季遷，劉芳，李敏

（1.沈陽(yáng)醫(yī)學(xué)院附屬衛(wèi)校，沈陽(yáng)110034；2.沈陽(yáng)醫(yī)學(xué)院附屬中心醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，沈陽(yáng)110024）

載脂蛋白E基因啟動(dòng)子-491 A/T、-427C/T多態(tài)性與血管性癡呆關(guān)系研究

季遷1，劉芳2，李敏1

（1.沈陽(yáng)醫(yī)學(xué)院附屬衛(wèi)校，沈陽(yáng)110034；2.沈陽(yáng)醫(yī)學(xué)院附屬中心醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，沈陽(yáng)110024）

Correlation Study between Apolipoprotein E Promoter-491 A/T，-427C/T Polymorphismsand Vascular Dementia

選擇沈陽(yáng)醫(yī)學(xué)院附屬中心醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科血管性癡呆患者480例為實(shí)驗(yàn)組，從門診體檢健康老年人中收集480例為對(duì)照組。分別提純患者外周血中基因組DNA，檢測(cè)載脂蛋白E基因啟動(dòng)子多態(tài)性表達(dá)，探討載脂蛋白E基因啟動(dòng)子多態(tài)性與血管性癡呆的關(guān)系。結(jié)果表明，載脂蛋白E基因啟動(dòng)子-491多態(tài)性位點(diǎn)基因型AA表達(dá)在實(shí)驗(yàn)組明顯多于對(duì)照組（P＜0.05）。因此認(rèn)為載脂蛋白E基因啟動(dòng)子-491多態(tài)性位點(diǎn)基因型AA表達(dá)與血管性癡呆疾病相關(guān)。

血管性癡呆；載脂蛋白E基因；啟動(dòng)子多態(tài)性

血管性癡呆（vascular denlentia，VD）是僅次于阿爾茨海默?。ˋlzheimer disease，AD）的常見癡呆類型，隨著我國(guó)人口的老齡化加劇，VD發(fā)病率逐年增加。VD由各種腦血管疾病導(dǎo)致，盡管臨床上給予積極的治療，但致殘率仍很高。因此對(duì)VD發(fā)病機(jī)制與防治措施的研究具有極其重要的現(xiàn)實(shí)意義。目前流行病學(xué)的研究已表明載脂蛋白E（apolipoprotein E，APOE）是血漿主要載脂蛋白之一，它參與機(jī)體脂質(zhì)代謝，調(diào)節(jié)膽固醇平衡，同時(shí)參與神經(jīng)系統(tǒng)的正常生長(zhǎng)和損傷后的修復(fù)過程。APOE基因及其啟動(dòng)子的多態(tài)性在不同種族人群中分布不同，不同的多態(tài)性位點(diǎn)與VD的關(guān)聯(lián)程度不同［1］。

本項(xiàng)目負(fù)責(zé)人在美期間首次證實(shí)北美人群APOE基因啟動(dòng)子多態(tài)性變化與血管性癡呆相關(guān)［2］。本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用病例對(duì)照研究，分析沈陽(yáng)醫(yī)學(xué)院附屬中心醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科480例VD患者APOE基因啟動(dòng)子多態(tài)性與VD之間的關(guān)系，為VD的早預(yù)測(cè)早治療提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象

選取2007年11月至2012年7月沈陽(yáng)醫(yī)學(xué)院附屬中心醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科住院的480例VD患者（VD組），病例入選條件以通用的NINDS-AIREN作為診斷標(biāo)準(zhǔn)［3］：（1）符合癡呆診斷：有記憶障礙以及至少有2個(gè)其他認(rèn)知領(lǐng)域的障礙；（2）有腦血管病的證據(jù)，即CT或MRI影像學(xué)檢查證據(jù)；（3）前2項(xiàng)必須有相關(guān)性，至少有以下的1項(xiàng)：①在明確的卒中后3個(gè)月內(nèi)發(fā)生癡呆；②突然認(rèn)識(shí)功能衰退，或波動(dòng)性、階梯樣進(jìn)行性認(rèn)知功能損害。

從門診體檢健康老年人中收集480例作為對(duì)照組。VD組與對(duì)照組在性別、年齡、體重指數(shù)、高血壓及糖尿病病史方面均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）。見表1。

表1 VD組與對(duì)照組的一般資料比較

1.2 方法

從患者廢棄血液標(biāo)本的外周血白細(xì)胞中提取基因組DNA?；颊吆炇鹬橥鈺瑢?shí)驗(yàn)符合醫(yī)學(xué)倫理學(xué)標(biāo)準(zhǔn)。應(yīng)用DNA聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）擴(kuò)增技術(shù)進(jìn)行APOE基因啟動(dòng)子區(qū)域擴(kuò)增，其產(chǎn)物用DNA測(cè)序儀（美國(guó)Peabi公司，310型）測(cè)序。

PCR擴(kuò)增APOE基因啟動(dòng)子，第1輪PCR引物序列：上游引物5′-CTC CAG AAT CCT AAC CTT AAC CCA GAA G-3′，下游引物5′-GTG GAG TCC TGC TAT GGC TTA CAT C-3′，PCR反應(yīng)體系和擴(kuò)增條件：用普通Taq酶，PCR反應(yīng)體系25 μL，DNA模板1 μL，上游引物（20 μmol/L）：0.5 μL，下游引物（20 μmol/L）：0.5 μL，Taq聚合酶：0.125 μL，PCR buffer2.0 μL，dNTP：2.0 μL，雙蒸水：18.375 μL。PCR反應(yīng)條件：94.0℃預(yù)變性5 min，反應(yīng)循環(huán)：變性94.0℃30 s，退火61.0℃30 s，延伸72℃1 min 30 s，循環(huán)30次，最后72℃延伸10 min。反應(yīng)結(jié)束后，用2%瓊脂糖凝膠電泳，電壓150 V，32 min。

第2輪PCR：上游引物5′-TCA AGC GAT TCT CCT GCC TCA G-3′，下游引物5′-AGT AAT ACA GAC ACC CTC CTC CAT TC-3′。PCR擴(kuò)增條件：PCR反應(yīng)的DNA模板為第1次PCR反應(yīng)液稀釋50倍后取2 μL，反應(yīng)體系同前。反應(yīng)條件：將72℃延伸1 min 30 s設(shè)定為1 min，選擇60.3℃作為第2輪PCR的退火溫度，產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 13.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理，組間比較采用χ2檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

PCR產(chǎn)物純化后測(cè)序結(jié)果顯示：VD組患者APOE基因啟動(dòng)子-491多態(tài)性基因型AA 258例，AT 164例，TT 58例；對(duì)照組APOE基因啟動(dòng)子-491多態(tài)性基因型AA 214例，AT 174例，TT 92例。VD組基因型AA明顯多于對(duì)照組，基因型AT及TT對(duì)照組明顯多于VD組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。VD組APOE基因啟動(dòng)子-427 TT 176例，CT 168例，CC 136例；對(duì)照組APOE基因啟動(dòng)子-427基因型為TT 158例，CT 166例，CC 156例。2組APOE基因啟動(dòng)子-427多態(tài)性位點(diǎn)基因型分布均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）。見圖1。

圖1 單核苷酸序列分析

3 討論

目前，對(duì)APOE基因多態(tài)性與VD關(guān)系的研究較少，結(jié)論幾乎均為陰性。APOE基因多態(tài)性與AD有密切關(guān)系［4～7］。APOE主要存在于乳糜微粒、極低密度脂蛋白、低密度脂蛋白和部分高密度脂蛋白中，為多態(tài)性蛋白，有3個(gè)常見的異構(gòu)體，即E2、E3和E4。各種APOE異構(gòu)體的主要區(qū)別是氨基酸一級(jí)結(jié)構(gòu)的不同，它涉及到半胱氨酸（Cys）和精氨酸（Arg）的交換：E3含1個(gè)Cys（第112位）；E4不含Cys，但比E3多1個(gè)Arg（第112位）；E2含2個(gè)Cys，但比E3少1個(gè)Arg（第158位）。這種單個(gè)氨基酸不同造成的異構(gòu)體是由于APOE基因的多態(tài)性所決定的。已知APOE異構(gòu)體是由3個(gè)等位基因編碼，人群中有6種表型，即3種純合子：E2/E2、E3/E3和E4/ E4，3種雜合子：E4/E3、E4/E2和E3/E2。在不同的人群中3個(gè)不同的APOE等位基因（Ε2、Ε3、Ε4）分布頻率存在不同，因而決定了不同人群中APOE表型的頻率差異。APOE基因啟動(dòng)子區(qū)域存在著多個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)：-491A/T，-427C/T，-219 G/T，+113G/T等，由于其位置與基因編碼區(qū)緊密關(guān)聯(lián)，因而啟動(dòng)子多態(tài)性變化可改變APOE基因表達(dá)、表型分布及功能，從而影響APEO蛋白質(zhì)表達(dá)。

VD的發(fā)生是個(gè)多因素的過程，可能是腦血管損傷、阿爾茨海默病樣組織結(jié)構(gòu)變化、白質(zhì)疏松以及衰老等綜合作用的結(jié)果［8］。APOE對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)有明顯的影響，它參與神經(jīng)系統(tǒng)的生理和病理過程，與神經(jīng)系統(tǒng)的某些變性疾病、腦血管疾病、水腫性損傷等多種臨床常見病有關(guān)［9］，其位點(diǎn)的多態(tài)性可能是大多數(shù)VD患者的危險(xiǎn)因素。為更好地平衡可能的混雜因素，增強(qiáng)檢驗(yàn)效率，提高可信性，本研究采用對(duì)照實(shí)驗(yàn)分析APOE基因的啟動(dòng)子多態(tài)性與VD的關(guān)聯(lián)。結(jié)果顯示：VD組APOE基因啟動(dòng)子-491多態(tài)性位點(diǎn)基因型AA明顯多于對(duì)照組，基因型AT及TT對(duì)照組明顯少于對(duì)照組（P＜0.05），由此推測(cè)APOE基因啟動(dòng)子-491位點(diǎn)的基因型AA表達(dá)差異與VD相關(guān)?？赡苁悄X血管病后APOEmRNA表達(dá)上調(diào)，影響神經(jīng)修復(fù)，加重神經(jīng)組織損傷，從而導(dǎo)致VD。這與在北美人群APOE基因啟動(dòng)子-491多態(tài)性與VD密切相關(guān)的結(jié)論一致［10］。實(shí)驗(yàn)結(jié)果還顯示VD組與對(duì)照組之間APOE基因啟動(dòng)子-427位點(diǎn)多態(tài)性分布差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），但此結(jié)果不能完全確定-427位點(diǎn)多態(tài)性不是VD的危險(xiǎn)因素，因APOE等位基因僅1/3為人類共有，其分布頻率存在差異，與種族和地域因素有關(guān)。

綜上所述，載脂蛋白E基因啟動(dòng)子-491位點(diǎn)基因型AA可能誘導(dǎo)血管性癡呆的發(fā)生。本地區(qū)人群APOE基因啟動(dòng)子區(qū)域其他多態(tài)性位點(diǎn)與VD的關(guān)系還有待進(jìn)一步深入研究。

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（編輯 武玉欣）

R743

A

0258-4646（2014）11-1036-03

沈陽(yáng)市科技局科研基金（f10217100）

季遷（1968-），女，高級(jí)講師，碩士.

劉芳，E-mail：liufangrui2014@163.com

2014-07-07

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