趙婧楠 李志敏 葉勤

（華東理工大學生物反應器工程國家重點實驗室，上海 200237）

Pseudomonas sp. F-12發(fā)酵優(yōu)化及轉化合成半胱氨酸的研究

趙婧楠 李志敏 葉勤

（華東理工大學生物反應器工程國家重點實驗室，上海 200237）

通過不同發(fā)酵策略對Pseudomonas sp. F-12以DL-2-氨基-△2-噻唑啉-4-羧酸（DL-ATC）為底物生產L-半胱氨酸的過程進行優(yōu)化，以分批發(fā)酵和指數流加發(fā)酵的形式進行生產，將發(fā)酵過程中的DL-ATC濃度分別控制在5 g/L和15 g/L。結果表明15 g/L DL-ATC分批發(fā)酵生產L-半胱氨酸得到最高酶活為149.1 U/mL，比活為70.9 U/mg DCW；采用15 g/L DL-ATC兩階段指數流加發(fā)酵，可使最高酶活達到313.3 U/mL，提高為分批發(fā)酵的2.1倍。同時在兩階段發(fā)酵過程中，能減少DL-ATC用量為5 g/L。兩階段發(fā)酵過程采用不同流加策略，證明菌體得率對酶活水平有顯著影響。首次考察了Pseudomonas sp. F-12全靜息細胞轉化合成L-半胱氨酸的主要影響因素。結果表明Pseudomonas sp. F-12的最適轉化pH為8.0，最適轉化溫度為30℃。加入甲苯等有機溶劑改變細胞膜通透性，使得半胱氨酸產量比對照組提高7.16倍，最高摩爾轉化率達到93.3 %。不同金屬離子對轉化影響不同，0.1 mmol/ L Fe2+對轉化反應有促進作用，0.1 mmol/L Co2+、Zn2+、Ni2+等重金屬離子有抑制作用。研究結果為微生物法發(fā)酵及全細胞轉化合成半胱氨酸的后續(xù)工業(yè)化奠定了基礎。

假單胞菌 L-半胱氨酸 DL-2-氨基-△2-噻唑啉-4-羧酸（DL-ATC） 發(fā)酵 生物轉化

L-半胱氨酸（L-cysteine，C3H7NO2S，分子量121.12）是唯一的含巰基氨基酸，肽鏈之間以二硫鍵（S-S）連接［1］，化學性質活潑。L-半胱氨酸可作為呼吸系統藥物，面團性質改良劑和美白用品等廣泛應用于醫(yī)藥、食品和化妝品行業(yè)［2］。

目前我國半胱氨酸的工業(yè)生產主要采用毛發(fā)水解法，但該工藝在制備過程中產生大量廢酸和廢氣，造成嚴重環(huán)境污染［3］。1977年，日本學者Sano等［4］發(fā)現嗜硫氮雜環(huán)戊烯假單胞菌（Pseudomonas thiozolinophilum）可以轉化DL-2-氨基-Δ2-噻唑啉-4

羧 酸（DL-2- Amino-Δ2-thiazoline-4-carboxylic Acid）合成L-半胱氨酸。相比毛發(fā)水解法，微生物轉化法具有工藝簡單、環(huán)境友好等優(yōu)點。其轉化途經已進行詳細研究，如圖1所示［5-7］。日本已能在工業(yè)規(guī)模利用微生物法轉化合成半胱氨酸，而我國仍然較多采用毛發(fā)水解法，因此開展微生物法生產L-半胱氨酸的研究十分有必要。

圖1 DL-ATC轉化半胱氨酸的途徑

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種 假單胞菌F-12（Pseudomonas sp. F-12），本研究室篩選保存［8］。

1.1.2 材料與試劑 DL-ATC（分析純）購自天津試劑二廠，葡萄糖為食品級別。其他試劑為市售分析純。

1.1.3 培養(yǎng)基 （1）種子培養(yǎng)基（g/L）：DL-ATC 15，KH2PO41，MgSO40.5，FeSO40.01，MnSO40.007。其中MnSO4，FeSO4溶液過濾滅菌加入，其余培養(yǎng)基121℃，滅菌20 min。（2）5 L罐分批發(fā)酵培養(yǎng)基（g/L）：DL-ATC 15，KH2PO41，MgSO40.5，FeSO40.01。MnSO40.007。其中MnSO4，FeSO4過濾滅菌加入，其余培養(yǎng)基121℃，滅菌20 min。（3）5 L罐兩階段發(fā)酵培養(yǎng)基（g/L）：葡萄糖2，KH2PO41，NH4Cl 2，MgSO40.5，FeSO40.01，MnSO40.007。 其中FeSO4和MnSO4過濾滅菌加入。補料葡萄糖為1 mol/L，25%的氨水調節(jié)pH7.0。

1.2 方法

1.2.1 種子培養(yǎng)條件 將-20℃甘油管保存的假單胞菌500 μL接種于的250 mL搖瓶，裝30 mL種子培養(yǎng)基。30℃，220 r/min搖床培養(yǎng)30 h。將一級種子液按1%-2%的接種量，接種于500 mL搖瓶，裝液量為100 mL，30℃，220 r/min搖床培養(yǎng)12 h。

1.2.2 5 L罐分批發(fā)酵 5 L發(fā)酵罐，裝2 L發(fā)酵培養(yǎng)基，按接種量10%進行接種。培養(yǎng)條件為溫度30℃，通氣量2 vvm，攪拌轉速初始600 r/min，之后根據溶氧逐步提高。1 mol/L H2SO4控制發(fā)酵過程pH6.8-7.0。每1 h取樣，測定菌濃和發(fā)酵產物，留樣待測酶活。

1.2.3 5 L罐兩階段指數流加發(fā)酵 兩階段法生產半胱氨酸，第一階段為菌體高密度生長階段，以指數流加的方式流加葡萄糖，使菌體密度達到最大。第二階段加入5 g/L或15 g/L DL-ATC誘導酶活。

發(fā)酵罐裝液量2 L，接入二級種子200 mL，培養(yǎng)條件為溫度30℃，初始攪拌轉速600 r/min，初始通氣量2 vvm。菌體生長階段以25%氨水調節(jié)pH值，流加葡萄糖的濃度為1 mol/L。第二階段以1 mol/L H2SO4加入調節(jié)pH值。

1.2.4 DL-ATC濃度對菌體生長及酶活影響試驗5 L罐發(fā)酵收集發(fā)酵液100 mL，4℃、12 000 r/min離心20 min。將離心得到的菌體利用種子培養(yǎng)基洗滌兩次，再重懸于20 mL的種子培養(yǎng)基中得到濃縮菌液。將濃縮菌液以2%的接種量加入到含有不同濃度DL-ATC的搖瓶中，30℃、220 r/min培養(yǎng)12 h，每2 h取樣1次，每組試驗兩個平行對照。

1.2.5 假單胞菌F-12轉化細胞的制備 將-20℃保存的菌株接種到裝有30 mL種子培養(yǎng)基的三角瓶中，30℃、220 r/min培養(yǎng)30 h。將培養(yǎng)好的一級種子液按2%接種量接種到裝有100 mL培養(yǎng)基的500 mL三角瓶中，30℃、220 r/min培養(yǎng)12 h。發(fā)酵液6 000 r/min、4℃離心10 min，棄上清液，將菌體用1 mol/L的磷酸緩沖液離心洗滌2次，得到轉化反應所需的靜息細胞。

1.2.6 pH對細胞轉化反應的影響 用磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖體系配制pH值為4.0、5.0、6.0、7.0的轉化液，甘氨酸-氫氧化鈉緩沖配制pH值為8.0、9.0、10.0的轉化液。利用1 mol/L、pH8.0的磷酸緩沖液將靜息細胞配制成OD為8.9的細胞懸液，置于水浴搖床（100 r/min）進行反應，每2 h取樣1 mL，12 000 r/min、4℃離心10 min，取上清測定L-半胱氨酸含量。

1.2.7 溫度對細胞轉化反應的影響 配制pH為8.0，DL-ATC濃度為 10 g/L的轉化液。利用上述轉化液將發(fā)酵獲得的靜息細胞配置成OD為9.0的細胞懸液，分別在30℃、37℃、42℃、45℃水浴條件下進行轉化，每2 h各取樣1 mL，測定半胱氨酸含量。

1.2.8 細胞滲透劑對轉化反應的影響 將培養(yǎng)細胞離心重懸，在菌液中分別加入1 mL甲苯、吐溫80、氯仿、CTAB（十六烷基三甲基溴化銨），將各類有機試劑與細胞充分混勻，30℃混合培養(yǎng)20 min，12 000 r/min離心10 min棄去上清，加1 mL pH8.0的磷酸緩沖溶液重懸。取處理過的菌液作轉化，轉化液中DL-ATC濃度10 g/L。

1.2.9 金屬離子對轉化反應的影響 考察了Mg2+、Fe2+、Co2+、Al3+、Ca2+、Zn2+、Ni2+、Mn2+對轉化的影響，配制含上述8種金屬離子（0.1 mmol/L）的DL-ATC轉化液。加入靜息細胞，置于水浴搖床進行轉化，每2 h取樣1次，測定半胱氨酸含量。

1.2.10 分析方法

（1）菌體濃度采用濁度法測定。將培養(yǎng)的菌液按適當比例進行稀釋，使用721型分光光度計在600 nm下檢測發(fā)酵液的光密度（OD600）。

（2）發(fā)酵液中殘留的DL-ATC采用島津LC-20A型高效液相色譜儀測定［9］。色譜柱為C18柱（150 mm×4.6 mm，Wondasil，Japan），檢測器為紫外檢測器（SPD-20A），波長260 nm，柱溫30℃，流動相為1∶1的超純水和乙腈，流速為0.6 mL/min。

（3）酶活測定。在轉化過程中有3種酶存在，這3種酶結合在一起形成半胱氨酸合成酶，其活性能反應完整細胞的轉化能力［10］。檢測表觀半胱氨酸合成酶活性的方法：細胞放置于1.5 mL離心管中，4℃，12 000 r/min離心5 min，加入0.1 mol/L 磷酸緩沖液（pH8.0）洗滌2次，重懸于包含10 g/L DLATC的0.1 mol/L磷酸緩沖液（pH 8.0），42℃ 水浴15 min，加入200 μL 10%（W/V）鹽酸停止反應，利用酸式茚三酮法測定半胱氨酸含量［11］。一個酶活單位定義為在上述標準條件下1 min產生1 μg L-半胱氨酸所需的酶量。單位菌體質量的酶活力定義為比活。

（4）半胱氨酸含量的測定。取待測發(fā)酵液于4℃，12 000 r/min，離心10 min，棄上清，沉淀用25 mL溶有10 g/L DL-ATC的磷酸緩沖溶液（pH8.0）重懸。42℃水浴搖床（100 r/min）中，反應10-12 h，每2 h取樣1 mL。將樣品12 000 r/min，室溫離心10 min，取上清煮沸1 min，相同條件離心，再取上清利用酸式茚三酮法測定半胱氨酸含量。

2 結果

2.1 5 L罐15 g/L DL-ATC分批及兩階段發(fā)酵

圖2 假單胞菌F-12 15 g/L DL-ATC分批發(fā)酵

5 L罐15 g/L DL-ATC分批發(fā)酵曲線如圖2所示。整個發(fā)酵過程為10 h，發(fā)酵8 h溶氧迅速跳升，9 h達到最高OD 5.38。在0-4 h基本檢測不到酶活的產生，說明此階段DL-ATC用于菌體生長，沒有誘導

出轉化的酶。5 h之后開始產生酶活。在溶氧跳升點后1 h，酶活產生最大值為148.1 U/mL，比活為70.9 U/mg DCW。在發(fā)酵過程中，溶氧和菌濃可作為重要指標判斷出酶活情況。溶氧跳升說明碳氮源物質供給不足，跳升后菌體濃度基本不再增加，此時DLATC消耗完全，產物積累最多，因此在溶氧跳升點產生酶活最大值。

分批發(fā)酵可知菌體生長和誘導酶活均依賴于唯一的碳氮源DL-ATC。因此若要降低成本，菌體生長階段可采用較廉價的碳氮源如葡萄糖。Pseudomonas sp. F-12在以DL-ATC為碳氮源的分批培養(yǎng)情況下，最大OD值僅為5.38。由分批試驗可知，Pseudomonas sp. F-12產生酶活與菌體濃度相關，若要獲得較高的酶活需要提高菌濃?？紤]降低成本，同時希望獲得更高的酶活，故采用兩階段策略進行發(fā)酵。兩階段發(fā)酵第一階段以葡萄糖為碳源，以氨水為氮源高密度發(fā)酵產生菌體；第2階段一次性補加DL-ATC進行誘導。

圖3 假單胞菌F-12 15 g/L DL-ATC指數流加發(fā)酵

如圖3所示，葡萄糖作為碳源時菌體增加較快，在16 h菌體達到最大OD 29.1。生長階段初期，生長速率會超過0.2 h-1以上，之后隨限制性因素增加，代謝副產物大量積累，增長速率逐漸放緩。菌體達到最大OD加入DL-ATC進行誘導。誘導階段溶氧逐漸下降，4 h后溶氧跳升發(fā)酵結束。在誘導后3 h，酶活最高，達到313.3 U/mL。指數流加發(fā)酵得到的最大單位酶活為分批發(fā)酵的2.1倍，有效提高了體積酶活，但是比酶活并未顯著升高。主要原因是菌體生長階段利用葡萄糖代謝，積累酸性物質，此酸性物質會影響菌體轉化活力［8］。誘導后期，由于溶氧條件限制及代謝廢物的積累導致菌體的比生長速率明顯下降，大量菌體自溶，利用DL-ATC能力降低，因此菌體相對比活并無提高。

2.2 搖瓶試驗對比不同濃度DL-ATC對生長和酶活的影響

搖瓶考察不同DL-ATC濃度對菌體生長和產酶的影響。由圖4可知，DL-ATC濃度對于菌體生長有一定影響。在20 g/L DL-ATC發(fā)酵6 h下，菌體得到最高菌濃OD600為5.67。在5 g/L、10 g/L和15 g/L DL-ATC濃度下，菌濃最高值OD600分別為5.33，5.34和5.65，為20 g/L DL-ATC的94%，94.5%和99.6%，其結果相差不大。由圖5可知，在DL-ATC濃度10 g/L時，酶活的誘導效果最好，達到13.12 U/mL。5 g/L、15 g/L和20 g/L DL-ATC濃度誘導的酶活分別為12.86 U/mL，12.73 U/mL，11.43 U/mL。酶活為10 g/L DL-ATC誘導的98%，97%和87%。搖瓶試驗成功地將DL-ATC由原來的15-20 g/L降低為5-10 g/L。

圖4 不同DL-ATC濃度對菌體濃度及酶活影響曲線

2.3 5 L罐5 g/L DL-ATC分批及兩階段發(fā)酵

5 L罐Pseudomonas sp. F-12的分批發(fā)酵，DLATC的量減少為5 g/L。發(fā)酵趨勢與15 g/L DL-ATC差別不大，酶活測定結果見圖5。

圖5 假單胞菌F-12 5 g/L DL-ATC分批發(fā)酵過程中的酶活表達

5 L罐5 g/L DL-ATC分批發(fā)酵菌體OD達到最大值為3.19。 3-5 h比生長速率迅速升高，同時酶活逐漸增高。溶氧跳升后酶活達到最大為95.5 U/mL，比活為91.5 U/mg DCW。相比較15 g/L DL-ATC與5 g/L DL-ATC發(fā)酵情況，5 g/L DL-ATC菌體濃度為3.19，為15 g/L DL-ATC 最大菌體濃度的59.3%。5 g/L DL-ATC分批發(fā)酵最大酶活為95.5 U/mL，為15 g/L DL-ATC最大酶活148.1 U/mL的64.5%，而比酶活5 g/L DL-ATC分批發(fā)酵高于15 g/L DL-ATC分批發(fā)酵，說明5 L罐分批發(fā)酵降低DL-ATC濃度可行。

兩階段發(fā)酵降低DL-ATC濃度進行誘導，以兩種控制不同比生長速率的策略考察對于酶活的影響。第一種策略以比生長速率0.2 h-1控制菌體生長，再以5 g/L DL-ATC進行誘導。第二種策略以比生長速率0.27 h-1控制菌體生長，再以5 g/L DL-ATC進行誘導，結果如圖6和圖7。

圖6 假單胞菌F-12 5 g/L DL-ATC 指數流加發(fā)酵（策略1）

圖7 假單胞菌F-12 5 g/L DL-ATC指數流加發(fā)酵（策略2）

第1種策略下的菌體最高OD為21.2，平均比生長速率為0.233 h-1，得率為0.296。第2種策略菌體最高OD為24.5，平均比生長速率為0.235 h-1，得率為0.241。兩種情況比生長速率基本一致，但得率有較大差別。第一種情況體積酶活為62.99 U/mL，比活為16.4 U/mg DCW。第2種情況下體積酶活為60.4 U/mL，比活為6.63 U/mg DCW。得率不同，積累的代謝副產物有機酸的量不同，因此兩種不同得率的情況酶活有較大差別。得率的高低和副產物的合成可與補堿消耗量相耦聯分析。Pseudomonas sp. F-12利用葡萄糖的過程中，會產生有機酸，造成pH的下降。補入的氨水可以中和生成的有機酸，使發(fā)酵液保持恒定的pH。消耗氨水的量越多，說明副產物有機酸產生越多。在策略一得率0.296的情況下，消耗氨水量較少，為153.7 g。在策略二得率0.241的情況下，氨水消耗為208.4 g，說明此時有機酸產生量多。初步推斷發(fā)酵過程中產生的未知有機酸，對于酶活有較大的影響。

2.4 轉化合成研究

發(fā)酵獲得全細胞后，研究不同pH，轉化溫度，底物濃度，不同表面活性劑及不同金屬離子對其轉化合成半胱氨酸的影響。

不同pH和溫度對全細胞轉化反應有顯著影響（圖8）。反應時間為8 h，pH值為8.0時合成L-半胱氨酸為1.65 g/L。當pH值大于9.0時，L-半胱氨

酸產量顯著下降。pH值小于6.0時，幾乎沒有L-半胱氨酸生成。pH9.0轉化合成半胱氨酸的量要大于pH7.0，說明Pseudomonas sp. F-12在堿性條件下的轉化水平要優(yōu)于中性及酸性條件。Pseudomonas sp. F-12最適轉化pH值為8.0（圖8-A），與此前文獻報道的凍融細胞最適轉化pH一致［12，13］。

考察在30、37、42、45℃條件下合成L-半胱氨酸的情況（圖8-B）。轉化溫度為30和37℃時，L-半胱氨酸產量呈持續(xù)上升趨勢。轉化溫度為42℃和45℃時，L-半胱氨酸產量在8 h時達到最大值，隨后半胱氨酸轉化量下降。分析原因為本試驗使用靜息細胞，未經凍融，細胞內物質沒有破裂滲出，細胞內絕大多數酶在30-37℃為最適轉化溫度，轉化溫度在42℃以上，超過細胞體內酶的耐受范圍，因此轉化時間縮短且轉化量較低。由前期試驗可知凍融細胞的最適轉化溫度為42℃，本試驗證明靜息細胞與凍融細胞在轉化溫度上有較大差別。

圖8 轉化液pH值（A）和溫度（B）對L-半胱氨酸合成的影響

表面活性劑顯著降低表面張力，改變細胞通透性，使細胞內的酶系更易滲出，從而促進轉化反應。不同表面活性劑對轉化反應作用不同（表1）。甲苯的促進效果最為顯著，為空白對照的7.16倍，最高摩爾轉化率達到93.3%。CTAB的促進作用弱于甲苯，產量達空白對照的1.86倍。氯仿對轉化略有促進作用。

金屬離子對轉化過程有不同程度的激活或抑制作用。試驗考察了Mg2+、Fe2+、Co2+、Al3+、Ca2+、Zn2+、Ni2+、Mn2+對轉化的影響（表2）。過高金屬離子濃度會極大影響轉化反應進行，而過低的濃度則不能體現出金屬離子的影響，目前已知報道中多以濃度0.1 mmol/L為標準［14］。

相比較空白對照，Fe2+對轉化反應的促進效果最顯著，為空白對照的1.5倍。Co2+、Zn2+、Ni2+、Al3+等重金屬離子對生物體往往具有毒性，這幾種金屬離子對于DL-ATC轉化L-半胱氨酸具有明顯抑制作用。在0.1 mmol/L 濃度下Mn2+、Ca2+、Mg2+等金屬離子對轉化反應影響不明顯。

表1 表面活性劑對L-半胱氨酸合成的影響

表2 不同金屬離子對L-半胱氨酸合成的影響

3 討論

半胱氨酸在工業(yè)具有廣泛用途，日本微生物法已能實現工業(yè)化生產，其摩爾轉化率能達到100%。而我國微生物酶法仍處在實驗室階段。南開大學劉忠等［15］以DL-ATC為唯一氮源篩選到假單胞菌TS1138，鑒定其產物為L-半胱氨酸。懷麗華等［16，17］采用5 L發(fā)酵罐對TS1138菌株的補料分批發(fā)酵動力學及合成途徑的代謝控制進行了研究。周昌平等［18］對酶促反應條件進行探討，菌體42℃下

轉化2.5 h，產物的質量濃度可達6 g/L。浙江大學吳敏［19］等以假單胞菌酶法轉化DL-ATC合成L-半胱氨酸，篩選到的菌株進行原生質體誘變后，最高轉化量為10 g/L，摩爾轉化率達到76.5%。這些研究仍然與工業(yè)化微生物法生產半胱氨酸具有較大差距，因此優(yōu)化發(fā)酵過程，提高產量、轉化率和降低成本具有深遠意義。

在本試驗中Pseudomonas sp. F-12分批發(fā)酵以DL-ATC為唯一碳氮源，DL-ATC既可作為反應底物也可作為酶活的誘導物，在發(fā)酵過程中能很快誘導出轉化的酶活體系。發(fā)酵過程中平均比生長速率達到0.305 h-1，比生長速率較高，酶活相對較高，說明菌體活力能明顯影響酶活。

兩階段發(fā)酵采用指數流加的方式控制菌體生長階段葡萄糖流加量，以葡萄糖作為限制性底物。結果表明，Pseudomonas sp. F-12細胞具有快速代謝葡萄糖的能力，如葡萄糖濃度超過2 g/L，其發(fā)酵液中可檢測到未知有機酸的存在。菌體在利用葡萄糖的過程中，過多的葡萄糖會導致副產物積累。

靜息細胞轉化反應，通過滲透處理可以促使底物進入細胞內與酶進行充分反應，同時也有利于轉化產物被運輸到到細胞外。加入表面活性劑或有機溶劑使得細胞滲透性增大，加快物質運輸的能力。本研究通過在轉化過程中加入滲透劑，增加細胞通透性，并且將細胞懸液置于搖床充分振蕩，可有效增加細胞與滲透劑的接觸，提高轉化量7.16倍以上。在金屬離子對于轉化反應的影響過程中，可以在現結果基礎上采用不同濃度梯度金屬離子進行轉化。提高Fe2+離子濃度，測定其能促進反應的濃度范圍。降低Co2+、Zn2+、Ni2+、Al3+離子濃度，測定抑制范圍。

4 結論

研究了不同發(fā)酵策略對Pseudomonas sp. F-12發(fā)酵生產L-半胱氨酸的影響。分批發(fā)酵控制DL-ATC濃度在15 g/L，最大體積酶活達到148.1 U/mL。兩階段發(fā)酵過程中，利用15 g/L DL-ATC進行誘導最高體積酶活為313.3 U/mL，提高酶活為分批發(fā)酵的2.1倍。利用5 g/L DL-ATC進行誘導最高體積酶活為62.99 U/mL，最高比酶活為16.4 U/mg DCW。較多代謝副產物的情況下，酶活受到一定影響，說明代謝產生的未知有機酸對于菌體誘導產生酶活有抑制作用?？疾炝宿D化液pH值、濃度，轉化溫度，不同滲透劑及金屬離子等因素對于轉化反應的影響。在轉化液pH 8.0，加入1 mL甲苯的條件下，轉化量提高至原來的7.16倍，摩爾轉化率達到93.3%，是目前國內報道的較高轉化水平。

［1］楊金奎, 何璧梅. 微生物方法生產L-半胱氨酸的研究進展［J］.國外醫(yī)藥：抗生素分冊, 2001, 22（4）：179-183.

［2］賈存江, 王英燕, 趙麗麗. L-半胱氨酸的生產方法及應用進展［J］. 齊魯藥事, 2007, 26（9）：553-555.

［3］Yu Y, Liu Z, Liu C, et al. Cloning, expression, and identification of genes involved in the conversion of Dl-2-Amino-△2-Thiazoline-4-carboxylic acid to L-cysteine via S-carbamyl-L-cysteine pathway in Pseudomonas sp. TS1138［J］. Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry, 2006, 70（9）：2262-2267.

［4］Sano K, Yokozek K, Tamura F, et al. Microbial conversion of Dl-2-amino-△2-thiazoline-4-carboxylic acid to L-cysteine and L-cystine：screening of microorganisms and identification of products［J］. Applied and Environmental Microbiology, 1977, 34（6）：806-810.

［5］Ryu O, Shin C. Analysis of the Reaction Steps in the Bioconversion of D, L-ATC to L-Cysteine, Korea, KR9700090［P］. 1991.

［6］Tamura Y, Ohmachi T, Asada Y. Induction of 2-amino-△2-thiazoline-4-carboxylic acid hydrolase and N-carbamoyl-L-cysteine Amidohydrolase by S-compounds in Pseudomonas Putida AJ3865［J］. The Journal of General and Applied Microbiology, 2001, 47（4）：193-200.

［7］Tamura Y, Nishino M, Ohmachi T, et al. N-carbamoyl-L-cysteine as an intermediate in the bioconversion from D, L-2-Amino-△2-thiazoline-4-carboxylic acid to L-cysteine by Pseudomonas sp. On-4a［J］. Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry, 1998, 62（11）：2226-2229.

［8］Fan CL, Li ZM, Ye Q. Two-stage cultivation of Pseudomonas Sp. F12 for the production of enzymes converting Dl-2-amino-Δ2-thiazoline-4-carboxylic acid to L-cysteine［J］. Applied Biochemistry and Biotechnology, 2012, 168（7）：1867-1879.

［9］Yang B, Liu Z, Deng B, et al. Isolation and genetic improvement of Pseudomonas sp. strain HUT-78, capable of enzymatic production of L-cysteine from Dl-2-amino-△2-thiazoline-4-carboxylic Acid［J］.

The Journal of General and Applied Microbiology, 2011, 57（6）：379-386.

［10］Duan J, Zhang Q, Zhao H, et al. Cloning, Expression, characterization and application of atcA, atcB and atcC from Pseudomonas sp. for the production of L-cysteine［J］. Biotechnology Letters, 2012, 34（6）：1101-1106.

［11］Gaitonde M. A spectrophotometric method for the direct determination of cysteine in the presence of other naturally occurring amino acids［J］. Biochemical Journal, 1967, 104（2）：627-633.

［12］Huang Y, Zhao L, Dong T, et al. Optimization of enzymeproducing conditions of Micrococcus sp. S-11 for L-cysteine production［J］. Afr J Biotechnol, 2010, 10（4）：615-623.

［13］陳曉云, 杜軍, 高智慧, 等. 惡臭假單胞菌TS1138透性化細胞的制備及其轉化 DL-ATC生成L-半胱氨酸的特性研究［J］.南開大學學報, 2012, 45（4）：99-100.

［14］金永杰, 楊文博, 劉忠, 等. 假單胞菌L-半胱氨酸合成酶的純化和性質研究［J］. 微生物學通報, 2004, 31（6）：68-71.

［15］劉忠, 楊文博, 白鋼, 等. 微生物酶法合成L-半胱氨酸和 L-胱氨酸［J］. 微生物學通報, 2003, 30（6）：16-21.

［16］懷麗華, 周昌平, 陳寧, 等. L-半胱氨酸產生菌TS1138的補料分批發(fā)酵動力學研究［J］. 河南工業(yè)大學學報, 2007.28（1）：32-35.

［17］懷麗華, 寇廣會, 周昌平, 等. 碳氮源對酶法合成L-半胱氨酸的影響［J］. 現代食品科技, 2006, 22（4）：85-87.

［18］周昌平, 寇廣會, 徐慶陽, 等. 微生物轉化法合成L-半胱氨酸的研究［J］. 現代化工, 2006, 26（2）：275-278.

［19］吳敏, 陳蔚青, 王普, 等. 假單胞菌酶法轉化DL-ATC合成L-半胱氨酸［J］. 氨基酸和生物資源, 2009, 31（1）：58-63.

（責任編輯 李楠）

Study on Fermentation and Conversion of L-cysteine by Pseudomonas sp. F-12

Zhao Jingnan Li Zhimin Ye Qin
（State Key Laboratory of Bioreactor Engineering，East China University of Science and Technology，Shanghai 200237）

L-cysteine has been widely applied in food and pharmaceuticals. In this study, different fermentation strategies of Pseudomonas sp. F-12 transforming DL-ATC to L-cysteine were investigated. The results showed that the highest enzyme activity of 15 g/L DL-ATC batch fermentation was 149.1 U/mL, specific activity was 70.9 U/mg DCW. The highest enzyme activity of two phase fermentation using 15 g/L DLATC was 313.3 U/mL, 2.1 times higher than the batch fermentation. The amount of DL-ATC was reduced to 5 g/L. In this study, the major factors on the biotransformation of L-cysteine by Pseudomonas sp. F-12 were investigated. The optimal reaction conditions for cells were 30℃, pH 8.0. The addition of organic solvents could change cellular permeability and enhance the production of L-cysteine by 7.16 times. The maximum conversion of L-cysteine was 93.3%. 0.1 mmol/L Fe2+benefitted the reaction, while 0.1 mmol/L Co2+, Zn2+, Ni2+and other heavy metal ions inhibited transformation.

Pseudomonas sp. F-12 L-cysteine DL-ATC Fermentation Bioconversion

2014-04-24

趙婧楠，女，碩士，研究方向：生物催化與基因克?。籈-mail：zhaojingnan0218@163.com

李志敏，女，博士，教授，研究方向：生物化工，發(fā)酵工程，代謝工程，微生物生理和代謝調控；E-mail：lizm@ecust.edu.cn