刁毅+韓洪波+蔣健+鄭毅

摘要：采用RAPD分子技術(shù)對11個(gè)棗（Ziziphus jujube Mill.）品種進(jìn)行遺傳關(guān)系鑒定。結(jié)果表明，12個(gè)引物共擴(kuò)增出70條譜帶，平均每個(gè)引物擴(kuò)增出5.83條；其中多態(tài)性條帶57條，多態(tài)性比例為81.4%。聚類分析結(jié)果表明，11個(gè)品種中，野棗與其他10個(gè)品種親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，其次是臺(tái)灣青棗；龍棗與沾化冬棗、胎里紅與以色列棗、灰棗與酸棗之間親緣關(guān)系較近。

關(guān)鍵詞：棗（Ziziphus jujube Mill.）；RAPD；遺傳多樣性

中圖分類號(hào)：S665.1；Q7 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：0439-8114（2014）01-0114-02

RAPD Analysis of Different Ziziphus jujuba Mill. Varieties

DIAO Yi1，2，HAN Hong-bo1，JIANG Jian1，ZHENG Yi1

（1.College of Biological and Chemical Engineering， Panzhihua University， Panzhihua 617000， Sichuan， China；

2.School of Life Science and Technology， University of Electronic Science and Technology of China， Chengdu 610000，China）

Abstract： The genitic relationships of eleven Ziziphus jujuba Mill. varieties were studied by RAPD technique. 70 DNA fragments were amplified with 12 random primers. The polymorphic DNA fragments were 57， accounting for 81.4% of 70 fragments. Cluster analysis showed that Yezao had farther relationship with other ten Ziziphus jujuba Mill. varieties， Taiwanqingzao was the next variety. There were close relationships between Longzao and Zhanhuadongzao， Tailihong and yiseliezao， Huizao and Suanzao.

Key words： Zizyphus jujuba Mill.； RAPD； genitic diversity

收稿日期：2013-05-20

基金項(xiàng)目：攀枝花市科技局項(xiàng)目[2012CY-S-22（9）]

作者簡介：刁 毅（1975-），男，四川南部人，副教授，碩士，主要從事植物病理方面的研究，（電話）13037717160（電子信箱）diaoy163@163.com。

棗（Ziziphus jujube Mill.）屬于鼠李科（Rhamnaceae）棗屬植物，是經(jīng)濟(jì)價(jià)值比較高的植物。棗營養(yǎng)豐富，含有豐富的多糖、蛋白質(zhì)、脂肪、碳水化合物、維生素、有機(jī)酸及微量元素。棗具有較好的藥理作用，具有增強(qiáng)睡眠、保護(hù)肝臟、提高免疫力、調(diào)節(jié)內(nèi)分泌等作用。棗中還含有豐富的安全無毒天然色素，廣泛用于食品、醫(yī)藥、化妝品等方面[1]。我國棗樹品種繁多，目前栽培品種達(dá)700余個(gè)，但在棗的分類中多以形態(tài)、用途、分布等進(jìn)行分類命名，并且，傳統(tǒng)外觀形態(tài)鑒別難以有效鑒別棗樹。

通過采用分子標(biāo)記技術(shù)鑒別棗樹，可以快速鑒別棗樹品種。RAPD分子標(biāo)記技術(shù)即隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性技術(shù)，是以DNA為模版，利用10個(gè)核苷酸引物進(jìn)行基因組DNA PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳將DNA條帶分離顯示出來，以檢測其多態(tài)性[2]。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試材料有：安國棗、龍棗、沾化冬棗、野棗、胎里紅、灰棗、酸棗、京39號(hào)、新京14號(hào)、以色列棗、臺(tái)灣青棗，采自攀枝花市銀江安國棗業(yè)有限公司和干熱河谷特色生物資源種植園。采集幼嫩葉片后，放于冰盒中帶回實(shí)驗(yàn)室，-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 DNA的提取

采用改進(jìn)的CTAB法，從幼嫩葉片中提取基因組DNA[3-5]。

1.3 RAPD-PCR反應(yīng)體系

擴(kuò)增所用的40個(gè)引物，由北京三博遠(yuǎn)志生物技術(shù)有限責(zé)任公司合成。PCR反應(yīng)體系為25 μL，其中包括25 mmol/L MgCl2 2 μL，10×PCR緩沖液2.5 μL，10 ng/μL引物1 μL，50 ng/μL DNA 2 μL，2 mmol/L dNTP 2 μL，5 U/μL Taq DNA聚合酶0.3 μL，雙蒸水15.2 μL。

1.4 PCR反應(yīng)程序

反應(yīng)程序?yàn)椋?4 ℃ 2 min，1個(gè)循環(huán)；94 ℃ 30 s，37 ℃ 40 s，72 ℃ 60 s，40個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min；4 ℃保溫10 min。

1.5 瓊脂糖凝膠電泳

PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠（含EB 0.5 μg/mL），在1×TAE電泳緩沖液中電泳分離，在凝膠成像系統(tǒng)中觀察，照相。

1.6 數(shù)據(jù)分析

每次試驗(yàn)2次重復(fù)，2次重復(fù)出現(xiàn)相同的擴(kuò)增條帶用作特征帶來分析。11個(gè)棗的DNA電泳圖譜上的每條帶為一個(gè)分子標(biāo)記，將遷移率相同的帶作為同源條帶處理。在讀條帶時(shí)，只記錄容易辨認(rèn)的條帶，排除模糊不清的條帶；有帶的記為1，無帶的記為0，用NTsys 2.10e軟件進(jìn)行聚類分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 RAPD分子標(biāo)記擴(kuò)增結(jié)果

從40個(gè)引物中篩選出12個(gè)擴(kuò)增條帶多、信號(hào)強(qiáng)、背景清晰的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)。利用RAPD引物對11個(gè)棗品種的DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，結(jié)果見表1。由表1可以看出，12個(gè)隨機(jī)引物在11個(gè)棗品種中共擴(kuò)增出70條帶，其中57條帶具有多態(tài)性。平均每個(gè)引物擴(kuò)增出5.83條帶，多態(tài)性比例為81.4%。圖1和圖2分別為引物OPE01和S8對不同棗品種DNA的擴(kuò)增結(jié)果。不同引物擴(kuò)增出的DNA總帶數(shù)和多態(tài)性帶數(shù)差異較大。擴(kuò)增出帶數(shù)最多的引物是OPE01，帶數(shù)最少的是S68；多態(tài)性帶數(shù)較多的引物有OPE01、OPE09、S8、S25和S130，較少的引物有S68。多態(tài)性比例較高的有OPE09、S8、S61、S130，均達(dá)到100.00%。12個(gè)引物在11個(gè)品種棗間均產(chǎn)生特征性譜帶，具有良好的重復(fù)性。

2.2 聚類分析

11份供試材料聚類分析結(jié)果見圖3。在遺傳距離為0.510 0時(shí)，可將11個(gè)棗品種分為2組。第一組為4號(hào)，其單獨(dú)為一類；其他10個(gè)棗品種為第二組，其遺傳距離為0.083 8～0.332 6。在第二組中，當(dāng)遺傳距離為0.332 6時(shí)，10個(gè)品種再分為2類，11號(hào)單獨(dú)為一類，其他品種聚為一類。

在遺傳距離為0.161 8時(shí)，1、8、9號(hào)聚為一類，2、3、5、6、7、10號(hào)聚為一類。1號(hào)和8號(hào)的親緣關(guān)系較近；1號(hào)與9號(hào)、8號(hào)與9號(hào)的遺傳距離為0.071 3～0.124 5，說明其親緣關(guān)系相對較遠(yuǎn)。2號(hào)與3號(hào)、5號(hào)與10號(hào)、6號(hào)與7號(hào)之間的親緣關(guān)系較近；5、10號(hào)與6、7號(hào)之間遺傳距離為0.081 2，親緣關(guān)系較近；2、3號(hào)與5、10、6、7號(hào)之間的遺傳距離為0.134 8，親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。在11個(gè)棗品種中，野棗與其他10個(gè)品種的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，其次是臺(tái)灣青棗；龍棗與沾化冬棗、胎里紅與以色列棗、灰棗與酸棗之間的親緣關(guān)系較近。

3 小結(jié)與討論

前人對不同棗品種之間遺傳分類進(jìn)行了研究，獲得了一些棗品種的遺傳圖譜[6-9]。本研究通過RAPD技術(shù)對攀枝花地區(qū)引種棗品種與地方棗品種進(jìn)行DNA擴(kuò)增分析，12個(gè)隨機(jī)引物共擴(kuò)增出特征條帶70條，多態(tài)性條帶57條，多態(tài)性比例達(dá)到81.4%，表現(xiàn)出較高的多態(tài)性。從聚類分析中可以看出，11個(gè)棗品種遺傳距離為0～0.510 0，親緣關(guān)系較近。野棗與其他10個(gè)棗品種親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，其次是臺(tái)灣青棗；龍棗與沾化冬棗、胎里紅與以色列棗、灰棗與酸棗之間親緣關(guān)系較近。本研究中使用RAPD技術(shù)對11個(gè)棗品種的DNA進(jìn)行多態(tài)性擴(kuò)增，獲得了穩(wěn)定的遺傳圖譜；11個(gè)棗品種的遺傳關(guān)系為棗的育種與種植提供了一定的依據(jù)。

參考文獻(xiàn)：

[1] 樊 君，呂 磊，尚紅偉.大棗的研究與開發(fā)進(jìn)展[J].食品科學(xué)，2003，24（4）：161-163.

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[3] SAMBROK J， FRITSCH E F，MANIATIS T. Molecular Cloning A Laboratory Manual[M]. Beijing： Science Press，1992.

[4] 彭建營，束懷瑞，彭士琪.一種適合棗和酸棗基因組DNA的提取方法[J].河北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2000，23（4）：46-48.

[5] 王永康，王永勤，田建保，等.高質(zhì)量棗基因組DNA提取方法[J].果樹學(xué)報(bào)，2006，23（2）：310-312.

[6] 賀潤平，渠云芳，雷海英. 棗樹不同品種遺傳多樣性的RAPD分析[J]. 中國農(nóng)學(xué)通報(bào)，2010，26（22）：50-53.

[7] 劉 平，彭建營，彭士琪，等. 應(yīng)用RAPD標(biāo)記技術(shù)探討棗與酸棗的分類學(xué)關(guān)系[J]. 林業(yè)科學(xué)，2005，41（2）：182-185.

[8] 智福軍，賈彥麗，梁海永，等. 利用RAPD技術(shù)進(jìn)行棗樹的品種鑒定[J].華北農(nóng)學(xué)報(bào)，2009，24（增刊）：110-114.

[9] 劉冬芝，時(shí) 燕，趙登超，等.大酸棗與酸棗、棗親緣關(guān)系的RAPD分析[J].西北農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2010，19（4）：160-164.

（責(zé)任編輯 趙 娟）

2 結(jié)果與分析

2.1 RAPD分子標(biāo)記擴(kuò)增結(jié)果

從40個(gè)引物中篩選出12個(gè)擴(kuò)增條帶多、信號(hào)強(qiáng)、背景清晰的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)。利用RAPD引物對11個(gè)棗品種的DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，結(jié)果見表1。由表1可以看出，12個(gè)隨機(jī)引物在11個(gè)棗品種中共擴(kuò)增出70條帶，其中57條帶具有多態(tài)性。平均每個(gè)引物擴(kuò)增出5.83條帶，多態(tài)性比例為81.4%。圖1和圖2分別為引物OPE01和S8對不同棗品種DNA的擴(kuò)增結(jié)果。不同引物擴(kuò)增出的DNA總帶數(shù)和多態(tài)性帶數(shù)差異較大。擴(kuò)增出帶數(shù)最多的引物是OPE01，帶數(shù)最少的是S68；多態(tài)性帶數(shù)較多的引物有OPE01、OPE09、S8、S25和S130，較少的引物有S68。多態(tài)性比例較高的有OPE09、S8、S61、S130，均達(dá)到100.00%。12個(gè)引物在11個(gè)品種棗間均產(chǎn)生特征性譜帶，具有良好的重復(fù)性。

2.2 聚類分析

11份供試材料聚類分析結(jié)果見圖3。在遺傳距離為0.510 0時(shí)，可將11個(gè)棗品種分為2組。第一組為4號(hào)，其單獨(dú)為一類；其他10個(gè)棗品種為第二組，其遺傳距離為0.083 8～0.332 6。在第二組中，當(dāng)遺傳距離為0.332 6時(shí)，10個(gè)品種再分為2類，11號(hào)單獨(dú)為一類，其他品種聚為一類。

在遺傳距離為0.161 8時(shí)，1、8、9號(hào)聚為一類，2、3、5、6、7、10號(hào)聚為一類。1號(hào)和8號(hào)的親緣關(guān)系較近；1號(hào)與9號(hào)、8號(hào)與9號(hào)的遺傳距離為0.071 3～0.124 5，說明其親緣關(guān)系相對較遠(yuǎn)。2號(hào)與3號(hào)、5號(hào)與10號(hào)、6號(hào)與7號(hào)之間的親緣關(guān)系較近；5、10號(hào)與6、7號(hào)之間遺傳距離為0.081 2，親緣關(guān)系較近；2、3號(hào)與5、10、6、7號(hào)之間的遺傳距離為0.134 8，親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。在11個(gè)棗品種中，野棗與其他10個(gè)品種的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，其次是臺(tái)灣青棗；龍棗與沾化冬棗、胎里紅與以色列棗、灰棗與酸棗之間的親緣關(guān)系較近。

3 小結(jié)與討論

前人對不同棗品種之間遺傳分類進(jìn)行了研究，獲得了一些棗品種的遺傳圖譜[6-9]。本研究通過RAPD技術(shù)對攀枝花地區(qū)引種棗品種與地方棗品種進(jìn)行DNA擴(kuò)增分析，12個(gè)隨機(jī)引物共擴(kuò)增出特征條帶70條，多態(tài)性條帶57條，多態(tài)性比例達(dá)到81.4%，表現(xiàn)出較高的多態(tài)性。從聚類分析中可以看出，11個(gè)棗品種遺傳距離為0～0.510 0，親緣關(guān)系較近。野棗與其他10個(gè)棗品種親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，其次是臺(tái)灣青棗；龍棗與沾化冬棗、胎里紅與以色列棗、灰棗與酸棗之間親緣關(guān)系較近。本研究中使用RAPD技術(shù)對11個(gè)棗品種的DNA進(jìn)行多態(tài)性擴(kuò)增，獲得了穩(wěn)定的遺傳圖譜；11個(gè)棗品種的遺傳關(guān)系為棗的育種與種植提供了一定的依據(jù)。

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[9] 劉冬芝，時(shí) 燕，趙登超，等.大酸棗與酸棗、棗親緣關(guān)系的RAPD分析[J].西北農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2010，19（4）：160-164.

（責(zé)任編輯 趙 娟）

2 結(jié)果與分析

2.1 RAPD分子標(biāo)記擴(kuò)增結(jié)果

從40個(gè)引物中篩選出12個(gè)擴(kuò)增條帶多、信號(hào)強(qiáng)、背景清晰的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)。利用RAPD引物對11個(gè)棗品種的DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，結(jié)果見表1。由表1可以看出，12個(gè)隨機(jī)引物在11個(gè)棗品種中共擴(kuò)增出70條帶，其中57條帶具有多態(tài)性。平均每個(gè)引物擴(kuò)增出5.83條帶，多態(tài)性比例為81.4%。圖1和圖2分別為引物OPE01和S8對不同棗品種DNA的擴(kuò)增結(jié)果。不同引物擴(kuò)增出的DNA總帶數(shù)和多態(tài)性帶數(shù)差異較大。擴(kuò)增出帶數(shù)最多的引物是OPE01，帶數(shù)最少的是S68；多態(tài)性帶數(shù)較多的引物有OPE01、OPE09、S8、S25和S130，較少的引物有S68。多態(tài)性比例較高的有OPE09、S8、S61、S130，均達(dá)到100.00%。12個(gè)引物在11個(gè)品種棗間均產(chǎn)生特征性譜帶，具有良好的重復(fù)性。

2.2 聚類分析

11份供試材料聚類分析結(jié)果見圖3。在遺傳距離為0.510 0時(shí)，可將11個(gè)棗品種分為2組。第一組為4號(hào)，其單獨(dú)為一類；其他10個(gè)棗品種為第二組，其遺傳距離為0.083 8～0.332 6。在第二組中，當(dāng)遺傳距離為0.332 6時(shí)，10個(gè)品種再分為2類，11號(hào)單獨(dú)為一類，其他品種聚為一類。

在遺傳距離為0.161 8時(shí)，1、8、9號(hào)聚為一類，2、3、5、6、7、10號(hào)聚為一類。1號(hào)和8號(hào)的親緣關(guān)系較近；1號(hào)與9號(hào)、8號(hào)與9號(hào)的遺傳距離為0.071 3～0.124 5，說明其親緣關(guān)系相對較遠(yuǎn)。2號(hào)與3號(hào)、5號(hào)與10號(hào)、6號(hào)與7號(hào)之間的親緣關(guān)系較近；5、10號(hào)與6、7號(hào)之間遺傳距離為0.081 2，親緣關(guān)系較近；2、3號(hào)與5、10、6、7號(hào)之間的遺傳距離為0.134 8，親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。在11個(gè)棗品種中，野棗與其他10個(gè)品種的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，其次是臺(tái)灣青棗；龍棗與沾化冬棗、胎里紅與以色列棗、灰棗與酸棗之間的親緣關(guān)系較近。

3 小結(jié)與討論

前人對不同棗品種之間遺傳分類進(jìn)行了研究，獲得了一些棗品種的遺傳圖譜[6-9]。本研究通過RAPD技術(shù)對攀枝花地區(qū)引種棗品種與地方棗品種進(jìn)行DNA擴(kuò)增分析，12個(gè)隨機(jī)引物共擴(kuò)增出特征條帶70條，多態(tài)性條帶57條，多態(tài)性比例達(dá)到81.4%，表現(xiàn)出較高的多態(tài)性。從聚類分析中可以看出，11個(gè)棗品種遺傳距離為0～0.510 0，親緣關(guān)系較近。野棗與其他10個(gè)棗品種親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，其次是臺(tái)灣青棗；龍棗與沾化冬棗、胎里紅與以色列棗、灰棗與酸棗之間親緣關(guān)系較近。本研究中使用RAPD技術(shù)對11個(gè)棗品種的DNA進(jìn)行多態(tài)性擴(kuò)增，獲得了穩(wěn)定的遺傳圖譜；11個(gè)棗品種的遺傳關(guān)系為棗的育種與種植提供了一定的依據(jù)。

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[7] 劉 平，彭建營，彭士琪，等. 應(yīng)用RAPD標(biāo)記技術(shù)探討棗與酸棗的分類學(xué)關(guān)系[J]. 林業(yè)科學(xué)，2005，41（2）：182-185.

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（責(zé)任編輯 趙 娟）