血清、肝、腦組織中GSH-Px活性（P＜0.05），并且在較高劑量干預(yù)時(shí)，小鼠腦組織中該酶的活力幾乎接近正常水平。

2.2.6 銀耳多糖對(duì)皮膚中羥脯氨酸含量的影響

羥脯氨酸是生命體中構(gòu)成膠原蛋白的重要前體。羥脯氨酸的含量也標(biāo)志著機(jī)體氧化的程度，故測定皮膚中羥脯氨酸的含量以鑒定小鼠氧化衰老的程度，同時(shí)也是鑒別銀耳多糖對(duì)于皮膚保養(yǎng)效果的指標(biāo)。

圖7 銀耳多糖對(duì)D-半乳糖致衰老模型小鼠皮膚中羥脯氨酸含量的影響（M±SD，n=10）Fig.7 Effectof TP on theactivity of IF in skin agingMice（M±SD，n=10）

從圖7可知，與空白對(duì)照組相比，模型對(duì)照組小鼠皮膚中的羥脯氨酸極顯著降低（P＜0.01）；與模型對(duì)照組相比，銀耳多糖各劑量組小鼠皮膚中羥脯氨酸的含量逐漸增長，且增長效果與受試物劑量呈量效關(guān)系，劑量組羥脯氨酸含量均極顯著增高（P＜0.01），表明銀耳多糖可以有效改善D-半乳糖致衰老小鼠皮膚中羥脯氨酸含量的下降，緩解小鼠氧化衰老的程度。

3 討論

衰老是人類永遠(yuǎn)不能回避的話題，目前具有本源性解釋的衰老機(jī)制是自由基學(xué)說，其本質(zhì)內(nèi)容為自由基在生物體內(nèi)不斷地通過非酶反應(yīng)與酶反應(yīng)產(chǎn)生活性氧自由基，但在抗氧化酶及外源性和內(nèi)源性抗氧化劑的協(xié)同作用下，活性氧自由基不斷地被清除。在正常生理情況下，活性氧自由基可維持于有利無害的極低水平，并保持穩(wěn)衡性動(dòng)態(tài)。平衡濃度的活性氧自由基中一部分可履行生理作用，而另一部分可損傷生物分子。生物體的細(xì)胞不時(shí)受到活性氧自由基的攻擊而發(fā)生損傷，在衰老、應(yīng)激及某些病理情況下自由基產(chǎn)生增多或清除能力減弱，使得自由基對(duì)肌體造成嚴(yán)重?fù)p傷[1]，從而造成人體的衰老?，F(xiàn)代生活中的許多生活因素例如紫外線、X射線、γ射線、香煙煙霧、氧化性污染物、電子輻射等都會(huì)誘發(fā)正常代謝以外的異常自由基的產(chǎn)生從而造成機(jī)體內(nèi)的DNA、蛋白質(zhì)和脂類的損傷[2-4]，損傷的積累導(dǎo)致細(xì)胞衰老或死亡。因此，在日常飲食中，有意的攝入具有抗氧化功效的食品、飲品變得極為重要。

大量實(shí)驗(yàn)結(jié)果已經(jīng)證明，多糖類物質(zhì)具有抗氧化作用，我國傳統(tǒng)中醫(yī)藥寶庫為多糖的提取和研究提過了廣闊的研究基礎(chǔ)和便利條件。從天然植物中提取多糖類物質(zhì)，經(jīng)人體攝取或代謝，通過對(duì)自由基的清除或?qū)λダ匣虻谋磉_(dá)下調(diào)，從而達(dá)到人體抗衰老功效的方法，成為了研究抗衰老的主流。這類多糖無毒副作用，提取成本低廉、工藝簡單；食用和使用的安全，具有可靠的安全性、廣闊的市場和遠(yuǎn)大的前景。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，正常ICR小鼠經(jīng)連續(xù)8周皮下注射D-半乳糖后，體重明顯下降，其血清、肝臟、腦組織中超氧化物歧化酶、過氧化氫酶、谷胱甘肽過氧化物酶和總抗氧化能力均有不同程度的抑制或下降，丙二醛含量極顯著性上升，小鼠皮膚中羥脯氨酸的含量極顯著性降低，而銀耳多糖經(jīng)體內(nèi)代謝可效提高小鼠體內(nèi)SOD、CAT、GSH-Px活性，降低MDA含量，提高T-AOC（總抗氧化能力），增加羥脯氨酸含量，甚至有個(gè)別體內(nèi)抗氧化指標(biāo)幾乎恢復(fù)至正常水平，并且銀耳多糖在較高劑量時(shí)作用顯著，且成一定的劑量依賴趨勢，由此得到初步結(jié)論：銀耳多糖對(duì)D-半乳糖致亞急性衰老小鼠具有較強(qiáng)的抗氧化活性。銀耳多糖可以降低機(jī)體氧化應(yīng)激水平，防止脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，達(dá)到抗氧化抗衰老的作用[11-12]。因此，綜合上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果，可以認(rèn)為銀耳多糖可以顯著增強(qiáng)機(jī)體內(nèi)抗氧化相關(guān)酶類的活性，抑制自由基的產(chǎn)生，抑制脂質(zhì)過氧化過程中產(chǎn)生的不良代謝產(chǎn)物。

經(jīng)過大量的實(shí)驗(yàn)證明，多糖類物質(zhì)的抗氧化效果以未純化的粗品為好，其抗氧化效果遠(yuǎn)好于純化后的某類組分，銀耳多糖的抗氧化實(shí)驗(yàn)結(jié)果也證實(shí)了這個(gè)結(jié)論。這可能是由于銀耳多糖等絕大多數(shù)多糖類物質(zhì)的抗氧化活性是靠多種多糖組分共同來表現(xiàn)并完成的，故有此特點(diǎn)。

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Study on the Antioxidation Effect of Tremella Polysaccharide

ZHANGZe-sheng，SUNDong，XUMeng-ying，TIANHuan，PAN Ji-chen
（Collegeof Food Engineeringand Biological Technology，Tianjin University ofScienceand Technology，Tianjin 300457，China）

Toexplore theantioxidantactivity ofpolysaccharides froMtremella in vivo.The polysaccharideswere obtained froMtremella after being separated and purificated.ICR mice were randomly assigned into Normal Group，Control Group，Low，Middle and High dose Group of polysaccharides froMtremella.Agingmodelmice wereestablished by subcutaneous injection ofD-galactose.Normalmicewere treated in the samemannerexpect thatsterile saline instead ofD-galactose.Modelmicewere treated by differentdosagesof polysaccharides（100，200，400mg/（kg·bw））forsuccessive8weeks，blank and controlmiceweregiven thedifferentvolumesofsaline according to the weight of the mice.The contents ofmalonialdehyde（MDA），the activities of superoxide dismutase（SOD），catalase（CAT），glutathioneperoxidase（GSH-Px）and totalantioxidantcapacity（T-AOC）in serum，brain and liver tissues were observed and hydroxyproline contents in skin were also determinated. Polysaccharides froMtremella could significantly enhance the activitiesof SOD，CAT，GSH-Px and T-AOC in serum，brain and liver tissues，reduce MDA contents and raise hydroxyproline contentsmarkedly in a dosedependentmanner.The higher dosages of polysaccharides performed better.polysaccharides froMtremella possessed astrongantioxidantactivity in D-galactose induced agingmice.

tremella polysaccharide；D-galactose；anti-aging；antioxidation

10.3969/j.issn.1005-6521.2014.18.004

2014-09-15

張澤生（1956—），男（漢），教授，博士，研究方向：食品添加劑與功能配料。