王健 劉麗麗 余凱敏 李國(guó)超 吳巍 閆艷春

（中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院研究生院，北京 100081）

高效氯氰菊酯對(duì)斑馬魚(yú)胚胎毒性的研究

王健 劉麗麗 余凱敏 李國(guó)超 吳巍 閆艷春

（中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院研究生院，北京 100081）

高效氯氰菊酯是一種Ⅱ型擬除蟲(chóng)菊酯類農(nóng)藥，對(duì)魚(yú)類及其它水生生物具有高毒，且在其它食物中也可檢測(cè)到它的殘留，高效氯氰菊酯的殘留對(duì)人類的健康同樣具有不容忽視的影響。為了解高效氯氰菊酯對(duì)魚(yú)、對(duì)人類的毒性機(jī)制，選用0.05、0.1、0.2、0.6、1 mg/L 五個(gè)梯度濃度的高效氯氰菊酯溶液，對(duì)斑馬魚(yú)胚胎進(jìn)行毒性處理，在顯微鏡下觀察其對(duì)斑馬魚(yú)發(fā)育形態(tài)變化和孵化率等影響。發(fā)現(xiàn)高效氯氰菊酯農(nóng)藥對(duì)斑馬魚(yú)胚胎有嚴(yán)重的致畸效應(yīng)，這種致畸性呈現(xiàn)劑量依賴性。使用0.1 mol/L濃度的高效氯氰菊酯農(nóng)藥對(duì)斑馬魚(yú)胚胎進(jìn)行處理，進(jìn)行早期胚胎發(fā)育的毒性研究。采用熒光差異雙向凝膠電泳（2-D DIGE）-質(zhì)譜相結(jié)合的方法，鑒定出11個(gè)差異表達(dá)蛋白質(zhì)。這些蛋白質(zhì)與細(xì)胞骨架、應(yīng)激反應(yīng)和新陳代謝有關(guān)。這些研究結(jié)果為進(jìn)一步研究高效氯氰菊酯對(duì)動(dòng)物的毒性機(jī)制提供了基本信息。

斑馬魚(yú) 胚胎 β-高效氯氰菊酯 DIGE 質(zhì)譜

斑馬魚(yú)屬于輻鰭亞綱（Actinopterygii）鯉科（Cyprinidae）短擔(dān)尼魚(yú)屬（Danio）［1］，是一種小型熱帶淡水魚(yú)，屬于硬骨魚(yú)，成魚(yú)體長(zhǎng)4-5 cm，3個(gè)月可達(dá)性成熟。性成熟雌魚(yú)每周可產(chǎn)卵一次，每次產(chǎn)卵量大約50-200枚，這為試驗(yàn)研究提供了豐富的材料，同時(shí)可以極大地節(jié)省試驗(yàn)成本和時(shí)間。斑馬魚(yú)基因與人類基因的相似度達(dá)到87%，其發(fā)育過(guò)程、器官構(gòu)造、生理功能、基因結(jié)構(gòu)等都與哺乳類動(dòng)物非常相近。因具有遺傳背景清楚、繁殖周期短、體外受精、產(chǎn)卵量大且過(guò)程可人為控制、胚胎透明便于觀察等優(yōu)點(diǎn)，斑馬魚(yú)常被應(yīng)用于胚胎學(xué)、發(fā)育生物學(xué)、分子生物學(xué)等研究，尤其在藥物研發(fā)、人類疾病研究［2-5］及毒理學(xué)［5，6］等方面。斑馬魚(yú)是理想的分子生物學(xué)和免疫學(xué)研究的脊椎動(dòng)物模型［7-9］。

β-高效氯氰菊酯（beta-cypermethrin）屬Ⅱ型擬除蟲(chóng)菊酯類農(nóng)藥，化學(xué)名為（R，S）-α-氰基-3-苯

氧基芐基（1R，3R）-3-（2，2-二氯乙烯基）-2，2-二甲基環(huán)丙羧酸酯。因其具有高效、安全、殺蟲(chóng)譜廣、低殘留等特點(diǎn)，被廣泛用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)，但它對(duì)魚(yú)類具有高毒性，很多國(guó)家對(duì)其用量進(jìn)行了嚴(yán)格控制。

本研究是以脊椎動(dòng)物斑馬魚(yú)為材料，分別從表型和蛋白質(zhì)組水平兩方面，對(duì)高效氯氰菊酯農(nóng)藥所引起的發(fā)育毒性及毒性機(jī)制進(jìn)行探究，填補(bǔ)高效氯氰菊酯農(nóng)藥引起發(fā)育毒性的數(shù)據(jù)短缺，為進(jìn)一步探究該農(nóng)藥對(duì)斑馬魚(yú)胚胎的發(fā)育毒性機(jī)制提供數(shù)據(jù)和線索；也為完善的環(huán)境污染物的評(píng)估標(biāo)準(zhǔn)提供理論依據(jù)。本研究首次通過(guò)熒光差異雙向凝膠電泳（Fluorescence difference gel electrophoresis，DIGE）與基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時(shí)間質(zhì)譜（MALDI-TOFMS）鑒定相結(jié)合的技術(shù)，探索高效氯氰菊酯對(duì)斑馬魚(yú)胚胎的發(fā)育毒性的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

AB品系斑馬魚(yú)由北京大學(xué)張博實(shí)驗(yàn)室惠贈(zèng)。

1.1.1 主要試劑 處理液：用丙酮作溶劑配制濃度為0.1 kg/L的β-氯氰菊酯儲(chǔ)液，再用培養(yǎng)液稀釋到0.1 mg/L。 鏈酶蛋白酶溶液：用E3 培養(yǎng)液配制終濃度為1 mg/mL的鏈酶蛋白酶（pronase，Sigma）溶液。于37℃溫育2 h，溶解后貯存于-20℃?zhèn)溆谩Ａ呀庖海? mol/L尿素，2 mol/L硫脲，4%CHAPS（3-［（3-膽固醇氨丙基）二甲基氨基］-1-丙磺酸），40 mmol/L DTT（二硫蘇糖醇），2%IPG buffer（pH4-7）。DTT與IPG buffer在臨用前加入。水化液：7 mol/L尿素，2 mol/L硫脲，2% CHAPS，0.002% 溴酚藍(lán)（1%），2% DTT，0.5% IPG buffer（pH4-7）。DTT與 IPG buffer在臨用前加入。SDS平衡液儲(chǔ)液：6 mol/L尿素，2% SDS（十二烷基磺酸鈉），50 mmol/L Tris（三氫甲基氨基甲烷），29.3%甘油，0.002% 溴酚藍(lán)（1%）。10X去卵黃緩沖液：55 mmol/L NaCl，1.8 mmol/L KCl，1.25 mmol/L NaHCO3。膠母液：30%丙烯酰胺，0.8%N，N’-甲叉雙丙烯酰胺。使用前用0.45 μm濾膜過(guò)濾溶液，4℃避光保存。上槽電泳緩沖液：25 mmol/L Tris，192 mmol/L甘氨酸，0.2% SDS。下槽電泳緩沖液：25 mmol/L Tris，192 mmol/L甘氨酸，0.1% SDS。染色液：0.12% G-250，10% 硫酸胺，10% 磷酸，20% 甲醇。

1.1.2 儀器 斑馬魚(yú)獨(dú)立養(yǎng)殖系統(tǒng)（北京愛(ài)生）、Ettan IPGphor Ⅲ等電聚焦系統(tǒng)（GE Healthcare）、Ettan DALT Large垂直電泳系統(tǒng)（GE Healthcare）、ImageScanner（GE Healthcare）、Typhoon 9000（GE Healthcare）。

1.2 方法

1.2.1 斑馬魚(yú)養(yǎng)殖 使用北京愛(ài)生公司開(kāi)發(fā)的斑馬魚(yú)獨(dú)立養(yǎng)殖設(shè)備，對(duì)斑馬魚(yú)進(jìn)行規(guī)范化的飼養(yǎng)，設(shè)備包括豐年蝦孵化系統(tǒng)、循環(huán)水系統(tǒng)、充氣系統(tǒng)、紫外線殺菌系統(tǒng)和燈光照明系統(tǒng)，滿足斑馬魚(yú)養(yǎng)殖的一切條件需要。魚(yú)房使用自動(dòng)計(jì)時(shí)器控制光照，保持14 h 光照/10 h 黑暗，控制室內(nèi)溫度28℃。自來(lái)水經(jīng)凈化處理后存儲(chǔ)于加藥桶內(nèi)，并加入適量的NaCl，保持電導(dǎo)率為500 μs/cm，pH值為7.0。受精后5 d（5 dpf）幼魚(yú)可進(jìn)食草履蟲(chóng)。13 dpf后，逐漸喂食新鮮豐年蝦，每天喂食3次，根據(jù)斑馬魚(yú)的發(fā)育大小及濃度進(jìn)行適量喂養(yǎng)。

1.2.2 斑馬魚(yú)喂繁殖 斑馬魚(yú)按照雌雄比例為1∶1放入孵化盒中，用隔板分開(kāi)，次日抽掉隔板，10 min后斑馬魚(yú)開(kāi)始產(chǎn)卵，30 min后進(jìn)行胚胎的收集，放于 28℃的培養(yǎng)箱中。

1.2.3 樣品的處理 受精后3 h（囊胚期），利用不同濃度的高效氯氰菊酯農(nóng)藥對(duì)胚胎進(jìn)行染毒處理，每個(gè)培養(yǎng)皿中放200胚胎，每3 h更換溶液，并及時(shí)去除死卵，在受精后48 h時(shí)，收集胚胎。

1.2.4 樣品制備及蛋白質(zhì)的提取

（1）去卵膜和卵黃 用1X鏈霉蛋白處理胚胎5-10 min，約2/3的卵膜脫落時(shí)，轉(zhuǎn)移到含有去離子水的培養(yǎng)皿中，再用移液槍吸打，去除卵膜。再加去卵黃緩沖液1 mL，振蕩5 min后300 r/min離心30 s，棄上清。加150 μL 3%SDS，90℃溶解5 min。

（2）蛋白質(zhì)提取和定量 蛋白質(zhì)提取采用甲醇-氯仿法，在上述溶液分別入4倍體積甲醇，1倍體積氯仿及3倍體積超純水，充分混勻，14 000 r/min離心1 min，去掉上層溶液，再加4倍體積甲醇，混勻，14 000 r/min，離心2 min。吸掉甲醇，干燥沉淀。加適當(dāng)體積裂解液（未添加DDT與IPG buffer）。蛋白質(zhì)含量的測(cè)定采用2-DQuant Kit（GE Healthcare），

用紫外分光光度計(jì)測(cè)定480 nm波長(zhǎng)下溶液的吸光率。繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算蛋白質(zhì)含量。

1.2.5 樣品標(biāo)記 樣品標(biāo)記采用CyDye DIGE最小標(biāo)記法。根據(jù)400 pmol 染料標(biāo)記50 μg 蛋白的原則設(shè)計(jì)3個(gè)組，Cy2標(biāo)記內(nèi)標(biāo)組（對(duì)照組25 μg+處理組25 μg），Cy3標(biāo)記對(duì)照組（50 μg），Cy5標(biāo)記處理組（50 μg），調(diào)溶液pH為8.5。將染料工作液1 μL加到50 μg蛋白質(zhì)中，渦旋混勻，離心，冰上并暗處標(biāo)記30 min。加入10 mmol/L 1 μL賴氨酸進(jìn)行淬滅，渦旋混勻，離心，冰上并暗處淬滅15 min。標(biāo)記完成，樣品在-70℃下可以保存3個(gè)月。

1.2.6 2D-DIGE （1）水化：將由Cy2、Cy3和Cy5標(biāo)記的樣品進(jìn)行充分混合，再用水化液將體積補(bǔ)到450 μL。加到水化泡脹盤(pán)中，將24 cm IPG干膠條（pH4-7）膠面向下置于膠槽內(nèi)，樣品與膠面充分接觸且不能產(chǎn)生氣泡，加覆蓋油。室溫水化時(shí)間約為20 h。（2）等電聚焦：把水化后的膠條轉(zhuǎn)移到聚焦盤(pán)上，膠面向上，加覆蓋油，在膠條兩邊壓上電極，開(kāi)始聚焦。聚焦條件見(jiàn)表1。（3）膠條平衡：等電聚焦結(jié)束，將膠面置于10 mL平衡液Ⅰ（含有100 mg DDT）中，平衡15 min，再轉(zhuǎn)移到10 mL平衡液Ⅱ（含有400 mg碘乙酰胺）中，平衡15 min。（4）SDS-PAGE：平衡結(jié)束后，將膠條背面置于12.5%SDS-聚丙烯酰胺凝膠的頂端的玻璃板上，加入熱的0.5%瓊脂糖進(jìn)行封口，讓膠條與膠面充分接觸且不能產(chǎn)生氣泡。待瓊脂糖凝固，裝模具。電壓為1-2 W/膠，40 min 后調(diào)至5-10 W/膠。當(dāng)溴酚藍(lán)遷移到膠的底部時(shí)結(jié)束電泳。（5）固定：聚焦結(jié)束后，將膠放在固定液中，固定30 min后用去離子水洗4-5次。（6）考馬斯亮藍(lán)染色：水洗后的膠在染色液中過(guò)夜染色。染色結(jié)束，用去離子水洗脫5次，可以得到背景較高的膠圖。

1.2.7 凝膠的掃描與圖像分析 普通雙向利用ImageScannerⅡ掃描儀（GE Healthcare，USA）在透射模式和分辨率300 dpi條件下進(jìn)行圖譜的掃描，熒光凝膠用Typhoon FLA 9000（GE Healthcare，USA）進(jìn)行掃描，3種染料的激發(fā)波長(zhǎng)分別是Cy2：489 nm、Cy3：550 nm和 Cy5：649 nm。通過(guò)優(yōu)化PMT值來(lái)采集圖像，PMT值的范圍要控制在6 000-10 000之間，本試驗(yàn)PMT在8 500左右。利用DeCyder 7.2軟件分析，獲得不同處理組樣品差異表達(dá)蛋白點(diǎn)的信息。

表1 等電聚焦條件

2 結(jié)果

2.1 高效氯氰菊酯對(duì)斑馬魚(yú)形態(tài)學(xué)的影響

本試驗(yàn)選用4個(gè)特定的時(shí)間點(diǎn)（t=24 hpf、48 hpf、60 hpf、72 hpf）對(duì)暴露在不同高效氯氰菊酯溶液濃度里的斑馬魚(yú)胚胎或仔魚(yú)發(fā)育定期進(jìn)行觀察，與對(duì)照組相比較，可以發(fā)現(xiàn)斑馬魚(yú)胚胎在24 hpf時(shí)，在形態(tài)上沒(méi)有觀察到明顯的異常。而在48 hpf以后，經(jīng)高效氯氰菊酯溶液處理的胚胎會(huì)表現(xiàn)出不同程度的毒性反應(yīng)，包括體軸彎曲（圖1-B、E和F），心包囊腫（圖1-D）、獨(dú)眼（圖1-C）和死亡（圖1-G和H）。隨著高效氯氰菊酯溶液濃度的增加，表現(xiàn)出來(lái)的毒性反應(yīng)也顯著增強(qiáng)。在低濃度下（0.05 和0.1mg/L），只是表現(xiàn)部分畸形，而在高濃度下（0.2、0.6、1 mg/L），畸形率會(huì)大大增加，并伴有少量致死現(xiàn)象。本試驗(yàn)對(duì)畸形率進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，不同（0.05、0.1、0.2、0.6和1 mg/L）濃度處理組中，其畸形比例分別為14%、42%、80%、83.3%和86.7%。結(jié)果表明，隨著高效氯氰菊酯農(nóng)藥濃度的增加，致畸性會(huì)顯著增加，呈現(xiàn)一定的時(shí)間-劑量依賴性。由于0.1 mg/L濃度下，畸形率顯著增加，故選此濃度進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

2.2 雙向電泳的優(yōu)化

進(jìn)行2D-DIGE之前，需要用普通雙向電泳對(duì)整個(gè)流程進(jìn)行條件優(yōu)化，如圖1所示。為了選擇合適的膠條，本試驗(yàn)首先選用pH3-10范圍的膠條進(jìn)行預(yù)試驗(yàn)，如圖2-A所示，在此圖中，蛋白質(zhì)點(diǎn)主要集中在左側(cè)區(qū)域內(nèi)，不是均勻分布在整張膠圖上，

故pH3-10的膠條不適合本樣品。選用pH 4-7的膠條（圖2-B，C，D），根據(jù)蛋白質(zhì)點(diǎn)的分布情況可得出，pH4-7的膠條適合本試驗(yàn)。但圖2-B上部區(qū)域出現(xiàn)高背景并伴有縱向拖尾現(xiàn)象。根據(jù)此類情況，將除鹽步驟進(jìn)行了優(yōu)化，設(shè)計(jì)了3步梯度除鹽，分別為500 V 1 h，1 000 V 2 h，3 000 V 2 h。圖2-C中出現(xiàn)水平的條紋或不完全聚焦的點(diǎn)，這種情況是由于聚焦時(shí)間不夠造成的，該圖中聚焦電壓為7 500 V 9 h。經(jīng)過(guò)一個(gè)完整的優(yōu)化過(guò)程，得到分離效果比較好的圖譜如圖2-D所示，適合該樣品的等電聚焦條件如表1所示。

圖1 高效氯氰菊酯對(duì)斑馬魚(yú)胚胎形態(tài)的影響

2.3 2D-DIGE及質(zhì)譜分析

利用優(yōu)化好的雙向電泳條件進(jìn)行DIGE試驗(yàn)。DIGE圖譜如圖3所示，由于熒光標(biāo)記的不同，所呈現(xiàn)的圖譜也不同，Cy2標(biāo)記的內(nèi)標(biāo)組為藍(lán)色（圖3-B），Cy3標(biāo)記的對(duì)照組為綠色（圖3-C），Cy5標(biāo)記的處理組為紅色（圖3-D），3種熒光圖的組合如圖3-A所示。

圖2 普通雙向電泳圖

圖3 DIGE膠圖

DeCyder 7.2蛋白分析軟件進(jìn)行識(shí)別并分析得出結(jié)果，以fold＞1.5和fold＜-1.5為標(biāo)準(zhǔn)，得到72個(gè)差異表達(dá)蛋白質(zhì)，選取這些差異蛋白點(diǎn)并進(jìn)行質(zhì)譜分析，由于某些蛋白點(diǎn)豐度較低等原因最終成功鑒定出11個(gè)蛋白點(diǎn)，這些蛋白點(diǎn)的位置如圖3所示。差異表達(dá)蛋白質(zhì)質(zhì)譜分析，見(jiàn)表2。

圖3 11個(gè)差異蛋白點(diǎn)在雙向電泳凝膠圖譜的對(duì)應(yīng)編號(hào)及位置

表2 斑馬魚(yú)胚胎的差異蛋白點(diǎn)質(zhì)譜鑒定結(jié)果

3 討論

DIGE是功能蛋白質(zhì)組學(xué)研究的有力工具，通過(guò)對(duì)不同蛋白質(zhì)表達(dá)差異分析，在研究疾病的分子機(jī)理［10-12］、分子診斷［13，14］、藥物作用機(jī)理［15］、毒理學(xué)［16-19］等方面都有廣泛的應(yīng)用。是蛋白質(zhì)組學(xué)研究中可信度和準(zhǔn)確率最高的技術(shù)之一。

本試驗(yàn)成功鑒定了11種蛋白質(zhì)：（1）HSPA8/ HSC70 蛋白（Heat shock cognate 71 kD protein）是腺苷三磷酸酶，它的主要作用是與輔助蛋白共同去除網(wǎng)格蛋白涂層囊泡，它也是熱休克蛋白家族中的重要成員，在細(xì)胞內(nèi)膜中參與蛋白質(zhì)翻譯折疊及運(yùn)輸［20］。（2）角蛋白，Ⅰ型細(xì)胞骨架（Keratin，type I cytoskeletal 18），它的磷酸化產(chǎn)物在纖絲重組中起重要作用［21］，與突變的囊性纖維化跨膜調(diào)節(jié)因子在質(zhì)膜中的傳遞有關(guān)［22］，和細(xì)胞角蛋白共同參與白細(xì)胞介素-6（IL-6）-介導(dǎo)的屏障保護(hù)［23］。（3）40S核糖體蛋白質(zhì)SA（40S ribosomal protein SA）作為層粘連蛋白細(xì)胞表面的受體，參與40S核糖體蛋白質(zhì)的合成過(guò)程［24］。（4）-（6）肌動(dòng)蛋白（Actin，cytoplasmic 2）是一個(gè)多基因家族蛋白，作為微絲的主要成分是重要的骨架蛋白，肌動(dòng)蛋白和肌球蛋白一起構(gòu)成了心肌、骨骼肌和平滑肌的主要收縮蛋白。（7）DNA裂解酶（DNA-lyase）作為一種無(wú)嘌呤/脫嘧啶（AP）脫氧核糖核酸內(nèi)切酶，參與DNA氧化和烷基化所致病變中的堿基切除修復(fù)過(guò)程［25］。（8）26S 蛋白酶體（26S proteasome）依賴ATP參與泛素的降解，在雙鏈斷裂反應(yīng)中起重要作用［26］。（9） Rho GTP酶（Rho GDP-dissociation inhibitor 1）是細(xì)胞內(nèi)多條信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的關(guān)鍵分子，作為分子開(kāi)關(guān)在胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中發(fā)揮橋梁作用。Rho GTP酶可參與對(duì)正常細(xì)胞增殖、分化、凋亡的調(diào)節(jié)，并與腫瘤的發(fā)生和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。試驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，在多種腫瘤中可見(jiàn)Rho GTP酶異常表達(dá)，改變細(xì)胞內(nèi)Rho GTP酶的表達(dá)水平可以直接影響腫瘤細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移的過(guò)程［27］。（10）tdrd3（Tudor domain-containing protein 3）專門(mén)識(shí)別并結(jié)合含有二甲基精氨酸的蛋白質(zhì)，與轉(zhuǎn)錄激活相關(guān)聯(lián)［28］。（11）翻譯控制腫瘤蛋白（Translationally-controlled tumor protein homolog）是與腫瘤生長(zhǎng)相關(guān)的蛋白，參與重要的生物學(xué)過(guò)程，包括調(diào)節(jié)細(xì)胞周期的進(jìn)程、細(xì)胞生長(zhǎng)分化及精子發(fā)生和惡性轉(zhuǎn)移、鈣結(jié)合蛋白、細(xì)胞外組胺釋放蛋白、抗凋亡及抗瘧疾作用。還有研究表明，翻譯控制腫瘤蛋白在人體腫瘤組織中的表達(dá)遠(yuǎn)高于正常組織［29］。

綜上所述，這些蛋白在生命活動(dòng)發(fā)揮著非常重要的作用，有些蛋白質(zhì)（如Rho GTP酶、翻譯控制腫瘤蛋白）的差異表達(dá)可能引起斑馬魚(yú)胚胎本身的病變，而某些蛋白質(zhì)（角蛋白、DNA裂解酶）卻是對(duì)應(yīng)激反應(yīng)做出來(lái)的修復(fù)與防御。

本研究結(jié)果表明高效氯氰菊酯農(nóng)藥對(duì)斑馬魚(yú)胚胎發(fā)育具有嚴(yán)重的毒性作用，較低濃度的高效氯氰菊酯溶液即已對(duì)斑馬魚(yú)胚胎在蛋白分子水平產(chǎn)生嚴(yán)重的潛在危害，影響胚胎的正常發(fā)育。本研究從分子水平上揭示了高效氯氰菊酯對(duì)斑馬魚(yú)胚胎的發(fā)育毒性及可能的毒害作用方式，為深入研究高效氯

氰菊酯對(duì)斑馬魚(yú)胚胎的發(fā)育毒性機(jī)理提供了證據(jù)和線索。

4 結(jié)論

高效氯氰菊酯農(nóng)藥對(duì)斑馬魚(yú)胚胎具有嚴(yán)重的神經(jīng)毒性，并且對(duì)孵化后的幼魚(yú)卵黃、體軸等表現(xiàn)出嚴(yán)重的致畸效應(yīng)，在一定濃度下呈明顯的時(shí)間劑量依賴性，高濃度的高效氯氰菊酯農(nóng)藥對(duì)會(huì)胚胎發(fā)育有嚴(yán)重影響。首次利用雙向熒光差異凝膠電泳與質(zhì)譜相結(jié)合的技術(shù)，得到高效氯氰菊酯農(nóng)藥脅迫下所引起的差異表達(dá)蛋白質(zhì)，該結(jié)果為進(jìn)一步研究高效氯氰菊酯農(nóng)藥對(duì)斑馬魚(yú)胚胎的發(fā)育毒性奠定了基礎(chǔ)。

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（責(zé)任編輯 李楠）

Toxicity of Beta-cypermethrin for Zebrafish Embryos

Wang Jian Liu Lili Yu Kaimin Li Guochao Wu Wei Yan Yanchun
（Graduate School of Chinese Academy of Agricultural Sciences，Beijing 100081）

Beta-cypermethrin, an insecticide of type II pyrethroids, is highly toxic to fish and other aquatic organism and the residues can be detected in many foods. The impact of beta-cypermethrin for human health can not be neglected. To better define the toxicity mechanism of beta-cypermethrin for fish and human, the embryos of zebrafish were exposed to different sub-lethal concentrations of 0.05, 0.1, 0.2, 0.6 and 1 mg/L of beta-CYP solutions. With the help of a microscope, we observed the morphological changes. The results displayed that exposed to beta-CYP caused the embryonic toxicity increased in a dose-dependent manner. We chose zebrafish embryos exposure to beta-CYP（0.1 mol/L）as a model system to investigate the toxic effects on early development. A two-dimensional difference gel electrophoresis（2-D DIGE）coupled with MALDI-TOF-MS/MS analysis was employed to detect and identify the differential expressed proteins. In the present study, a total of 11 different proteins were successfully identified, which were mostly associated with cytoskeletal, stress response and metabolism. This study brings useful information and contributes to a better understanding about the embryo toxicity organisms of beta-CYP.

Zebrafish Embryos Beta-cypermethrin DIGE MALDI-TOF-MS/MS

2014-02-19

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（31170119），中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院基礎(chǔ)研究基金項(xiàng)目（0042014006，0042014011，0042012003，0042011006）

王健，男，碩士研究生，研究方向：微生物分子生物學(xué)與基因工程；E-mail：xwj329396369@gmail.com

閆艷春，女，教授，研究方向：微生物分子生物學(xué)與基因工程；E-mail：yanyanchun@caas.cn