王露，王薇，楊咪咪，包國榮，索琳娜，張微

（1.中國醫(yī)科大學(xué)附屬第四醫(yī)院內(nèi)分泌科，沈陽110032；2.山西醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院2010級預(yù)防醫(yī)學(xué)，太原030001）

血清SOD、MDA、NO在波動(dòng)性高血糖糖尿病大鼠中的表達(dá)

王露1，王薇1，楊咪咪2，包國榮1，索琳娜1，張微1

（1.中國醫(yī)科大學(xué)附屬第四醫(yī)院內(nèi)分泌科，沈陽110032；2.山西醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院2010級預(yù)防醫(yī)學(xué)，太原030001）

目的觀察血糖波動(dòng)對糖尿病大鼠血清超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）、一氧化氮（NO）表達(dá)水平的影響。方法SD大鼠60只，隨機(jī)分成正常飼料喂養(yǎng)組（正常組，n=20）和高糖高脂飼料喂養(yǎng)模型組（模型組，n=40），模型組SD大鼠6周后用小劑量鏈尿佐菌素（STZ）建立SD大鼠糖尿病模型，之后隨機(jī)分為持續(xù)高血糖組（MS組，n=20）和血糖波動(dòng)組（MF組，n=20），MF組錯(cuò)時(shí)腹腔注射葡萄糖、胰島素，制備糖尿病血糖波動(dòng)大鼠模型，正常組和MS組均同時(shí)腹腔注射等量生理鹽水。測定各組大鼠血糖（Glu）、甘油三酯（TG）、高密度脂蛋白（HDL-C）、低密度脂蛋白（LDL-C）及血清超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）、一氧化氮（NO）水平。結(jié)果（1）MS和MF組TG、LDL-C均明顯高于正常組（P＜0.01），而HDL-C均顯著低于正常組（P＜0.01）；（2）與正常組比較，MS組和MF組SOD、MDA、NO值均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P均＜0.05），MF組SOD、MDA、NO水平高于MS組（P＜0.05）。結(jié)論2型糖尿病大鼠體內(nèi)存在血管內(nèi)皮損傷和氧化應(yīng)激；持續(xù)高血糖可以損傷血管內(nèi)皮細(xì)胞；血糖的劇烈波動(dòng)較持續(xù)性高血糖引起SOD、MDA、NO變化更為顯著，可能導(dǎo)致更為嚴(yán)重的血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷。

血糖波動(dòng)；血管內(nèi)皮細(xì)胞；超氧化物歧化酶；丙二醛；一氧化氮

糖尿病是一種常見的內(nèi)分泌代謝障礙性疾病，高血糖是其標(biāo)志，也是引起糖尿病慢性并發(fā)癥的主要原因。糖尿病高血糖存在持續(xù)性高血糖和波動(dòng)性高血糖兩種表現(xiàn)。糖尿病慢性并發(fā)癥的發(fā)生、發(fā)展與整體血糖水平相關(guān)，而血糖的波動(dòng)性與其關(guān)系更加密切［1，2］。在糖尿病控制與并發(fā)癥試驗(yàn)（diabetes control and complications trial，DCCT）、英國前瞻性糖尿病研究（united kingdom prospective diabetes study，UKPDS）等大型臨床研究中發(fā)現(xiàn)，糖化血紅蛋白（glycosylated hemoglobin，HbAlc）與糖尿病慢性并發(fā)癥的風(fēng)險(xiǎn)呈正相關(guān)［3］，但是在臨床中存在很多這樣的情況：糖化血紅蛋白水平不高，糖尿病并發(fā)癥出現(xiàn)較早，而相同的糖化血紅蛋白水平，卻出現(xiàn)不同的并發(fā)癥。經(jīng)過仔細(xì)分析，考慮可能與血糖波動(dòng)程度關(guān)系密切［4］。有研究表明，血糖波動(dòng)增加氧化應(yīng)激，引起血管內(nèi)皮損傷，促進(jìn)糖尿病慢性并發(fā)癥的發(fā)生發(fā)展［5］。因此，2009年Monnier等［6］提出“血糖四分體”的概念，即HbAlc、空腹血糖、餐后血糖和血糖波動(dòng)。本研究借助波動(dòng)性高血糖大鼠模型，檢測不同高血糖狀態(tài)（穩(wěn)定性高血糖和波動(dòng)性血高糖）下血清超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、丙二醛（malondialdehyde，MDA）、一氧化氮（nitric oxide，NO）的表達(dá)，以此來判斷對血管內(nèi)皮形態(tài)和功能損傷的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組和模型建立

6～8周齡SD大鼠60只（南京君科生物工程有限公司提供），體質(zhì)量140～160 g，隨機(jī)分為2組，高糖高脂飼料喂養(yǎng)模型組（模型組，n=40）和正常飼料喂養(yǎng)組（正常組，n=20），模型組喂養(yǎng)6周后，采用腹腔內(nèi)注射鏈脲佐菌素（30 mg/kg）建立糖尿病大鼠模型，1周后測大鼠空腹血糖，結(jié)果均＞15 mmol/L，提示糖尿病大鼠模型建立成功，然后將其隨機(jī)分為2組：持續(xù)高血糖組（MS組，n=20）與波動(dòng)高血糖組（MF組，n=20）。波動(dòng)高血糖組建立方法為每日8時(shí)、15時(shí)腹腔注射葡萄糖，劑量為0.3 g/kg，08：30及15：30皮下注射普通胰島素，劑量為1 U（劑量通過預(yù)實(shí)驗(yàn)確定），正常組和持續(xù)高血糖組同時(shí)腹腔注射等體積生理鹽水［7］。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑與儀器

普通胰島素（江蘇萬邦化醫(yī)藥）；鏈脲佐菌素（STZ，美國Sigma公司）；血糖試紙（451289，德國羅氏）；高脂飼料：豬油15%、蛋黃10%、蔗糖15%、基礎(chǔ)飼料60%（北京美森生物醫(yī)藥科技有限公司提供）。SOD、MDA、NO應(yīng)用南京建成生物有限公司生產(chǎn)的試劑盒，血漿SOD活性用黃嘌呤氧化酶法測定，血清MDA含量測定采用硫代巴比妥酸比色法，NO測定采用化學(xué)發(fā)光法。全自動(dòng)生化分析儀（Hitachi，7020）OneTouch DMS Pro分析軟件（美國強(qiáng)生公司）

1.3 觀察指標(biāo)

1.3.1 體質(zhì)量：實(shí)驗(yàn)開始前、糖尿病大鼠造模前及MF組造模12周后測定大鼠體質(zhì)量。

1.3.2 生化指標(biāo)：（1）注射鏈脲佐菌素，1周后，禁食12 h，檢測各組大鼠空腹血糖。（2）血糖波動(dòng)組造模第6周，連續(xù)7 d測定7個(gè)時(shí)間血糖（08：00、08：30、10：00、15：00、15：30、17：00、22：00）。

1.3.3 SOD、MDA、NO檢測：血糖波動(dòng)組造模12周后，各組大鼠腹主動(dòng)脈取血，測定血TG、LDL-C及HDL-C，黃嘌呤氧化酶法測定血漿SOD活性，硫代巴比妥酸比色法測定血清MDA，化學(xué)發(fā)光法測定NO，具體操作嚴(yán)格按試劑盒說明書進(jìn)行。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，正態(tài)分布資料用表示，采用單因素方差分析比較組間差異，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的一般狀況

正常組的大鼠精神狀態(tài)良好、體質(zhì)量增加、毛色光亮、攝食攝水量正常、動(dòng)作自如；MF和MS組大鼠均出現(xiàn)明顯的多飲多食多尿，毛豎無光澤，蜷臥少動(dòng)。

實(shí)驗(yàn)前及糖尿病大鼠造模前，各組大鼠體質(zhì)量比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）；血糖波動(dòng)造模第12周時(shí)，MS、MF 2組大鼠體質(zhì)量較正常組均下降（P＜0.01），MS組及MF組之間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見表1。

表1 大鼠體質(zhì)量的變化Tab.1 Changes of the rats’weight

表1 大鼠體質(zhì)量的變化Tab.1 Changes of the rats’weight

1）P＜0.01 vs normal group.

2.2 各組大鼠第6周血糖變化

如表2所示，正常組大鼠血糖基本正常，模型組大鼠血糖持續(xù)在高血糖水平，MF組大鼠血糖分別在08：30、15：30形成波峰，10：00、17：00形成波谷，波動(dòng)幅度顯著高于MS組（P＜0.01），提示血糖波動(dòng)組造模成功。

表2 大鼠血糖波動(dòng)造模第6周血糖比較Tab.2 Comparison of blood glucose after blood-glucose fluctuation rat model established 6 weeks

表2 大鼠血糖波動(dòng)造模第6周血糖比較Tab.2 Comparison of blood glucose after blood-glucose fluctuation rat model established 6 weeks

1）P＜0.01 vs group MS.

2.3 各組大鼠12周血脂變化

MS組、MF組TG、LDL較正常組明顯升高（P＜0.01），HDL-C則顯著下降（P＜0.01），MS、MF組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），提示2種不同糖尿病模型之間血脂存在可比性，見表3。

2.4 血糖波動(dòng)大鼠造模第12周血清SOD、MDA、NO指標(biāo)變化

結(jié)果顯示，與正常組比較，各模型組SOD、MDA、NO均呈現(xiàn)顯著性變化（P均＜0.05），MF組SOD、MDA、NO變化水平高于MS組（P＜0.05）。見表4。

表3 大鼠血糖波動(dòng)組造模第12周TG、LDL-C、HDL-C水平比較Tab.3 Comparison of TG，LDL-C and HDL-C after blood-glucose fluctuation rat model established 12 weeks

1）P＜0.01 vs normal group.

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表4 大鼠血糖波動(dòng)組造模第12周SOD、MDA、NO水平比較Tab.4 Comparison of SOD，MDA and NO after blood-glucose fluctuation rat model group established 12 weeks

表4 大鼠血糖波動(dòng)組造模第12周SOD、MDA、NO水平比較Tab.4 Comparison of SOD，MDA and NO after blood-glucose fluctuation rat model group established 12 weeks

1）P＜0.05，2）P＜0.01 vs normal group；3）P＜0.05 vs group MS.

3 討論

在糖尿病心血管并發(fā)癥發(fā)生發(fā)展中，內(nèi)皮功能異常是其重要病理生理基礎(chǔ)［8］。血糖波動(dòng)時(shí)機(jī)體處于氧化應(yīng)激狀態(tài)，產(chǎn)生的活性產(chǎn)物（自由基、丙二醛等）直接或間接引起細(xì)胞壞死、細(xì)胞功能缺損［9］。SOD具有催化超氧陰離子自由基發(fā)生歧化反應(yīng)的性質(zhì)，可清除超氧陰離子自由基，防止細(xì)胞損傷，故可反映機(jī)體的抗氧化能力［10］。MDA是過氧化脂質(zhì)降解的產(chǎn)物，可間接反映氧自由基對機(jī)體細(xì)胞的損傷程度。NO是一種內(nèi)皮源性小分子物質(zhì)，在體內(nèi)具有血管活性和細(xì)胞毒性的雙重作用，通過激活鳥苷酸環(huán)化酶，使細(xì)胞內(nèi)cGMP水平升高，引起血管平滑肌松弛、血管擴(kuò)張，在生理狀態(tài)下與氧自由基處于平衡狀態(tài)而無毒性作用，但由于各種原因平衡打破時(shí)，細(xì)胞內(nèi)合成過多的NO與氧自由基生成羥自由基和過氧硝基陰離子，更具細(xì)胞毒性，后者可引起細(xì)胞損傷［11］。流行病學(xué)調(diào)查研究證實(shí)，血糖波動(dòng)不僅是糖尿病患者高死亡率的獨(dú)立預(yù)測因子，而且是血管并發(fā)癥的獨(dú)立危險(xiǎn)因素［12］。

本實(shí)驗(yàn)中，MS組及MF組血MDA水平顯著高于正常組（P＜0.05），SOD活性及NO水平明顯低于正常組（P＜0.05），提示2型糖尿病大鼠體內(nèi)存在氧化應(yīng)激，抗氧化能力減弱，NO水平下降，這可能與血管內(nèi)皮受損，NO合成和釋放減少有關(guān)；血糖波動(dòng)組MDA水平升高、SOD活性及NO水平下降較持續(xù)高血糖組更明顯（P＜0.05），提示血糖波動(dòng)可加劇糖尿病機(jī)體的氧化應(yīng)激反應(yīng)，與持續(xù)性高血糖相比，波動(dòng)性高血糖可能引起更嚴(yán)重的血管內(nèi)皮損害，與其他因素共同參與糖尿病慢性并發(fā)癥的發(fā)生。因而在臨床工作中，積極降壓、降脂、控制糖化血紅蛋白、空腹及餐后血糖達(dá)標(biāo)的同時(shí)，應(yīng)重視血糖平穩(wěn)，這對延緩糖尿病慢性并發(fā)癥有重要意義。

目前，有關(guān)血糖波動(dòng)與糖尿病慢性并發(fā)癥的研究仍停留在實(shí)驗(yàn)階段，具體機(jī)制尚不明確，有待進(jìn)一步探索，此外，減少血糖波動(dòng)對糖尿病患者心腦血管終點(diǎn)事件的影響需要進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)證實(shí)。

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（編輯 武玉欣）

Expression of Serum SOD，MDAand NOLevelsin High Blood Glucose Fluctuation in Diabetic Rats

WANGLu1，WANGWei1，YANGMi-mi2，BAOGuo-rong1，SUO Lin-na1，ZHANGWei1
（1.Department of Endocrinology，The Fourth Affiliated Hospital，China Medical University，Shenyang 110032，China；2.2010 Grade，Preventive Medicine School，Public Health College，ShanxiMedicalUniersity，Taiyuan 030001，China）

ObjectiveTo observe the effects of blood-glucose fluctuation on serum superoxide dismutase（SOD），malondialdehyde（MDA），and nitric oxide（NO）levels in rat models of diabetes mellitus.MethodsSixty male Sprague-Dawley rats were randomly divided into normal group（n=20）and model group（n=40），The diabetic rat model was established by injection of a small dose of streptozotoein（STZ）after feeding the modelgroup SD rats with high-sugarhigh-fatdietfor6 weeks.The persistenthigh glucose diabetic ratmodelgroup（MS）wasestablished by intraperitoneal injection of glucose，and the blood-glucose fluctuation rat model group（MF）was developed by alternative intraperitoneal injection of insulin and glucose.Serum glucose（Glu）was measured at6 weeks after MF modelestablishment，triglyceride（TG），low density lipopretein（LDL-C），high density lipoprotein（HDL-C），SOD，MDA，and NO were measured at 12 weeks.Results（1）12 weeks after intravenous injection of STZ，the levels of TG and LDL-C in the MS and MF groups were significantly increased（allP＜0.01），and HDL-C was significantly decreased compared with those of the N group（P＜0.01）.（2）Compared with the normal group，the expression levels of SOD，MDA，NO in the MS and MF groups were all changed significantly（allP＜0.05），while the MF group were significantly higher than those of the MS groups（allP＜0.01）.Conclusion（1）Vascular endothelium cell（VEC）injury and oxidative stress exist in type 2 diabetic rat，（2）Hyperglycemia can lead to VEC injury.（3）Glucose fluctuation induces more obvious changes than hyperglycemia in express of SOD，MDA，and NO，which may consequently induces more serious endothelialdysfunction than hyperglycemia.

blood-glucose fluctuation；vascular endothelium cell；serum superoxide dismutase；malondialdehyde；nitric oxide

R587.1

A

0258-4646（2014）09-0806-04

遼寧省教育廳高?？蒲杏?jì)劃（2013021026）

王露（1968-），女，副主任醫(yī)師，碩士. E-mail：wanglushiliang@sina.com

2014-06-05

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