白 潔 ,孟 軍 ,劉艷輝 ,李小紅 ,危當(dāng)恒

(1.南華大學(xué)附屬第一醫(yī)院功能科;2.南華大學(xué)心血管疾病研究所,動脈硬化學(xué)湖南省重點實驗室,湖南衡陽421001)

動脈粥樣硬化(atherosclerosis,As)是主要發(fā)生于大、中型血管的血管病變,是環(huán)境因素與遺傳因素相互作用所致的慢性炎癥性過程,其主要特征為血管內(nèi)皮功能紊亂、內(nèi)膜下脂質(zhì)沉積、平滑肌細(xì)胞及單核細(xì)胞的遷移以及泡沫細(xì)胞的形成,累及全身各個重要器官[1]。

氧化低密度脂蛋白(oxidized low density lipoprotein,Ox-LDL)是As的獨立危險因素,能引起血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷及血管功能障礙,增大血管內(nèi)皮的間隙和通透性,導(dǎo)致致As性脂質(zhì)和炎癥細(xì)胞內(nèi)皮下蓄積,誘導(dǎo)As的形成和發(fā)展[2]。此外,受損的血管內(nèi)皮細(xì)胞分泌細(xì)胞因子及炎癥因子,誘導(dǎo)循環(huán)血液中的單核細(xì)胞粘附于內(nèi)皮表面,在趨化因子作用下,跨內(nèi)膜遷移,然后轉(zhuǎn)化為巨噬細(xì)胞[3]。巨噬細(xì)胞通過特異受體介導(dǎo)的胞吞作用蓄積脂質(zhì),轉(zhuǎn)變?yōu)榕菽?xì)胞,形成As的早期病變。近年來的研究發(fā)現(xiàn),As斑塊中存在巨噬細(xì)胞自噬[4]。自噬是通過溶酶體系統(tǒng)降解長半衰期蛋白和細(xì)胞器的代謝通路,能被饑餓、細(xì)胞分化及正常生長的調(diào)節(jié)所誘導(dǎo),維持細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)、代謝和功能平衡[5]。本文觀察了Ox-LDL對佛波酯(phorbol-12-myristate-13-acetate,PMA)誘導(dǎo)的THP-1巨噬細(xì)胞自噬的影響,以期為As的防治提供新的思路和策略。

1 材料與方法

1.1 材料

人源性THP-1細(xì)胞購于中科院上海生物所細(xì)胞中心,1640細(xì)胞培養(yǎng)基購于Hyclone公司,Ox-LDL購自廣州奕源生物公司,PMA購自碧云天公司,PCR引物合成于上海生工生物工程有限公司,β-actin Mouse Monoclonal Antibody購自康為世紀(jì)公司,MAP LC3Monoclonal Antibody購自Santa Cruz公司,Beclin-1 PolyClonal Antibody購自Datasheet公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

THP-1細(xì)胞采用1640培養(yǎng)基,于37℃、5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng),取對數(shù)期細(xì)胞進(jìn)行實驗。160 nmol/L的PMA預(yù)處理細(xì)胞24 h,誘導(dǎo)分化為THP-1巨噬細(xì)胞,更換培養(yǎng)基,不同濃度Ox-LDL(0、10、20、40、80 mg/L)孵育 24 h。

1.3 逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)

提取細(xì)胞總RNA,取1 μL總RNA逆轉(zhuǎn)為cDNA,再取1 μL cDNA進(jìn)行PCR擴增,引物序列及反應(yīng)條件如下:GAPDH:Forward Sequence 5′-CAAGGTCATCCATGACAACTTTG-3′,ReverseSequence5′-GTCCACCACCCTGTTGCTGTAG-3′;PCR 反應(yīng)條件:94℃預(yù)變性5 min,94℃變性30 s,60℃退火30 s,72℃延伸30 s,26個循環(huán);72℃延伸5 min,預(yù)計擴增產(chǎn)物長度為496 bp。Beclin-1:Forward Sequence 5′-GGATGGATGTGGAGAAAGGCAAG-3′, Reverse Sequence 5′-TGAGGACACCCAAGCAAGACC-3′;PCR反應(yīng)條件:94℃預(yù)變性2 min;94℃變性30 s,61℃退火30 s,72℃延伸30 s,32個循環(huán);72℃延伸2 min,預(yù)計擴增產(chǎn)物長度為152 bp。LC3:Forward Sequence 5′-GAGTTACCTCCCGACGCCGCA-3′,Reverse Sequence 5′-TCCGCCGCTGCTTGAAAGGC-3′;PCR反應(yīng)條件:94℃預(yù)變性2 min;94℃變性30 s,61℃退火30 s,72℃延伸30 s,32個循環(huán);72℃延伸2 min,預(yù)計擴增產(chǎn)物長度為181 bp。

1.4 Western blotting分析

提取總蛋白,采用SDS-PAGE分離總蛋白,轉(zhuǎn)移至PVDF膜,5%的脫脂牛奶室溫封閉2 h。一抗于4℃孵育過夜;TBST洗15 min×3次。相應(yīng)的二抗孵育2 h,TBST洗三次,每次15 min。顯影,拍照保存。Quanty One軟件分析各待測蛋白條帶及其對應(yīng)的β-actin灰度值。

1.5 細(xì)胞免疫熒光

取對數(shù)期生長的細(xì)胞,細(xì)胞計數(shù),5×105個細(xì)胞接種于24孔板,培養(yǎng)24 h,不同濃度Ox-LDL(0、10、20、40 或80 mg/L)孵育 24 h,每個濃度 3 個復(fù)孔。棄掉培養(yǎng)液,用PBS沖洗,4%多聚甲醛固定30 min,晾干;PBS漂洗3次,每次5 min;用0.5%Triton孵育30 min,PBS漂洗2次,每次5 min;10%的胎牛血清封閉1 h,LC3一抗4℃孵育過夜;PBS洗3次,每次5 min;相應(yīng)的CY3熒光素標(biāo)記的二抗37℃孵育2 h,PBS漂洗4次,每次5 min;5μg/mL DAPI染色液染色2 min,PBS洗2次,每次5 min;抗猝滅封片劑封片,熒光顯微鏡下拍照保存。

1.6 單丹酰戊二胺(MDC)染色

不同濃度(0、10、20、40 或 80 mg/L)Ox-LDL 孵育24 h,每個濃度3個復(fù)孔。棄掉培養(yǎng)液,避光狀態(tài)下每孔加入500 μL含MDC的無血清1640培養(yǎng)基,37℃孵育2 h,棄培養(yǎng)液,加入20 μL抗熒光猝滅劑封片,熒光顯微鏡下拍照保存。

1.7 統(tǒng)計學(xué)處理

所有數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示,用 GraphPad Prism 5軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析,組間差異采用t檢驗,P＜0.05代表差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 Ox-LDL下調(diào)PMA誘導(dǎo)的THP-1巨噬細(xì)胞Beclin-1表達(dá)

160 nmol/L佛波酯誘導(dǎo)THP-1細(xì)胞24 h,使其貼壁并分化為巨噬細(xì)胞,用含有 0、10、20、40或80 mg/L Ox-LDL的培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞24 h,RTPCR和Western blotting分別檢測THP-1巨噬細(xì)胞自噬標(biāo)記物Beclin-1 mRNA和蛋白水平的表達(dá)。結(jié)果表明:40 mg/L和80 mg/L Ox-LDL處理組Beclin-1 mRNA表達(dá)明顯降低(圖1 A和B),而其蛋白水平隨Ox-LDL濃度增加而降低,呈濃度依賴性(圖1 C和D)。

圖1 Ox-LDL下調(diào)PMA誘導(dǎo)的THP-1巨噬細(xì)胞Beclin-1 mRNA和蛋白表達(dá) A:Beclin-1 PCR結(jié)果;B:Beclin-1 PCR結(jié)果的統(tǒng)計圖;C:Beclin-1 Western blotting結(jié)果;D:Beclin-1 Western blotting結(jié)果的統(tǒng)計圖.M代表Marker,與對照組相比,*:P＜0.05,**:P＜0.01,***:P＜0.001,n=4

2.2 Ox-LDL下調(diào)PMA誘導(dǎo)的THP-1巨噬細(xì)胞LC3表達(dá)

Ox-LDL孵育PMA誘導(dǎo)的THP-1巨噬細(xì)胞,與0 mg/L 相比,10、20、40、80 mg/L Ox-LDL 處理組LC3的mRNA水平?jīng)]有明顯改變(P＞0.05,圖2 A和B);在蛋白表達(dá)水平,隨著Ox-LDL濃度的增加LC3Ⅱ/LC3Ⅰ呈濃度依賴性降低(P＜0.01,圖2C和D)。細(xì)胞免疫熒光顯示隨著Ox-LDL濃度的增加,LC3Ⅱ含量明顯降低(圖3)。

圖2 Ox-LDL抑制PMA誘導(dǎo)的THP-1巨噬細(xì)胞LC3表達(dá) A:LC3 PCR結(jié)果;B:LC3 PCR結(jié)果的統(tǒng)計圖;C:LC3 Western blotting結(jié)果;D:LC3Ⅱ/LC3Ⅰ統(tǒng)計圖 M代表Marker,與對照組相比,**:P＜0.01,***:P＜0.001,n=4

2.3 Ox-LDL下調(diào)PMA誘導(dǎo)的THP-1巨噬細(xì)胞自噬泡的形成

MDC染色是檢測自噬發(fā)生過程中自噬體形成的有效方法。MDC染色顯示,隨著Ox-LDL濃度的增加,自噬泡的形成減少(圖4 A、B、C、D和E)。

3 討 論

研究表明,Ox-LDL損傷血管內(nèi)皮,致使其分泌細(xì)胞粘附分子和化學(xué)趨化分子[6],使血液中的單核細(xì)胞結(jié)合于受損的血管內(nèi)皮細(xì)胞,并跨內(nèi)膜遷移,轉(zhuǎn)化為巨噬細(xì)胞,吞噬并蓄積脂質(zhì),轉(zhuǎn)變?yōu)榕菽?xì)胞,形成As的早期病變。近期研究證明巨噬細(xì)胞自噬(macrophage autophagy,AP)發(fā)生于As的發(fā)生發(fā)展過程[7]。自噬是細(xì)胞通過單層或雙層膜內(nèi)吞待降解物形成自噬體,然后運輸?shù)饺苊阁w形成自噬溶酶體并進(jìn)行降解,實現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)大分子物質(zhì)及某些細(xì)胞器的代謝更新以及細(xì)胞穩(wěn)態(tài)的維持[8]。

圖3 Ox-LDL降低PMA誘導(dǎo)的THP-1巨噬細(xì)胞內(nèi)LC3II含量 不同濃度的Ox-LDL處理THP-1巨噬細(xì)胞24 h,細(xì)胞免疫熒光檢測巨噬細(xì)胞內(nèi)LC3II含量,紅色為Cy3熒光素標(biāo)記的LC3,藍(lán)色為DAPI標(biāo)記的細(xì)胞核,從圖中可以看出,隨著Ox-LDL濃度的增加,PMA誘導(dǎo)的THP-1巨噬細(xì)胞內(nèi)LC3II含量降低

圖4 Ox-LDL抑制THP-1巨噬細(xì)胞自噬囊泡的形成 A:0 mg/L Ox-LDL處理組;B:10 mg/L Ox-LDL處理組;C:20 mg/L Ox-LDL處理組;D:40 mg/L Ox-LDL處理組;E:80 mg/L Ox-LDL處理組

Beclin 1是酵母ATG6/Vps30的同源基因,是一種腫瘤抑制基因,位于人染色體17q21上。Beclin-1通過 BH3(Bcl-2 homolog 3)、卷曲螺旋結(jié)構(gòu)域(coiled-coil domain/CCD)、進(jìn)化保守結(jié)構(gòu)域(evolutionarily conserved domain/ECD)和核輸出結(jié)構(gòu)域參與自噬的誘導(dǎo)、自噬體的生成及成熟的過程[7]。LC3是酵母ATG8的同源基因,是自噬的標(biāo)志性基因,定位于自噬泡和自噬泡膜的表面,參與自噬體的形成,是自噬的特異性指標(biāo)。Zhaorigetu等[9]研究發(fā)現(xiàn)載脂蛋白L6(Apolipoprotein L6,ApoL6)通過與BH3結(jié)構(gòu)域結(jié)合并降解Beclin-1,促進(jìn)P62(調(diào)節(jié)錯誤折疊蛋白、功能障礙的細(xì)胞器的包裹和運輸)的積累而抑制自噬。Maria等[10]發(fā)現(xiàn)膜囊膜蛋白1(Vacuole Membrane Protein 1,VMP1)通過與Beclin-1的BH3結(jié)構(gòu)域結(jié)合,與Ⅲ磷酸肌醇3激酶(PI3K)hVps34形成復(fù)合物調(diào)節(jié)自噬。Jae等[11]研究發(fā)現(xiàn)抗凋亡基因Bcl-2和Beclin-1共同過表達(dá)的細(xì)胞壽命更長,且Beclin-1的過表達(dá)能增加自噬標(biāo)記蛋白LC3-Ⅱ的表達(dá),并抑制哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(Mammalian target of rapamycin,mTOR)活性而促進(jìn)自噬體的形成。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn),Ox-LDL通過組織蛋白酶L途徑濃度依賴性地上調(diào)血管內(nèi)皮細(xì)胞的自噬,從而抑制Ox-LDL誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡[12]。而Dler等[13]過氧化物酶體增殖物活化受體(Peroxisome proliferatoractivated receptor γ,PPARγ)激動劑處理人單核細(xì)胞源性的巨噬細(xì)胞,結(jié)果表明PPARγ激動劑濃度依賴性降低Beclin 1和LC3的表達(dá),抑制自噬。在本實驗中,不同濃度的 Ox-LDL(0、10、20、40 或 80 mg/L)孵育THP-1巨噬細(xì)胞24 h,Ox-LDL濃度依賴性地降低Beclin-1的表達(dá)及LC3II/LC3I的比值;LC3的細(xì)胞免疫熒光也顯示Ox-LDL濃度依賴性下調(diào)細(xì)胞內(nèi)LC3II的含量;MDC染色顯示自噬囊泡的形成隨Ox-LDL濃度呈負(fù)相關(guān),說明Ox-LDL濃度依賴性地抑制PMA誘導(dǎo)的THP-1巨噬細(xì)胞的自噬。

研究表明,在As早期巨噬細(xì)胞源性泡沫細(xì)胞大量聚集。在進(jìn)展期 As斑塊內(nèi),巨噬細(xì)胞的凋亡及凋亡細(xì)胞自吞不足將引發(fā)斑塊破裂,從而引發(fā)急性冠心病事件。細(xì)胞凋亡和自噬的反應(yīng)機制有著共同的通道,但它們之間的細(xì)胞開關(guān)處于一種相互排斥的狀態(tài),自噬抑制凋亡,可保護(hù)細(xì)胞免于發(fā)生凋亡和壞死。此外,研究表明自噬參與脂質(zhì)代謝過程:自噬促進(jìn)脂滴分解為游離膽固醇并外排;如果自噬障礙,脂滴就無法與溶酶體形成自噬小體,膽固醇無法外排而繼續(xù)堆積,進(jìn)一步誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞的泡沫化以巨噬細(xì)胞的及凋亡和壞死,加速As的進(jìn)展[14]。本文作者認(rèn)為Ox-LDL可能通過抑制巨噬細(xì)胞自噬,從而誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞凋亡和壞死以及細(xì)胞內(nèi)膽固醇的蓄積,從而促進(jìn)As的進(jìn)展。因此,進(jìn)一步明確Ox-LDL抑制巨噬細(xì)胞自噬的分子機制,將可能為As的防治提供新的策略和新的靶點。

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