許杭杰+李婧+張全+周聰+陸美婭+葉景甲

摘要：綜述了光譜方法在農(nóng)藥與DNA相互作用研究中的應(yīng)用，重點(diǎn)介紹了紫外光譜法、熒光光譜法、圓二色光譜法、紅外光譜法、共振光散射和拉曼光譜法等的原理和應(yīng)用。光譜法不但是研究農(nóng)藥與DNA相互作用的有效工具，同時(shí)也可以加強(qiáng)對(duì)農(nóng)藥的遺傳毒性分子機(jī)理的理解。

關(guān)鍵詞：光譜法；農(nóng)藥；DNA；相互作用

中圖分類號(hào)：TQ450.2 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：0439-8114（2014）01-0005-03

Spectroscopic Analyses on the Interaction of Pesticides and DNA

XU Hang-jie，LI Jing，ZHANG Quan，ZHOU Cong，LU Mei-ya，YE Jing-jia

（Environmental Science Research Center， Zhejiang University of Technology， Hangzhou 310032， China）

Abstract： Analyzing the interaction of DNA and pesticides with spectrometry including ultraviolet-visible absorption spectroscopy， fluorescent spectroscopy， circular dichroism spectroscopy， infrared spectroscopy， resonance light scattering spectroscopy and Raman spectroscopy was reviewed. Results showed that spectroscopy was highly effective and powerful for studing the interaction of DNA and pesticides， and would promote understanding molecular mechanisms of the genotoxicity of pesticides.

Key words： spectroscopy； pesticide； DNA； interaction

收稿日期：2013-06-25

基金項(xiàng)目：中國博士后科學(xué)基金面上項(xiàng)目（2012M521180）

作者簡介：許杭杰（1989-），男，浙江杭州人，在讀碩士研究生，研究方向?yàn)檗r(nóng)藥與DNA的相互作用，（電話）0571-88320265（電子信箱）

xuhj-tobe-ceo@163.com；通訊作者，張 全，博士，（電子信箱）quanzhang@zju.edu.cn。

農(nóng)藥是一類由人類主動(dòng)投放到環(huán)境當(dāng)中用來防治農(nóng)作物病蟲草害和其他有害生物的藥劑的統(tǒng)稱。隨著社會(huì)的發(fā)展和農(nóng)業(yè)集約化要求的不斷加強(qiáng)，對(duì)農(nóng)藥的需求也在不斷增加，在今后相當(dāng)長的時(shí)間內(nèi)農(nóng)藥的作用是不可替代的。然而大量的事實(shí)證明，農(nóng)藥的廣泛使用已經(jīng)成為環(huán)境污染的重要原因之一。DNA是生物體的重要組成部分，是生物遺傳信息的主要載體。農(nóng)藥能通過飲食、呼吸、皮膚接觸等途徑進(jìn)入機(jī)體，可能與DNA相互作用后不同程度地導(dǎo)致DNA的結(jié)構(gòu)及其功能的變化，對(duì)生物體產(chǎn)生持久性危害[1-4]，進(jìn)而引發(fā)潛在的生態(tài)安全和健康風(fēng)險(xiǎn)。因此，關(guān)于農(nóng)藥與DNA之間相互作用而導(dǎo)致遺傳物質(zhì)誘變已成為當(dāng)今研究的熱點(diǎn)[5]。

農(nóng)藥與DNA的作用方式主要有三種：非共價(jià)鍵結(jié)合、共價(jià)鍵結(jié)合和剪切作用。其中非共價(jià)鍵結(jié)合又可分為靜電結(jié)合、溝槽結(jié)合和嵌插結(jié)合[6]。農(nóng)藥與DNA作用后可能導(dǎo)致DNA構(gòu)象變化、鏈聚合或斷裂、堿基脫落、堿基被修飾、交聯(lián)、重組等[7-9]，亦即體系的結(jié)構(gòu)和化學(xué)性質(zhì)會(huì)發(fā)生一定變化（圖1）。人們采用多種方法（生物學(xué)方法、光譜法、電化學(xué)法和色譜法等）從不同角度探索這些變化，進(jìn)而判斷作用方式和闡述作用機(jī)理[10]。本文綜述了常用于研究農(nóng)藥與DNA相互作用的光譜方法原理和應(yīng)用。

1 紫外可見光譜法

紫外可見光譜法是研究農(nóng)藥與DNA相互作用的一種最方便、最常用的技術(shù)[11]。小分子與DNA的相互作用會(huì)引起吸收帶的紅移（藍(lán)移）現(xiàn)象或增色（減色）效應(yīng)。增色效應(yīng)是DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)被破壞的結(jié)果，減色效應(yīng)則是DNA分子軸向收縮、構(gòu)象變化的結(jié)果。吸光度減小、吸收帶紅移以及等吸收點(diǎn)的形成是小分子與生物DNA發(fā)生嵌插作用的光譜標(biāo)志[12]。嵌插作用對(duì)DNA的雙螺旋結(jié)構(gòu)起穩(wěn)定作用，可導(dǎo)致熔鏈溫度Tm值增大5～8 ℃，而非嵌插作用的小分子不會(huì)使Tm值增大得如此明顯。邵華等[11]已采用紫外光譜法研究農(nóng)藥的DNA加合作用，結(jié)果表明馬拉硫磷、呋喃丹、氯氰菊酯及兩兩混配后均可能與哺乳動(dòng)物DNA結(jié)合，引起DNA的紫外譜圖發(fā)生明顯的波長位移，甚至產(chǎn)生新的波峰[12]。Farhad等[13]也利用紫外和熒光光譜法發(fā)現(xiàn)二嗪農(nóng)能使小牛胸腺DNA（Calf thymus DNA，ct DNA）光譜產(chǎn)生藍(lán)移。此外，劉偉等[14]研究了農(nóng)藥毒死蜱對(duì)小牛胸腺DNA和蠶豆根尖細(xì)胞的損傷作用。結(jié)果表明，它使得小牛胸腺DNA吸收光譜在207 nm處的吸收峰出現(xiàn)紅移現(xiàn)象，隨著藥劑濃度的增加，譜圖出現(xiàn)了減色效應(yīng)。

2 熒光光譜法

熒光光譜法作為一種快速、靈敏的光譜分析方法也廣泛用于農(nóng)藥與DNA相互作用的研究。通過對(duì)熒光參數(shù)（如熒光偏振、熒光強(qiáng)度等）的測(cè)定，可獲得許多關(guān)于農(nóng)藥與DNA相互作用的信息。農(nóng)藥與DNA作用后熒光偏振的變化是判斷農(nóng)藥是否與DNA發(fā)生嵌插作用的標(biāo)志之一。借助熒光強(qiáng)度的變化，可測(cè)得農(nóng)藥與DNA的結(jié)合常數(shù)、結(jié)合位點(diǎn)數(shù)和作用方式等。

對(duì)于熒光很弱的農(nóng)藥，可借助熒光探針進(jìn)行研究。溴化乙錠（Ethidium bromide，EB）是較為常用的一類探測(cè)農(nóng)藥與DNA相互作用的熒光探針，利用EB-DNA體系的熒光變化，可判定農(nóng)藥與DNA的作用方式。孟慶翔等[15]選用溴化乙錠（EB）為熒光探針，考察了阿特拉津濃度、磷酸鹽、離子強(qiáng)度以及碘化鉀對(duì)系統(tǒng)熒光的影響。結(jié)果表明，阿特拉津?qū)tDNA-EB體系的熒光存在淬滅現(xiàn)象，并同時(shí)存在靜態(tài)和動(dòng)態(tài)兩種淬滅方式。張立金等[16]對(duì)農(nóng)藥甲萘威（Carbaryl）對(duì)ct DNA的損傷作用也進(jìn)行了初步的探討，證明甲萘威的確對(duì)DNA具有一定的損傷作用，而這種損傷可能和甲萘威與DNA的相互作用有關(guān)。

3 圓二色光譜法

圓二色光譜（Circular dichroism，CD）是測(cè)定樣品對(duì)左、右旋偏振光的吸光度差。樣品是否有圓二色性取決于樣品的發(fā)色團(tuán)是否具有手性。一般可通過農(nóng)藥對(duì)DNA的圓二色信號(hào)的改變判斷DNA構(gòu)象的變化，如果DNA在280 nm附近圓二色信號(hào)無變化，可排除農(nóng)藥與DNA作用方式是嵌插作用。Soheila等[17]對(duì)二嗪農(nóng)對(duì)DNA的CD光譜進(jìn)行了研究，結(jié)果在280 nm處發(fā)現(xiàn)峰形未發(fā)生變化，表明二嗪農(nóng)與DNA的作用是非嵌插作用。Farhad等[18]用CD證明了有機(jī)氯殺蟲劑2，4-D與DNA亦可發(fā)生作用。

4 紅外光譜法

當(dāng)紅外光照射時(shí)，物質(zhì)的分子將吸收紅外輻射，引起分子的振動(dòng)和轉(zhuǎn)動(dòng)能級(jí)間的躍遷，所產(chǎn)生的分子吸收光譜成為紅外吸收光譜。近年來，傅里葉變換紅外光譜法在小分子與DNA相互作用的研究中得到了廣泛應(yīng)用。文獻(xiàn)[19]報(bào)道了致癌物質(zhì)Diethylstilbestrol（DES）與ct DNA之間的作用模式、結(jié)合常數(shù)、序列選擇性以及DNA結(jié)構(gòu)和構(gòu)象的變化情況。當(dāng)DES濃度較低時(shí)，A·T富集區(qū)是DES與DNA發(fā)生嵌插作用的主要位點(diǎn)，伴隨著這種嵌插結(jié)合過程，DNA逐漸由B型向A型轉(zhuǎn)變；當(dāng)DES藥物濃度較高時(shí)，DES與G·C堿基發(fā)生作用，并削弱了DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性。Zhou等[20]通過紅外等光譜手段研究了聚二烯丙基二甲基氯化銨（PDDA）與DNA之間的作用方式。紅外光譜研究結(jié)果表明，PDDA與DNA分子中的堿基和磷酸基團(tuán)發(fā)生了作用，且DNA/PDDA復(fù)合物的形成導(dǎo)致DNA二級(jí)結(jié)構(gòu)構(gòu)象發(fā)生了變化。

5 共振光散射和拉曼光譜法

共振光散射技術(shù)一般檢測(cè)物體的共振瑞利光信號(hào)。利用農(nóng)藥誘導(dǎo)DNA共振光信號(hào)的變化可探測(cè)DNA的構(gòu)象變化、聚集和超螺旋結(jié)構(gòu)的形成，進(jìn)而推斷農(nóng)藥與DNA的作用方式[21，22]。拉曼光譜屬于振動(dòng)光譜，共振拉曼效應(yīng)極大提高了拉曼光譜的靈敏度。拉曼光譜法對(duì)農(nóng)藥與DNA的分析主要研究其構(gòu)象的變化、堿基的損傷、氫鍵的斷裂和單雙鏈的斷裂等。周殿鳳等[23]的研究結(jié)果表明，ct DNA在253.7 nm處受到紫外輻射的損傷作用最嚴(yán)重，DNA的構(gòu)象受到破壞，DNA的構(gòu)型發(fā)生變化，部分單雙鍵發(fā)生斷裂，出現(xiàn)了各種各樣由于DNA鍵斷裂產(chǎn)生的多核苷酸。Wen等[24]運(yùn)用拉曼光譜對(duì)病毒DNA在不同波段處的吸收進(jìn)行了研究。

綜上所述，光譜方法在農(nóng)藥與DNA相互作用的研究中應(yīng)用十分廣泛，不同的光譜法互相驗(yàn)證可提供更準(zhǔn)確的信息。紫外方法檢測(cè)紫外吸收的差別有簡單、準(zhǔn)確的特點(diǎn)，但紫外可見光譜反映的信息量有限；熒光光譜有多種熒光參數(shù)可利用，能推斷農(nóng)藥與DNA的結(jié)合常數(shù)、結(jié)合位點(diǎn)數(shù)和作用方式等；而且紫外方法和熒光方法又常受限于一些物質(zhì)，如紫外吸收信號(hào)或熒光信號(hào)弱，又或與DNA光譜重疊等問題。圓二色譜、紅外色譜、共振光散射和拉曼光譜法都是檢測(cè)DNA結(jié)構(gòu)變化的有效方法，圓二色譜對(duì)手性分子的檢測(cè)具有一定的優(yōu)勢(shì)，有可能在手性農(nóng)藥與DNA相互作用的研究中發(fā)揮更大的作用。紅外光譜由于受水的紅外吸收的影響而限制了其在水溶液體系中的應(yīng)用。因此，研究農(nóng)藥與DNA的相互作用常要求結(jié)合多種光譜方法互相驗(yàn)證。

6 展望

目前，關(guān)于農(nóng)藥與DNA相互作用的研究主要集中在少數(shù)幾種農(nóng)藥上，且基本上使用紫外光譜法、熒光光譜法和彗星實(shí)驗(yàn)這三種方法來評(píng)價(jià)農(nóng)藥對(duì)DNA的損傷作用。如果再結(jié)合其他的分析技術(shù)如電化學(xué)方法等從不同角度進(jìn)行多方位、多層次的研究，對(duì)農(nóng)藥與DNA作用的方式和機(jī)理的了解會(huì)更加深入。此外，隨著手性農(nóng)藥在目前使用的農(nóng)藥中所占比例越來越大，以及它們?cè)谏矬w上表現(xiàn)出的潛在生物效應(yīng)如毒性、致癌性、致突變性等對(duì)映體的選擇性[25]，建立一種能夠準(zhǔn)確可靠的研究手性農(nóng)藥對(duì)映體水平上遺傳毒性的差異的快速評(píng)價(jià)方法將顯得尤為重要，因此開展手性農(nóng)藥與DNA相互作用研究的光譜法研究是一個(gè)重要的領(lǐng)域，能為手性農(nóng)藥的環(huán)境安全性評(píng)價(jià)提供更為寶貴的科學(xué)依據(jù)。

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（責(zé)任編輯 王貴春）

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（責(zé)任編輯 王貴春）