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(1.浙江工業(yè)大學(xué) 生物與環(huán)境工程學(xué)院,浙江 杭州 310014；2.中國(guó)水稻研究所，浙江 杭州 310006)

氯氰菊酯(cypermethrin)作為一種廣譜高效的擬除蟲(chóng)菊酯類(lèi)殺蟲(chóng)劑，因其高效用和低哺乳動(dòng)物毒性而廣泛用于農(nóng)業(yè)病蟲(chóng)害的防治，是茶樹(shù)、果樹(shù)、蔬菜等農(nóng)作物病蟲(chóng)害防治的主要農(nóng)藥之一.研究表明：氯氰菊酯對(duì)一些水生生物、蜜蜂等非靶標(biāo)生物有較大毒性，對(duì)人的生殖健康有嚴(yán)重危害[1-4].由于氯氰菊酯穩(wěn)定性高，半衰期長(zhǎng)，在果蔬、食品、環(huán)境中殘留量大，影響農(nóng)產(chǎn)品的質(zhì)量及人類(lèi)的身體健康.隨著人們對(duì)生活質(zhì)量的要求不斷提高，解決農(nóng)藥殘留，提高食品和環(huán)境安全已經(jīng)成為一個(gè)亟待解決的課題.

微生物降解是指利用微生物將存在于環(huán)境中的毒害污染物降解或轉(zhuǎn)化為其他無(wú)害物質(zhì)，被公認(rèn)為是一種有效、廉價(jià)、無(wú)二次污染的方法.同時(shí)，利用微生物進(jìn)行農(nóng)藥降解還具有操作簡(jiǎn)便、繁殖快、生態(tài)恢復(fù)性好等優(yōu)點(diǎn).有關(guān)氯氰菊酯的降解菌主要在假單胞菌屬(Pseudomonassp.)[5-6]、沙雷氏菌屬(Serratiasp.)[7]、芽孢桿菌屬(Bacillussp.)[8]等微生物種類(lèi)中被發(fā)現(xiàn).本研究篩選分離到1株能高效降解氯氰菊酯的惡臭假單胞菌(Pseudomonsaputida)LQK-14，研究其降解特性，并對(duì)其降解酶定域，為其在生物修復(fù)中的應(yīng)用提供了實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)和理論基礎(chǔ).

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 培養(yǎng)基

基礎(chǔ)培養(yǎng)基(MM)：NaCl 1.0 g，K2HPO41.5 g，NH4NO31.0 g，KH2PO40.50 g，MgSO4·7H2O 0.1 g，水1 000 mL，pH 7.0～7.2，121 ℃滅菌備用.

篩選培養(yǎng)基：基礎(chǔ)培養(yǎng)基中按試驗(yàn)設(shè)計(jì)要求添加20～800 mg/L的氯氰菊酯作為惟一碳源.氯氰菊酯溶解在少量丙酮中，與滅菌后放置冷卻于45 ℃的基礎(chǔ)培養(yǎng)基相混合.

1.1.2 供試農(nóng)藥與標(biāo)樣

95%氯氰菊酯農(nóng)藥原藥，南京榮誠(chéng)化工有限公司；氯氰菊酯標(biāo)樣，北京康林科技有限公司生產(chǎn)，純度≥98.5%.

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 菌種篩選和純化

采集受氯氰菊酯污染的茶園和農(nóng)藥廠廢水處理池附近的土壤.稱(chēng)取一定量土壤，制成菌懸液，無(wú)菌稀釋后涂布含有100 mg/L氯氰菊酯的分離培養(yǎng)基上，30 ℃下培養(yǎng)48～72 h，待長(zhǎng)出單菌落后，采用平板劃線法分離純化，純化時(shí)逐步增大培養(yǎng)基中所加的氯氰菊酯質(zhì)量濃度，直至達(dá)到800 mg/L.

1.2.2 菌種鑒定及系統(tǒng)發(fā)育研究

參照文獻(xiàn)[9]進(jìn)行菌株形態(tài)觀察.挑取氯氰菊酯降解菌的單菌落于20 μL ddH2O中，漩渦混勻后，置于PCR儀中99 ℃，10 min，12 000 r/min離心30 s，上清液直接作為PCR反應(yīng)的模版.擴(kuò)增引物為一對(duì)通用引物，正向引物F27：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′，反向引物R1492：5′-TACGGTTACCTTGTTACGACTT-3′，引物由上海生物工程有限公司合成.50 μL反應(yīng)體系：10×buffer(with 15 mmol/L MgCl2)5 μL，10 mmol/L dNTP 1 μL，5 μmol/L引物各2 μL，基因組DNA模板3 μL，ddH2O 36.5 μL，Taq酶0.5 μL.PCR反應(yīng)條件為95 ℃預(yù)變性4 min；95 ℃反應(yīng)1 min，56 ℃反應(yīng)30 s，72 ℃反應(yīng)90 s，循環(huán)35次；72 ℃反應(yīng)5 min.采用PCR產(chǎn)物純化試劑盒純化擴(kuò)增產(chǎn)物后，由上海華大基因公司測(cè)序.將測(cè)得的基因序列通過(guò)NCBI-BLAST進(jìn)行序列比對(duì)分析.菌體形態(tài)的電鏡觀測(cè)照片委托浙江大學(xué)生物技術(shù)研究室電鏡中心拍攝.

1.2.3 氯氰菊酯的降解試驗(yàn)

選取純化后的單個(gè)菌株，以初始接種量OD600≈0.3接種以氯氰菊酯為唯一碳源的基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，設(shè)不接菌為對(duì)照，每處理重復(fù)3次，于30 ℃，搖床200 r/min，培養(yǎng)7 d.培養(yǎng)液中殘留的氯氰菊酯用2倍體積的石油醚抽提，10 000 r/min離心5 min，吸取上層有機(jī)相，用HPLC檢測(cè).檢測(cè)條件：高效液相色譜儀型號(hào)為Agilent PH1100型(帶工作站)，色譜柱Agilent C18柱(4.6 mm×250 mm)，柱溫30 ℃，流動(dòng)相V(乙腈)∶V(水)= 85∶15，流速1 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)235 nm，進(jìn)樣量20 μL.外標(biāo)法定量，本檢測(cè)方法樣品中氯氰菊酯的含量以兩峰的峰面積總量計(jì).氯氰菊酯降解率計(jì)算式為

1.2.4 降解條件

1) 培養(yǎng)基初始pH對(duì)LQK-14降解氯氰菊酯的影響

將基礎(chǔ)鹽培養(yǎng)基的pH值分別調(diào)節(jié)為為5，6，7，8和9(含100 mg/L氯氰菊酯)，以5%的接種量接種，30 ℃，搖床200 r/min培養(yǎng)7 d，測(cè)定其生長(zhǎng)狀況和農(nóng)藥含量.

2) 溫度對(duì)菌株生長(zhǎng)和降解氯氰菊酯的影響

以5%的接種量接種于含100 mg/L氯氰菊酯基礎(chǔ)培養(yǎng)基，分別于20，25，30，35，40 ℃，搖床200 r/min培養(yǎng)7 d，測(cè)定其生長(zhǎng)狀況和農(nóng)藥含量.

3) 碳源種類(lèi)對(duì)氯氰菊酯降解的影響

按照0.1%(m/v)的比例在基礎(chǔ)培養(yǎng)液中分別添加葡萄糖、果糖、蔗糖、麥芽糖、淀粉和甘油作為外源碳源，以5%的接種量接種后置于30 ℃，200 r/min搖床培養(yǎng)7 d，測(cè)定降解率.

4) 氮源種類(lèi)對(duì)氯氰菊酯降解的影響

按照0.1%(m/v)的比例在MM培養(yǎng)液中分別添加牛肉膏、蛋白胨、酵母膏、尿素、氯化銨和硫酸銨作為外源氮源，以5%的接種量接種后置于30 ℃，200 r/min搖床培養(yǎng)7 d，測(cè)定降解率.

5) 氯氰菊酯初始濃度對(duì)降解的影響

在基礎(chǔ)鹽培養(yǎng)基中加入氯氰菊酯，使其終質(zhì)量濃度分別為25，50，100，200，300 mg/L，按5%的接種量接入降解菌種子液，于30 ℃，搖床200 r/min培養(yǎng)7 d，測(cè)定其生長(zhǎng)狀況和農(nóng)藥含量.

1.2.5 降解酶的定域

應(yīng)用滲透休克方法進(jìn)行研究，具體試驗(yàn)方法參見(jiàn)洪源范等[10]，略修改后進(jìn)行氯氰菊酯降解酶的定域.

1.2.6 粗酶液的制備和酶活力的測(cè)定

將已經(jīng)培養(yǎng)好的菌液6 000 r/min離心10 min，去上清，具體用20 mmol/L磷酸緩沖液洗滌2次，在冰浴中超聲波破碎，12 000 r/min離心5 min，棄沉淀，上清液凍存?zhèn)溆?取20 mmol/L磷酸緩沖液1 800 μL(含甲醇溶解的50 mg/L氯氰菊酯)，200 μL粗酶液，30 ℃條件下反應(yīng)20 min，用200 μL的6 mol/L HCl終止反應(yīng)，加入2倍體積的石油醚，渦旋振蕩1 min，于12 000 r/min下離心3 min，取上層有機(jī)相進(jìn)行HPLC檢測(cè).通過(guò)氯氰菊酯的標(biāo)準(zhǔn)曲線，求得氯氰菊酯的減少量.

2 結(jié)果與分析

2.1 降解菌的分離和菌種鑒定

從長(zhǎng)期、大量施用擬除蟲(chóng)菊酯農(nóng)藥的杭州茶園土壤中分離獲得1株能以氯氰菊酯為惟一碳源生長(zhǎng)的細(xì)菌，命名為L(zhǎng)QK-14.該菌株在LB固體培養(yǎng)基上生長(zhǎng)時(shí)，菌落呈規(guī)則圓形、邊緣整齊，菌落白色、略透明、有光澤、較粘稠、略有臭味.取LB培養(yǎng)基上生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)期的培養(yǎng)物拍攝電鏡照片見(jiàn)圖1.圖1中菌體呈卵圓形，長(zhǎng)約1.2 μm，寬約0.8 μm，單端叢生鞭毛.革蘭氏染色陰性，接觸酶反應(yīng)和吲哚試驗(yàn)呈陽(yáng)性，VP試驗(yàn)、苯丙氨酸脫氨酶試驗(yàn)和甲基紅試驗(yàn)均為陰性，不能水解淀粉，能耐受10%氯化鈉，生長(zhǎng)最適pH為7.0等.

圖1 氯氰菊酯降解菌LQK-14電鏡負(fù)染圖(30 000×)

菌株LQK-14 16S rRNA基因序列全長(zhǎng)為1 439 bp.將其與已登錄的16S rRNA基因序列進(jìn)行同源性比較，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與已經(jīng)報(bào)道的惡臭假單胞菌PseudomonasputidaIS82(登陸號(hào)FJ596989)和32zhy(登陸號(hào)AM411059)等菌株的同源性達(dá)到100%.因此，根據(jù)上述相似性比較結(jié)果，結(jié)合菌株的生理生化特性將其鑒定為惡臭假單胞菌(Pseudomonasputida).圖2為應(yīng)用軟件mega 5.0做出的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù).

圖2 氯氰菊酯降解菌LQK-14的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)

2.2 菌株降解效能的測(cè)定

2.2.1 降解菌LQK-14的降解曲線

降解菌LQK-14以5%的接種量接種到氯氰菊酯起始濃度為100 mg/L的基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，于30 ℃搖床上200 r/min培養(yǎng)7 d，每隔12 h取樣，檢測(cè)其降解率，結(jié)果見(jiàn)圖3.

圖3 降解菌LQK-14對(duì)氯氰菊酯的降解曲線

由圖3可看出：在84 h以內(nèi)，細(xì)胞處于積極生長(zhǎng)狀態(tài)，繁殖迅速，菌液的OD460最高達(dá)到0.856，同時(shí)氯氰菊酯的降解也穩(wěn)步增加.84 h后LQK-14的生長(zhǎng)速度開(kāi)始變緩，但其降解能力并未降低，仍然保持線性的增長(zhǎng)速度，最終于168 h能將100 mg/L的氯氰菊酯降解67%，而對(duì)照組的降解率很低，上述結(jié)果表明LQK-14菌株對(duì)氯氰菊酯具有降解作用.

2.2.2 培養(yǎng)基初始pH值對(duì)LQK-14降解氯氰菊酯的影響

培養(yǎng)基的pH是影響微生物生長(zhǎng)繁殖和生理活動(dòng)的重要因素之一.pH除了對(duì)細(xì)胞發(fā)生直接影響外，還可產(chǎn)生通過(guò)改變培養(yǎng)基中營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的離子化程度從而抑制微生物對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收等的間接影響.pH的變化對(duì)于菌株LQK-14降解性能的影響很顯著.在pH5.0～9.0的范圍內(nèi)，氯氰菊酯的降解效率出現(xiàn)先升高后降低的現(xiàn)象，其最大降解率出現(xiàn)在pH7.0，降解率達(dá)70.25%，pH上升至8.0時(shí)，其降解率仍能維持在62%以上.同時(shí)試驗(yàn)證明LQK-14菌株在pH6.0～8.0的范圍內(nèi)生長(zhǎng)情況良好，細(xì)胞數(shù)量多，其生長(zhǎng)最適pH為7.0，但在pH≤4的條件下不生長(zhǎng).表明降解菌LQK-14的細(xì)胞數(shù)量與其降解能力密切相關(guān).

2.2.3 溫度對(duì)LQK-14降解氯氰菊酯的影響

溫度也是影響微生物生長(zhǎng)繁殖和生理活動(dòng)的重要因素之一.適宜的溫度下微生物能快速生長(zhǎng)繁殖，低溫可導(dǎo)致細(xì)胞膜凝固，引起物質(zhì)運(yùn)送困難；高溫則使蛋白質(zhì)變性，影響酶活性.在溫度為25～35 ℃時(shí)，降解菌LQK-14均保持較好的降解能力；當(dāng)溫度升至40 ℃時(shí)，降解能力顯著下降.通過(guò)檢測(cè)不同溫度下其菌液的渾濁度，發(fā)現(xiàn)40 ℃時(shí)降解菌生長(zhǎng)情況較差.30 ℃時(shí)菌液的OD460值為0.810，而40 ℃時(shí)菌液OD460值為0.055，因此推斷可能是由于LQK-14菌株不適應(yīng)在較高溫度下生長(zhǎng)造成氯氰菊酯降解率下降.降解菌LQK-14在常溫下表現(xiàn)出較好的降解能力，為以后在土壤修復(fù)過(guò)程中施用提供了有利條件.

2.2.4 碳源對(duì)LQK-14降解氯氰菊酯的影響

添加外源碳源以考察降解菌LQK-14對(duì)氯氰菊酯的降解，結(jié)果見(jiàn)圖4.從圖4中可以看出：除了在添加了麥芽糖后，氯氰菊酯降解率提高外，其余的碳源的添加均降低LQK-14對(duì)氯氰菊酯的降解.其中，甘油和淀粉對(duì)氯氰菊酯的降解影響較大，降解率下降約50%.檢測(cè)發(fā)現(xiàn)LQK-14利用淀粉的能力很弱(生理生化檢測(cè))，推測(cè)淀粉的添加對(duì)LQK-14菌株的生長(zhǎng)產(chǎn)生了一定的影響，其生長(zhǎng)情況不好，導(dǎo)致其降解氯氰菊酯的能力下降.甘油一般可以作為微生物生長(zhǎng)的遲效碳源，且易于獲得大量的菌體(和葡萄糖作為碳源相比)，但是甘油的加入，可能導(dǎo)致LQK-14優(yōu)先利用較易利用的碳源甘油，造成對(duì)氯氰菊酯降解率的下降.

2.2.5 氮源對(duì)LQK-14降解氯氰菊酯的影響

土壤中有機(jī)質(zhì)的含量及其肥力情況影響了微生物的種類(lèi)和分布，故在土壤的生物修復(fù)過(guò)程中，通過(guò)調(diào)整土壤的施肥比例可強(qiáng)化其修復(fù)過(guò)程.氮源對(duì)微生物生長(zhǎng)和生理活動(dòng)的影響顯著，故添加外源的氮源以考察降解菌LQK-14對(duì)氯氰菊酯的降解，結(jié)果如圖5所示.從圖5中可以看出：牛肉膏、蛋白胨和酵母膏的添加減緩了氯氰菊酯的降解，但尿素、氯化銨和硫酸銨的添加促進(jìn)了氯氰菊酯的降解，尤其是兩種無(wú)機(jī)氮源的添加促使其7 d的降解率均超過(guò)了88%.這與李青云等的研究結(jié)果不同，其分離獲得的PseudomonasaeruginosaGF31在外加氮源的情況下，其降解氯氰菊酯的效能提高，且有機(jī)氮比無(wú)機(jī)氮更有利于農(nóng)藥降解[11].

圖4 碳源對(duì)降解氯氰菊酯的影響

圖5 氮源對(duì)降解氯氰菊酯的影響

2.2.6 氯氰菊酯初始質(zhì)量濃度對(duì)LQK-14降解的影響

降解菌LQK-14接種到不同氯氰菊酯起始質(zhì)量濃度的培養(yǎng)基，30 ℃，200 r/min搖床培養(yǎng)7 d后檢測(cè)其農(nóng)藥降解率.結(jié)果表明：隨著氯氰菊酯起始濃度從25 mg/L增加到300 mg/L，其降解率呈現(xiàn)降低的趨勢(shì).其中，在300 mg/L氯氰菊酯的條件下，降解菌LQK-14生長(zhǎng)情況較差，降解率快速降低.推測(cè)氯氰菊酯降解過(guò)程中產(chǎn)生的中間代謝產(chǎn)物的毒性抑制了降解菌的生長(zhǎng)和降解活性.例如，Rhodococcussp.CDT3降解氯氰菊酯過(guò)程中產(chǎn)生的中間代謝產(chǎn)物3-苯氧基苯甲酸(3-PBA)對(duì)降解菌CDT3的降解效能產(chǎn)生一定的抑制作用，且其降解速率與3-PBA的濃度呈負(fù)相關(guān)[12].

2.3 降解酶的定域試驗(yàn)

應(yīng)用滲透休克方法獲得降解菌LQK-14胞內(nèi)外和周質(zhì)空間的粗酶液，測(cè)定其酶活力.其中，胞內(nèi)酶活力最高，可達(dá)18.42 μmol/(min·L)，周質(zhì)空間(1.83 μmol/(min·L))次之，胞外的酶活力最低，可能是菌體細(xì)胞死亡后的釋放，或者胞內(nèi)酶泄露到周質(zhì)空間和胞外.由此推定，降解菌LQK-14降解氯氰菊酯的酶屬于胞內(nèi)酶.文獻(xiàn)報(bào)道氯氰菊酯降解酶多為胞內(nèi)酶，如Liang等從AspergillusnigerZD11中純化得到分子量為56 kDa的胞內(nèi)酶[13]；Tallur等從Micrococcussp. CPN1提取到誘導(dǎo)型的胞內(nèi)酶[14].

3 結(jié) 論

從施用氯氰菊酯的土壤中分離獲得一株能以氯氰菊酯為惟一碳源生長(zhǎng)且能分解氯氰菊酯的細(xì)菌LQK-14，根據(jù)其生理生化特征結(jié)合其16S rDNA相似性比較，鑒定為惡臭假單胞菌(Pseudomonsaputida).該菌株對(duì)300 mg/L的氯氰菊酯仍具有一定的降解作用，其降解氯氰菊酯的最適pH值為7.0，最適溫度為25～30 ℃，添加適量無(wú)機(jī)氮源氯化銨和硫酸銨對(duì)其降解氯氰菊酯具有促進(jìn)作用，在7 d內(nèi)對(duì)100 mg/L氯氰菊酯的降解率最高可達(dá)88%.酶的定域試驗(yàn)表明，降解酶為胞內(nèi)酶.

本文得到了浙江工業(yè)大學(xué)重中之重學(xué)科開(kāi)放研究基金項(xiàng)目(20080104)的資助.

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