，，， ，

(1.浙江工業(yè)大學(xué) 藥學(xué)院，浙江 杭州 310014；2.浙江工業(yè)大學(xué) 生物與環(huán)境工程學(xué)院，浙江 杭州 310014)

近年來，由于對(duì)陸生動(dòng)植物的藥源發(fā)現(xiàn)越來越稀少，海洋已成為人類開墾新藥的處女地.海洋約占地球總面積71%[1]，微生物資源豐富，種類繁多，是生物資源的巨大寶庫.它獨(dú)特的高鹽、高壓、低溫、寡營養(yǎng)等環(huán)境，賦予了海洋微生物獨(dú)特的代謝途徑和機(jī)體防御機(jī)制[2]，使其產(chǎn)生的代謝物的化學(xué)結(jié)構(gòu)新穎、生理功能獨(dú)特，為提取和分離天然生物活性分子提供了新來源[3].

為了尋找新的生物活性成分，本課題對(duì)海洋真菌MucorcircinelloidesMNP12010102發(fā)酵液的乙酸乙酯萃取相進(jìn)行了化學(xué)成分的研究，分離得到7個(gè)化合物，通過1H NMR，13C NMR以及文獻(xiàn)對(duì)照等方法，鑒定為過氧化麥角甾醇(Ⅰ)，麥角甾醇(Ⅱ)，cyclo-(S-Pro-8-hydroxy-R-Ile)(Ⅲ)，cyclo-(S-Pro-S-Leu)(Ⅳ)，cyclo-(S-Pro-R-Phe)(Ⅴ)，2-(4-hydr oxyphenyl)ethylacetate(Ⅵ)，和tyrosol(Ⅶ)，其中化合物Ⅲ—Ⅶ均為首次從該屬真菌中分離得到.本研究還對(duì)上述化合物進(jìn)行了細(xì)胞毒活性實(shí)驗(yàn).

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 菌株來源

海洋真菌MNP12010102分離自2012年4月采集到的中國東海(北緯28.25°、東經(jīng)122.60°海域)海水.

由南京金斯瑞生物科技公司鑒定為卷枝毛霉Mucorcircinelloides.菌種保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心.

1.2 儀器和材料

HPLC(LC-20A)(日本島津公司)；超凈工作臺(tái)(上海恒益科技有限公司)；Spectra Max M5多功能酶標(biāo)儀(美國Molecular Devices公司)；Autospect 3000質(zhì)譜儀(美國Thermo公司)；核磁共振波譜儀500 MHz(瑞士Bruker公司)；Revco Elite II CO2培養(yǎng)箱(美國Thermo公司)；Luna 5u C18制備色譜柱(美國Phenomenex公司)；四甲基偶氮唑鹽(MTT)購自Sigma公司；改良型RPMI1640細(xì)胞培養(yǎng)基購自奧賽飛世爾生物化學(xué)制品有限公司；GF254高效薄層硅膠(青島海洋化工廠);其余試劑為國產(chǎn)分析純.

前列腺癌細(xì)胞PC-3和胰腺癌細(xì)胞PANC-1均來自浙江工業(yè)大學(xué)生物與環(huán)境工程學(xué)院毒理實(shí)驗(yàn)室.

1.3 培養(yǎng)與提取

將該菌株28 ℃，200 r/min，搖床培養(yǎng)7 d，靜置培養(yǎng)7 d，所得發(fā)酵液經(jīng)過萃取和濃縮后，得到發(fā)酵液粗浸膏22 g.該乙酸乙酯萃取部分具有較好的生物活性，因此參考文獻(xiàn)[4]中MTT-HPLC聯(lián)用模型等方法指導(dǎo)下完成以下的分離工作.

1.4 分 離

將乙酸乙酯浸膏用大孔樹脂粗分，以V(甲醇)∶V(水)=1∶4，2∶3，3∶2，4∶1，1∶0梯度洗脫，快速分離，按極性由高到低分粗分為6個(gè)組分，再經(jīng)反復(fù)過硅膠柱(石油醚/乙酸乙酯或二氯甲烷/甲醇)，Sephadex LH-20凝膠柱色譜和半制備HPLC等方法分離純化得到化合物Ⅰ(64 mg)、化合物Ⅱ(35 mg)、化合物Ⅲ(9 mg)、化合物Ⅳ(15 mg)、化合物Ⅴ(10 mg)、化合物Ⅵ(154 mg)、化合物Ⅶ(14 mg).

2 結(jié)果和討論

2.1 結(jié)構(gòu)鑒定

化合物Ⅰ為白色針狀結(jié)晶，1H NMR(500 MHz, CDCl3)δ6.51(d,J=8.5 Hz,1H,C7-H),6.25(d,J=8.5 Hz,1H,C6-H),5.23(dd,J=15.3,8.3 Hz,1H,C22-H),5.15(dd,J=15.3,8.3 Hz,1H,C23-H),3.99(m,1H,C3-H),1.01(dd,J=6.7,1.7 Hz,3H,C21-Me),0.92(d,J=6.8 Hz,3H,C28-Me),0.89(s,3H,C19-Me),0.84(d,J=1.3 Hz,3H),0.83(d,J=1.3 Hz,3H),0.82(s,3H,C18-Me).該化合物的氫譜為典型的甾醇特點(diǎn)，確定為過氧化麥角甾醇[5].

化合物Ⅱ?yàn)榘咨槧罱Y(jié)晶，1H NMR(500 MHz,CDCl3)δ5.58(dd,J=5.5,2.3 Hz,1H,C7-H),5.40～5.39(m,1H,C6-H),5.24(dd,J=15.2,7.1 Hz,1H,C22-H),5.18(dd,J=15.3,7.8 Hz,1H,C23-H),3.65(m,1H,C3-H),2.48(ddd,J=14.3,4.5,2.2 Hz,1H,C2-H),2.30(t,J=12.2 Hz,1H,C4-H),1.05(d,J=6.6 Hz,3H,C21-Me),0.96(d,J=4.4 Hz,3H,C19-Me),0.93(d,J=6.8,3H,C28-Me),0.85(d,J=5.5 Hz,3H,C26-Me),0.84(d,J=7.1 Hz,3H,C27-Me),0.64(s,3H,C18-Me)，確定為麥角甾醇[6].

化合物Ⅲ為黃色油狀(甲醇)，1H NMR(500 MHz,MeOD)δ4.26～4.18(m,1H,C9-H),4.09(s,1H,C6-H),3.56(ddd,J=13.9,8.6,5.8 Hz,1H,C3-H),3.52～3.49(m,1H,C3-H),2.36～2.31(m,1H,C5-H),2.20～2.16(m,1H,C10-H),2.08～2.01(m,1H,C4-H),2.00～1.91(m,2H,C4-H or C5-H),1.46(dqd,J=15.0,7.5,4.4 Hz,1H,C11-H),1.38～1.30(m,1H,C11-H),1.09(d,J=7.2 Hz,3H,C13-Me),0.95(t,J=7.4 Hz,3H,C12-Me).13C NMR(126 MHz,MeOD)δ172.4(C-1),167.6(C-7),61.3(C-6),60.0(C-9),46.2(C-3),37.1(C-10),29.5(C-5),25.4(C-11),23.2(C-4),15.5(C-13),12.6(C-12).參照文獻(xiàn)[7]，鑒定該化合物為cyclo-(S-Pro-8-hydroxy-R-Ile).

化合物Ⅳ為黃色油狀(甲醇)，1H NMR(500 MHz,MeOD)δ4.28(dd,J=11.8,4.1 Hz,1H,C6-H),4.15(dd,J=7.0,4.0 Hz,1H,C9-H),3.54(d,J=4.7 Hz,1H,C3-H),3.52(d,J=4.6 Hz,1H,C3-H),2.35～2.27(m,1H,C5-H),2.09～2.03(m,1H,C4-H),2.01(ddd,J=9.6,6.1,2.1 Hz,1H,C10-H),1.96～1.92(m,1H,C4-H),1.91～1.86(m,1H,C11-H),1.54(ddd,J=11.3,6.9,4.0 Hz,1H,C10-H),1.58～1.49(m,1H,C5-H),0.98(d,J=3.2 Hz,3H,C13-Me),0.97(d,J=3.2 Hz,3H,C12-Me).13C NMR(126 MHz,MeOD)δ172.8(C-1),168.9(C-7),60.3(C-6),54.6(C-9),46.4(C-3),39.4(C-10),29.1(C-5),25.8(C-11),23.6(C-4),23.3(C-12),22.2(C-13).經(jīng)查閱文獻(xiàn)，上述數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[8]一致，故鑒定化合物為cyclo(S-Pro-S-Leu).

化合物Ⅴ為黃色油狀(甲醇)，1H NMR(500 MHz,MeOD)δ7.29(d,J=7.2 Hz,2H),7.25(d,J=7.0 Hz,2H),4.46(d,J=4.3 Hz,1H),4.08(dd,J=10.4,6.3 Hz,1H),3.72～3.63(m,1H),3.61(s,1H),3.59～3.51(m,1H),3.42～3.35(m,1H),3.20(dd,J=13.3,4.2 Hz,1H),3.16(dd,J=13.9,4.6 Hz,2H),2.16～2.03(m,1H),1.88～1.72(m,2H),1.29～1.19(m,1H),1.20～1.11(m,2H).13C NMR(126 MHz,MeOD)δ170.9(C-7),166.9(C-1),137.4(C-1′),131.3(C-1′),129.4(C-2′),128.1(C-3′),127.9(C-4′),60.1(C-6),57.7(C-9),45.9(C-3),38.2(C-10),29.6(C-5),22.8(C-4).經(jīng)過數(shù)據(jù)分析，并結(jié)合文獻(xiàn)[9-10]，鑒定該化合物為cyclo-(S-Pro-R-Phe).

化合物Ⅵ為黃色油狀(甲醇)，1H NMR(500 MHz,MeOD)δ7.05(d,J=8.4 Hz,2H,C2′-H,C6′-H),6.71(d,J=8.4 Hz,2H,C3′-H,C5′-H),4.20(t,J=7.1 Hz,2H,C1-H),2.83(t,J=7.1 Hz,2H,C2-H),2.01(s,3H,Me).13C NMR(126 MHz,MeOD)δ172.9(COOCH2),157.1(C-4′),130.9(C-2′,6′),129.9(C-1′),116.0(C-3′,4′),66.6(C-1),35.2(C-2),20.8(Me).經(jīng)文獻(xiàn)查閱，上述數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[11]基本一致，鑒定該化合物為2-(4-hydr oxyphenyl)ethylacetate.

化合物Ⅶ為白色片狀晶體(甲醇)，1H NMR(500 MHz,MeOD)δ7.02(d,J=8.0 Hz,2H,C2-H,C6-H),6.72(d,J=8.0 Hz,2H,C3-H,C5-H),3.68(t,J=7.2 Hz,2H,C1-H),2.71(t,J=7.2 Hz,2H,C2-H).13C NMR(126 MHz,MeOD)δ155.8(C-4′),129.8(C-2′,6′),129.5(C-1′),114.7(C-3′,5′),63.2(C-1),38.01(C-2).上述數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[12-13]基本一致，鑒定該化合物為tyrosol.

化合物Ⅰ—Ⅶ的結(jié)構(gòu)式分別為

2.2 化合物抗癌活性測定

采用MTT實(shí)驗(yàn)方法[14-15]分析化合物Ⅰ—Ⅶ分別對(duì)PC-3和PANC-1這2種腫瘤細(xì)胞系的增殖抑制作用.以紫杉醇為陽性對(duì)照，結(jié)果如表1所示.化合物Ⅰ，Ⅱ和Ⅳ—Ⅶ對(duì)PC-3細(xì)胞具有有意義的抑制作用，化合物Ⅰ—Ⅲ對(duì)PANC-1細(xì)胞具有一定的細(xì)胞毒活性，其中化合物Ⅰ對(duì)腫瘤細(xì)胞PC-3和PANC-1具有相對(duì)較好的抑制活性.

表1 化合物Ⅰ—Ⅶ對(duì)2種腫瘤細(xì)胞的IC501)

3 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)從東海海洋來源的1株卷枝毛霉屬真菌MucorcircinelloidesMNP12010102的發(fā)酵產(chǎn)物中分離鑒定了7個(gè)化合物，其中包括了3個(gè)環(huán)二肽(Ⅲ，Ⅳ，Ⅴ)，2個(gè)甾醇(Ⅰ,Ⅱ)及2個(gè)苯酚類衍生物(Ⅵ,Ⅶ).cyclo-(S-Pro-8-hydroxy-R-Ile)(Ⅲ)，cyclo-(S-Pro-S-Leu)(Ⅳ)和cyclo-(S-Pro-R-Phe)(Ⅴ)為首次從該屬海洋真菌中分離得到，具有一定的細(xì)胞毒性.苯酚類衍生物2-(4-hydr oxyphenyl)ethylacetate(Ⅵ)和tyrosol(Ⅶ)首次從該屬海洋真菌中分離得到，常被用作藥物中間體，對(duì)PC-3細(xì)胞具有一定的抑制作用.體外抗腫瘤活性研究實(shí)驗(yàn)表明，化合物Ⅰ對(duì)腫瘤細(xì)胞PC-3和PANC-1有相對(duì)較好的抑制活性，具有潛在的藥物開發(fā)價(jià)值.

杜克大學(xué)的科學(xué)家2014年7月27日發(fā)表在《自然》(Nature)上的一篇文章發(fā)現(xiàn)，卷枝毛霉菌(Mucorcircinelloides)產(chǎn)生抗藥性的新途徑：表觀RNA可以干擾(RNAi)抑制相關(guān)基因的表達(dá)，進(jìn)而產(chǎn)生暫時(shí)的、可逆的抗藥性.而科學(xué)界一直以來都只知道微生物產(chǎn)生抗藥性的惟一不可逆途徑是：細(xì)菌和真菌在藥物靶點(diǎn)基因產(chǎn)生突變產(chǎn)生抗藥性.這一研究成果引起學(xué)術(shù)界的廣泛關(guān)注，也使得卷枝毛霉菌(Mucorcircinelloides)成為明星微生物，隨著其第二種抗藥性新途徑的發(fā)現(xiàn)，該菌種的特有次級(jí)代謝產(chǎn)物也必將成為科學(xué)家們研究的一個(gè)新熱點(diǎn)[16].

參考文獻(xiàn)：

[1] 朱偉明,王俊鋒.海洋真菌生物活性物質(zhì)研究之管見[J].菌物學(xué)報(bào)，2011，30(2)：218-228.

[2] 王鴻,陳俊，倪建良，等.生物活性導(dǎo)向分離海洋真菌Alternariasp. MNP801次級(jí)代謝產(chǎn)物[J].浙江工業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2014，42(1)：40-44.

[3] KJER J, DEBBAB A, ALY A H, et al. Methods for isolation of marine-derived endophytic fungi and their bioactive secondary products[J]. Nature Protocols，2010，5(3)：479-490.

[4] 陳霞．海洋微生物ENP702#活性分子定點(diǎn)識(shí)別及分離研究[D]．杭州：浙江工業(yè)大學(xué)，2012．

[5] 劉佳佳，袁遙，陳淑娟,等.紅豆杉內(nèi)生真菌產(chǎn)過氧麥角甾醇的分離[J]．天然產(chǎn)物研究與開發(fā)，2010，22(B08)：225-228.

[6] 李尚德,魏美燕,李志華,等．一株紅樹內(nèi)生真菌Penicilliumsp.(ZZF29#)次級(jí)代謝產(chǎn)物的分離與鑒[J].應(yīng)用化學(xué)，2012，29(9)：727-729.

[7] YANG Bin, DONG Jun-de, ZHOU Xue-feng, et al. Proline-containing dipeptides from a marine sponge of a Callyspongia species[J]．Helvetica Chimica Acta，2009，92(6)：1112-1117.

[8] PEDRAS M S C, YU Yang, LIU Jun, et al. Metabolites produced by the phytopathogenic fungus rhizoctonia solani: isolation, chemical structure determination, syntheses and bioactivity[J]. Zeitschrift fur Naturforschung C-Journal of Biosciences，2005，60(9/10)：717-722.

[9] FURTADO N A, PUPO M T, CARVALHO I, et al. Diketopiperazines produced by an Aspergillus fumigatus Brazilian strain[J]. Journal of the Brazilian Chemical Society，2005，16(6B)：1448-1453.

[10] XIE Hai-hui, DAN Yang, WEI Xiao-yi. Diketopiperazines and nucleosides from mycelial cultures of Dichomitus squalens[J]. Chinese Journal of Natural Medicines，2008，6(5)：395-398.

[11] 闕東枚,戴好富,曾艷波,等．見血封喉內(nèi)生真菌Acremoniumsp. J1化學(xué)成分研究[J]．中國藥物化學(xué)雜志，2009，19(3)：200-205.

[12] 唐雨,張瑜,袁久志,等.松花粉化學(xué)成分的分離與鑒定[J]．沈陽藥科大學(xué)學(xué)報(bào),2011,28(6)：429-432.

[13] KWAK J H, KANG M W, ROH J H, et al. Cytotoxic phenolic compounds from Chionanthus retusus[J]. Archives of Pharmacal Research，2009，32(12)：1681-1687.

[14] 梁穎，張曉莉，陶冀，等.紅花多糖對(duì)人肝癌SMMC-7721細(xì)胞增殖的抑制作用[J].中醫(yī)藥學(xué)報(bào)，2011，39(5)：32-35.

[15] 唐嵐,趙亞,單海峰,等.甜瓜蒂中葫蘆素類成分分離及體外抗癌活性研究[J].浙江工業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),2012,40(4):388-391.

[16] SILVIA C, CECELIA S W, SOO C L, et al. Antifungal drug resistance evoked via RNAi-dependent epimutations[EB/OL].[2014-07-27]. http://www.nature.com/nature/journal/vaop/ncurrent/full/nature13575.html.