張明杰

（廣東紫金正天藥業(yè)有限公司，河源 517000）

重組酵母產(chǎn)人IFN-α2a與LL-37融合蛋白的工藝優(yōu)化

張明杰

（廣東紫金正天藥業(yè)有限公司，河源 517000）

通過單因素試驗(yàn)探索重組酵母P. pastoris GS115LI產(chǎn)人LL-37基因與IFN-α2a融合蛋白的最佳條件。結(jié)果顯示，重組酵母菌產(chǎn)蛋白酶的最佳表達(dá)條件是利用BMMY為誘導(dǎo)培養(yǎng)基，以接種量OD600=5.5、溫度26℃、pH6.0、誘導(dǎo)劑（甲醇）為每隔24 h添加1.0%、振蕩速度為200 r/min條件下連續(xù)誘導(dǎo)144 h。在最佳培養(yǎng)條件下，發(fā)酵液中的LL-37最高抗菌活性達(dá)27.9 mm。與初始的發(fā)酵條件相比，人LL-37基因與IFN-α2a融合蛋白的產(chǎn)量提高了32.29%。

干擾素α2a LL-37 工藝

英國科學(xué)家Isaacs和Lindenmann于1957年發(fā)現(xiàn)一種能干擾病毒感染的細(xì)胞因子，命名為干擾素［1］。隨著人類研究的深入，不斷發(fā)現(xiàn)了許多新的干擾素分子。目前，人類在哺乳動物中發(fā)現(xiàn)的干擾素共有10個(gè)家族，其中人干擾素有7個(gè)家族。按其功能和作用方式，可將人干擾素細(xì)分為I型、II型和III型。I型包括α、β、ε、τ、ω、κ，具有抗病毒和抗腫瘤的功能；II 型包括γ，具有調(diào)節(jié)免疫的功能［2］；III型為干擾素樣蛋白，功能與I型類似，但受體不同［3］。人IFN-α2a是由165個(gè)氨基酸殘基構(gòu)成，具有防治病毒性疾病［4］和惡性腫瘤［5］的功能。LL-37是目前在人體內(nèi)發(fā)現(xiàn)的抗菌肽Cathelicedin家族中唯一的成員，對革蘭氏陽性菌和陰性菌均具有較廣譜的抗性［6］。除此之外，LL-37還具有免疫調(diào)節(jié)作用，可趨化單核細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞、中性粒細(xì)胞和肥大細(xì)胞等［7］。當(dāng)人體受到病原微生物、炎癥或創(chuàng)傷刺激，LL-37的表達(dá)水平就會上升［8］。動物試驗(yàn)表明，LL-37可明顯降低銅綠假單胞菌感染小鼠的死亡率［2］。

將人LL-37基因與IFN-α2a融合表達(dá)，形成同時(shí)具有抗病毒、抗腫瘤和抗菌的三重功效的新功能蛋白，在一些特殊的臨床治療中存在潛在的市場需求。本課題組前期的工作實(shí)現(xiàn)了在畢赤酵母（Pichia pastoris）GS115表達(dá)三功能的人LL-37基因與IFN-α2a融合蛋白。在進(jìn)入工業(yè)化生產(chǎn)之前，有必要建立所構(gòu)建的基因工程菌工藝條件，并對產(chǎn)品的應(yīng)用

性能進(jìn)行驗(yàn)證。本研究通過單因素試驗(yàn)旨在探索重組酵母P. pastoris GS115LI產(chǎn)人LL-37基因與IFN-α2a融合蛋白的最佳條件。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗(yàn)菌株 P. pastoris GS115LI，表達(dá)人LL-37基因與IFN-α2a融合蛋白。大腸桿菌（Escherichia coli）ATCC 25922，用于檢測融合蛋白的抗菌活性。

1.1.2 培養(yǎng)基

1.1.2.1 YPD培養(yǎng)基 酵母提取物10 g/L，蛋白胨20 g/L，葡萄糖20 g/L，121℃滅菌30 min。

1.1.2.2 BMGY培養(yǎng)基 見參考文獻(xiàn)［10］。

1.1.2.3 BMMY培養(yǎng)基 同BMGY培養(yǎng)基，僅將其中的甘油10 mL換為甲醇5 mL。

1.1.2.4 初始培養(yǎng)基 種子培養(yǎng)：保藏的菌種先經(jīng)YPD活化，后將入BMGY培養(yǎng)基，接種量2%，后振蕩培養(yǎng)。培養(yǎng)條件：溫度28℃，轉(zhuǎn)速200 r/min，培養(yǎng)時(shí)間24 h。

誘導(dǎo)培養(yǎng)：種子培養(yǎng)液離心去培養(yǎng)液，后接種入BMMY培養(yǎng)液，使酵母OD600值達(dá)6.0，在溫度28℃與轉(zhuǎn)速150 r/min下振蕩培養(yǎng)，每24 h補(bǔ)充甲醇0.5%（體積比）誘導(dǎo)表達(dá)［11］，重復(fù)誘導(dǎo)5次。

1.2 方法

1.2.1 單因素發(fā)酵試驗(yàn)

1.2.1.1 誘導(dǎo)時(shí)長對P. pastoris GS115LI產(chǎn)人LL-37基因與IFN-α2a融合蛋白的影響 按出發(fā)條件進(jìn)行誘導(dǎo)，誘導(dǎo)過程中每12 h取樣分析發(fā)酵液抗菌活性，直至檢測的抗菌活性不再上升。

1.2.1.2 接種量對P. pastoris GS115LI產(chǎn)人LL-37基因與IFN-α2a融合蛋白的影響 按前述確定的最佳誘導(dǎo)時(shí)長，分別調(diào)節(jié)接種量以O(shè)D600計(jì)為3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5和7.0，其它條件不變。誘導(dǎo)完成后取發(fā)酵液分析抗菌活性。

1.2.1.3 溫度對P. pastoris GS115LI產(chǎn)人LL-37基因與IFN-α2a融合蛋白的影響 在出發(fā)條件的基礎(chǔ)上，按前述確定的最佳誘導(dǎo)時(shí)間與接種量，改變誘導(dǎo)溫度，分別置于24℃、26℃、28℃、30℃和32℃下振蕩培養(yǎng)。培養(yǎng)完后取樣檢測產(chǎn)物的抗菌活性。

1.2.1.4 溶氧對P. pastoris GS115LI產(chǎn)人LL-37基因與IFN-α2a融合蛋白的影響 通過改變搖床的轉(zhuǎn)速探索溶氧對重組P. pastoris GS115LI產(chǎn)人LL-37基因與IFN-α2a融合蛋白的影響。分別選擇搖床轉(zhuǎn)速為120、160、240和280 r/min進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)，其它條件參照前述選擇的最佳條件。誘導(dǎo)結(jié)束后取發(fā)酵液分析抗菌活性。

1.2.1.5 誘導(dǎo)劑（甲醇）添加量對P. pastoris GS115-LI產(chǎn)人LL-37基因與IFN-α2a融合蛋白的影響 通過改變誘導(dǎo)劑甲醇的添加量分別對體積比為0.6%、0.8%、1.0%、1.2%、1.4%和1.6%的菌株進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。其它誘導(dǎo)條件為前述所確定的最佳條件。誘導(dǎo)結(jié)束后取發(fā)酵液分析抗菌活性。

1.2.1.6 pH對P. pastoris GS115LI產(chǎn)人LL-37基因與IFN-α2a融合蛋白的影響 為了探索pH對P. pastoris GS115LI產(chǎn)人LL-37基因與IFN-α2a融合蛋白的影響，分別選擇pH為5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5和8.0進(jìn)行試驗(yàn)。其它發(fā)酵條件為前述優(yōu)化的最佳條件。誘導(dǎo)結(jié)束后取發(fā)酵液分析抗菌活性。

1.2.2 驗(yàn)證試驗(yàn) 在上述確定的最適培養(yǎng)和誘導(dǎo)表達(dá)條件下，重復(fù)試驗(yàn)3次，進(jìn)行驗(yàn)證。

1.2.3 發(fā)酵液中人LL-37基因與IFN-α2a融合蛋白的抗菌活性分析 培養(yǎng)液中LL-37的活性測定參照文獻(xiàn)［5］。用E. coli ATCC 25922作為檢測菌種，用雙層瓊脂糖打孔法測定。底層培養(yǎng)基上打直徑3 mm的圓孔，每孔加10 μL發(fā)酵液，37℃孵化3 h后，在底層上覆蓋一層營養(yǎng)瓊脂，37℃繼續(xù)培養(yǎng)20 h，測量無菌生長的透明圈直徑。

2 結(jié)果

2.1 誘導(dǎo)時(shí)長的影響

誘導(dǎo)時(shí)長對P. pastoris GS115LI產(chǎn)人LL-37基因與IFN-α2a融合蛋白的影響結(jié)果（圖1）顯示，誘導(dǎo)開始后的前24 h，發(fā)酵液中檢測出的以抗菌活性表示的融合蛋白產(chǎn)量上升較慢，這可能與菌體本身處于環(huán)境適應(yīng)期的延遲期有關(guān)；而后產(chǎn)量呈直線上升，至第132 h，此后產(chǎn)量緩慢上升，至144 h達(dá)到最大值25.3 mm；此后24 h的誘導(dǎo)期內(nèi)，融合蛋白產(chǎn)量出現(xiàn)輕微下降，可能是由于宿主老化后，產(chǎn)品有所降解引起。根據(jù)以上試驗(yàn)結(jié)果，確定144 h為最佳誘導(dǎo)時(shí)長。

圖1 誘導(dǎo)時(shí)長對P. pastoris GS115LI產(chǎn)人LL-37基因與IFN-α2a融合蛋白的影響

2.2 接種量的影響

接種量對P. pastoris GS115LI產(chǎn)人LL-37基因與IFN-α2a融合蛋白的影響結(jié)果（圖2）顯示，隨著接種量自O(shè)D600=3.5上升，在其它條件不變的情況下，發(fā)酵液中以LL-37抗菌活性表示的人LL-37基因與IFN-α2a融合蛋白逐漸上升，至接種量達(dá)到OD600=5.5后，達(dá)到最大值約26.0 mm；之后，呈現(xiàn)逐漸下降的趨勢。這表明，當(dāng)OD600＜5.5，發(fā)酵液中的酵母濃度太少，導(dǎo)致表達(dá)能力低。在OD600=5.5時(shí)達(dá)到飽和。之后再升高酵母濃度，可能由于營養(yǎng)或溶氧供應(yīng)受限，從而導(dǎo)致產(chǎn)物的合成能力不升反降。在此，選擇接種量為OD600≈5.5作為最佳的接種條件。

圖2 接種量對P. pastoris GS115LI產(chǎn)人LL-37基因與IFN-α2a融合蛋白的影響

2.3 溫度的影響

溫度對P. pastoris GS115LI產(chǎn)人LL-37基因與IFN-α2a融合蛋白的影響結(jié)果（圖3）顯示，在溫度為26℃時(shí)，以抗菌活性表示的人LL-37基因與IFN-α2a融合蛋白產(chǎn)量最高，可達(dá)26.5 mm以上。溫度低于26℃，產(chǎn)量會有所下降，可能與低溫下酵母代謝活性受影響有關(guān)。溫度高于26℃，產(chǎn)量也出現(xiàn)下降，可能與在溫度高時(shí)，酵母自身代謝加快后，衰老同樣加快的原因。綜合上述情況，選擇26℃作為誘導(dǎo)時(shí)的最佳溫度條件。

圖3 溫度對P. pastoris GS115LI產(chǎn)人LL-37基因與IFN-α2a融合蛋白的影響

2.4 溶氧的影響

在搖瓶階段，溶氧難以直接測定，故只能采用以搖床振蕩轉(zhuǎn)速為依據(jù)來進(jìn)行探索。溶氧對P. pastoris GS115LI產(chǎn)人LL-37基因與IFN-α2a融合蛋白的影響結(jié)果（圖4）顯示，在振蕩轉(zhuǎn)速低于200 r/min時(shí)，由于溶氧處于受限狀態(tài)，故以抗菌活性表示的人LL-37基因與IFN-α2a融合蛋白產(chǎn)量較低。振蕩轉(zhuǎn)速高于200 r/min后，產(chǎn)量不再繼續(xù)上升，表明此階段溶氧已經(jīng)到達(dá)飽和。綜合考慮效應(yīng)與成本，選擇200 r/min作為誘導(dǎo)表達(dá)時(shí)最佳的溶氧控制條件。

圖4 溶氧對P. pastoris GS115LI產(chǎn)人LL-37基因與IFN-α2a融合蛋白的影響

2.5 誘導(dǎo)劑（甲醇）添加量的影響

誘導(dǎo)劑（甲醇）添加量對P. pastoris GS115LI產(chǎn)

人LL-37基因與IFN-α2a融合蛋白的影響結(jié)果（圖5）顯示，甲醇濃度添加量為1.0%（以體積比計(jì)，下同）時(shí)，以抗菌活性計(jì)的人LL-37基因與IFN-α2a融合蛋白表達(dá)量達(dá)最大，約為27 mm。低于1.0%，可能是由于誘導(dǎo)的強(qiáng)度不夠，表達(dá)速度下降，致使產(chǎn)物產(chǎn)量下降。高于1.0%，可能是由于誘導(dǎo)強(qiáng)度太大，超出了宿主菌的代謝負(fù)荷，反而產(chǎn)生負(fù)作用，從而也使表達(dá)量下降。綜合考慮選擇1.0%為誘導(dǎo)的最佳甲醇用量。

圖5 甲醇添加量對P. pastoris GS115LI產(chǎn)人LL-37基因與IFN-α2a融合蛋白的影響

2.6 pH的影響

pH對P. pastoris GS115LI產(chǎn)人LL-37基因與IFN-α2a融合蛋白的影響結(jié)果（圖6）顯示，試驗(yàn)條件下，pH6.0時(shí)人LL-37基因與IFN-α2a融合蛋白的表達(dá)量最高，達(dá)到27.5 mm以上。pH主要通過影響細(xì)胞膜及基質(zhì)的帶電狀態(tài)，從而影響膜對基質(zhì)的通透性，再傳遞到對產(chǎn)物產(chǎn)量的影響。酵母的最適生長pH為偏酸性的環(huán)境，此處產(chǎn)物最佳表達(dá)量所需的pH6.0，恰好可在不影響宿主本身生長條件下實(shí)現(xiàn)產(chǎn)物的最佳表達(dá)，故確定pH6.0為最佳條件。

圖6 pH對P. pastoris GS115LI產(chǎn)人LL-37基因與IFN-α2a融合蛋白的影響

2.7 最佳工作條件驗(yàn)證

根據(jù)前面的試驗(yàn)結(jié)果，確定P. pastoris GS115LI產(chǎn)人LL-37基因與IFN-α2a融合蛋白的最佳工藝條件為利用BMMY培養(yǎng)基，接種量以O(shè)D600計(jì)為5.5、溫度26℃、pH6.0、誘導(dǎo)劑（甲醇）為每隔24 h添加1%、振蕩速度為200 r/min條件下連續(xù)誘導(dǎo)144 h。在該工藝條件下重復(fù)驗(yàn)證3次，得到結(jié)果（以LL-37抗菌活性計(jì)）分別為27.8、28.1和27.9 mm，平均值為27.93±0.12（mm）。該結(jié)果與出發(fā)培養(yǎng)條件下的表達(dá)量（21.1 mm，參考1.2.1.1誘導(dǎo)時(shí)間120 h時(shí)的結(jié)果）相比，產(chǎn)物產(chǎn)量提高了32.39%。

3 討論

LL-37作為人源性抗菌肽，已經(jīng)在臨床上獲得廣泛的應(yīng)用。由于其分子小，與其它蛋白多肽或蛋白類藥物融合表達(dá)時(shí)，不易對與其融合蛋白的功能產(chǎn)生影響，因此將LL-37與其它蛋白融合表達(dá)生產(chǎn)多功能藥物成為可能［13］。例如，將LL-37與人酸性成纖維細(xì)胞生長因子融合表達(dá)形成的新蛋白，既具有酸性成纖維細(xì)胞生長因子促進(jìn)傷口愈合的功能，又具有防止傷口感染的功能［14］。受此思路的啟發(fā)，將LL-37與人IFN-α2a融合表達(dá)，構(gòu)建出了同時(shí)具有抗癌、抗病毒和抗菌的三效藥物。發(fā)酵工藝是將構(gòu)建的蛋白轉(zhuǎn)化為產(chǎn)物的關(guān)鍵。

從單因素試驗(yàn)的各因素變化所引起的人LL-37基因與IFN-α2a融合蛋白表達(dá)水平的波動情況分析，接種量、時(shí)間和pH是3個(gè)較為敏感的量，其它屬于次敏感量，這可能預(yù)示著這些因素對表達(dá)產(chǎn)量的關(guān)鍵程度。接種量主要影響發(fā)酵時(shí)延遲期的長短和菌體與營養(yǎng)之間的協(xié)調(diào)關(guān)系。接種量小，延遲期長，產(chǎn)物合成量低；接種量大，菌體濃度高，會引起營養(yǎng)競爭［15］。pH不僅影響宿主菌對外源基因的表達(dá)，同時(shí)也可能對產(chǎn)物的穩(wěn)定性及活性產(chǎn)生影響［16］。適宜的培養(yǎng)條件，有利于提高細(xì)胞的相對活性和延長細(xì)胞的高相對活性狀態(tài)，從而實(shí)現(xiàn)融合蛋白產(chǎn)量的最大化累積［17，18］。各因素之間的影響還需要通過正交試驗(yàn)或序貫試驗(yàn)設(shè)計(jì)，利用統(tǒng)計(jì)學(xué)的原理進(jìn)行詳細(xì)分析。

試驗(yàn)中為了操作的方便，僅以LL-37的抗菌

活性進(jìn)行表征。經(jīng)過在菌種構(gòu)建階段的試驗(yàn)確認(rèn)，LL-37的抗菌活性檢測與IFN-α2a干擾素活性檢測結(jié)果是相一致的，表明二者既實(shí)現(xiàn)了融合，而且融合蛋白還同時(shí)保留了二者各自獨(dú)立時(shí)的活性（結(jié)果發(fā)表在本課題組另一篇文章中）。

本試驗(yàn)所有數(shù)據(jù)均是建立在搖瓶的試驗(yàn)基礎(chǔ)之上的。眾所周知，搖瓶并不能真正代替發(fā)酵罐的生產(chǎn)，因此本試驗(yàn)的結(jié)果還只能是發(fā)酵生產(chǎn)的參考。在達(dá)到生產(chǎn)水平之前，還需通過小型發(fā)酵罐進(jìn)一步優(yōu)化工藝參數(shù)，再逐步放大至生產(chǎn)規(guī)模。

4 結(jié)論

本研究確定了重組畢赤酵母P. pastoris GS115LI產(chǎn)人LL-37基因與IFN-α2a融合蛋白的最佳工藝條件為利用BMMY培養(yǎng)基、接種量以O(shè)D600=5.5、溫度26℃、pH6.0、誘導(dǎo)劑（甲醇）為每隔24 h添加1%、振蕩速度為200 r/min條件下連續(xù)誘導(dǎo)144 h。與出發(fā)條件相比，產(chǎn)量提高了32.29%。

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（責(zé)任編輯 馬鑫）

The Process Optimization of Pichia pastoris GS115LI for Producing Fused Protein of LL-37 and IFN-α2a

Zhang Mingjie
（Pharmaceutical Co.，Ltd. Guangdong Zijing Zhengtian，Heyuan 517000）

With experiments of single factor, the optimal process of recombinant P. pastoris GS115LI for producing fused protein of LL-37 and IFN-α2a were using BMMY as inducing medium, inoculum as OD600=5.5, temperature as 26℃, pH6.0, inducing chemical（methanol）adding amount as 1.0% every 24 h, incubating shaking speed as 200 r/min, and inducing time as 144 h. Under those optimal conditions, the 27.9 mm of LL-37 antimicrobial activity could be gotten. Compared with the original conditions, the productivity of fused protein of LL-37 and IFN-α2a was increased as 32.29%.

Interferon-α2a LL-37 Fermentation process

2014-03-18

廣東省重大科技專項(xiàng)（2011A080502011）

張明杰，教授，研究方向：微生物工程技術(shù)；E-mail：mingjiezh@126.com