(南華大學(xué)腫瘤研究所,湖南衡陽421001)

胃癌(Gastric carcinoma,GC)是消化道惡性腫瘤之一,其發(fā)病率居所有惡性腫瘤的第三位,居消化道腫瘤的第一位[1-2]。胃癌起病隱匿、早期癥狀不明顯、具有侵襲轉(zhuǎn)移早的特性,且目前早期診斷技術(shù)尚缺乏,治療效果難盡人意,五年生存率低,不足15%[3-5]。采用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù),分析腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中蛋白質(zhì)表達水平及修飾信息,識別與腫瘤相關(guān)的特異蛋白質(zhì),對發(fā)現(xiàn)腫瘤標(biāo)志物以及揭示腫瘤發(fā)病分子機制均具有十分重要意義。

本研究采用冰凍切片、蘇木素-伊紅染色、甲基綠染色、激光捕獲顯微切割(laser capture microdissection,LCM)技術(shù),獲取高純度的胃癌組織與正常胃黏膜的腺體組織,提取LCM純化后組織細(xì)胞總蛋白,測定總蛋白濃度。以期為胃癌蛋白質(zhì)組學(xué)研究提供高純度樣品,為尋找胃癌早期診斷的特異蛋白質(zhì)分子標(biāo)志物提供重要實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 標(biāo)本 20例手術(shù)切除的新鮮胃腺癌組織(經(jīng)病理診斷均為低分化腺癌,根據(jù)國際抗癌聯(lián)盟TNM分期為Ⅱ-Ⅳ期)和配對的正常胃黏膜上皮組織取自湖南省衡陽市南華大學(xué)附屬第一醫(yī)院腫瘤外科,病人為未經(jīng)放療與化療的初診病人,患者年齡38～77,平均57.5歲,其中男性12例,女性8例。標(biāo)本均在胃離體后幾分鐘內(nèi)獲取,正常胃黏膜均選自距離腫瘤原發(fā)灶邊緣＞5 cm無水腫和糜爛壞死的胃黏膜組織,各所取新鮮標(biāo)本均用PBS沖洗后,立即放入液氮中速凍,轉(zhuǎn)-80°低溫冰箱長期保存。

1.1.2 試劑 甲基綠組織染色劑:美國 Sigma-Aldrich公司,OCT組織包埋劑:德國Leica AS公司,蛋白酶抑制劑:美國Indianapolis公司,RIPA組織裂解液(強)、PMSF:碧云天公司產(chǎn)品,微量BCA蛋白定量試劑盒:美國Thermo scientific公司產(chǎn)品。

1.1.3 儀器 激光捕獲顯微切割儀為德國Leica AS公司生產(chǎn),薄膜載片為德國Leica公司生產(chǎn),C1900冰凍切片機為德國Leica AS公司生產(chǎn),光學(xué)顯微鏡、倒置顯微鏡為日本 Olympus公司生產(chǎn),DU800全自動紫外/可見光分析裝置為eppendorf公司生產(chǎn)。

1.2 激光捕獲顯微切割純化細(xì)胞

1.2.1 冰凍切片制備 將收集待切的胃腺癌組織或正常胃黏膜上皮組織標(biāo)本從液氮中取出后,立即放入溫度為-28℃的冰凍切片機內(nèi)室,在組織塊上滴數(shù)滴OCT組織包埋劑,直至將組織塊全部包埋。冷卻20 min,設(shè)置切片厚度為8 μm,每例標(biāo)本前面一張或數(shù)張貼于普通載玻片行H-E染色,用光學(xué)顯微鏡觀察,作為病理對照。找到目的細(xì)胞后,行8 μm連續(xù)冰凍切片,貼附于紫外線照射后的專用薄膜載片上,常溫放置60 s,待包埋劑融化切片還未風(fēng)干時,迅速將切片置入4℃預(yù)冷的75%的乙醇中固定。

1.2.2 蘇木素-伊紅(HE)組織切片染色 切片置于4℃預(yù)冷的75%的乙醇中,固定60 s;冰上4℃預(yù)冷超純水中洗滌2次,每次大約5 s;蘇木素染色液中染色10 min;1%鹽酸酒精分化3 s;流水返藍10 min;伊紅染色液中染色10 s;梯度酒精脫水;二甲苯透明;樹膠封片。

1.2.3 甲基綠組織切片染色 切片于4℃預(yù)冷的75%的乙醇固定1 min;冰上4℃預(yù)冷超純水中洗滌2次,每次大約5 s;4℃預(yù)冷的1%甲基綠染色液(內(nèi)含蛋白酶抑制劑)中快速染色20 s;冰上的預(yù)冷超純水中洗滌2次,每次大約5 s;冰上4℃預(yù)冷的95%的乙醇中脫色1次,時間5 s;常溫下風(fēng)干3～5 min。

1.3 激光捕獲顯微切割

將已甲基綠染色的胃腺癌組織或正常胃黏膜上皮組織切片固定在顯微鏡的載物臺上,收集管安置在切片的下方隨激光移動。組織的形態(tài)結(jié)構(gòu)在合適的放大倍數(shù)下同步顯示在顯示器上,用鼠標(biāo)勾畫選擇的目的細(xì)胞的輪廓,激光沿著鼠標(biāo)線自動切割,根據(jù)視野、放大倍數(shù)和目的細(xì)胞分布等調(diào)整激光孔徑、速度及強度,切割目的細(xì)胞至收集管中。每片組織擺放的切割機的時間不易過長,在收集管蓋內(nèi)預(yù)先滴上2～3 μL的蛋白酶抑制劑,以免蛋白質(zhì)被空氣中的蛋白酶降解。每片組織片各使用一個收集管,并做好標(biāo)記,超低溫離心幾秒后,-80℃冰箱保存。

1.3.1 LCM純化的組織細(xì)胞總蛋白的制備 在收集的純化組織細(xì)胞中,加入組織裂解液(7 mol/L urea,2 mol/L thiourea,4%CHAPS,2%NP40,100 mmol/L DTT,0.5 mmol/L EDTA,5 mmol/L PMSF,1%TritonX-100,40 mmol/L Tris,2%Phamarlyte)常溫裂解1 h,14 000 g,4℃,離心45 min,取上清即為組織細(xì)胞總蛋白。

1.3.2 LCM純化的組織細(xì)胞總蛋白濃度的測定蛋白濃度的測定采用的是美國Thermo Scientific公司的微量BCA蛋白測定試劑盒。Thermo Scientific微量BCA蛋白定量分析試劑的線性工作范圍:0.5～20 μg/mL,操作步驟如下:(1)準(zhǔn)備顯色工作液:將 Micro BCA Reagent A(MA)、Micro BCA Reagent B(MB)、Micro BCA Reagent C(MC)按照 25∶24∶1的比例配成顯色工作液(working color reagent);制備標(biāo)準(zhǔn)曲線:根據(jù)試劑盒說明書用濃度為2 mg/mL的BSA標(biāo)準(zhǔn)液準(zhǔn)備標(biāo)準(zhǔn)曲線。(2)從稀釋管和樣品總蛋白中各吸取150 μL滴入96孔微板中;吸取150 μL顯色工作液滴入以上每孔蛋白微孔中,在微量盤振蕩器上震蕩30 s混勻;蓋上96孔板的蓋子,密封后放入37℃恒溫箱孵育2 h;從恒溫箱取出后在室溫下自然冷卻;放入酶標(biāo)儀中自動讀出562 nm波長下的吸光值;每個孔吸光值均減去蛋白濃度為0 μg/mL的吸光值;繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,計算直線回歸方程,算出待測樣品的蛋白濃度。

2 結(jié) 果

2.1 正常胃黏膜上皮和胃腺癌組織快速冰凍切片和HE病理切片

在制作激光捕獲顯微切割切片之前先行快速冰凍切片HE染色,明確組織類型是否符合實驗要求,防止浪費價格昂貴的薄膜載片。同時行普通HE病理切片確診。兩種組織的快速冰凍切片見圖1,普通HE病理切片見圖2。

圖1 正常胃黏膜上皮組織和胃腺癌組織的快速冰凍切片圖(HE染色) A:正常胃黏膜上皮組織(×100);B:正常胃黏膜上皮組織(×200);C:胃腺癌組織(×100);D:胃腺癌組織(×200)

圖2 正常胃黏膜上皮組織和胃腺癌組織普通病理切片(HE染色) A:正常胃黏膜上皮組織(×100);B:正常胃黏膜上皮組織(×200);C:胃腺癌組織(×100);D:胃腺癌組織(×200)

2.2 純化胃腺癌細(xì)胞(GAC)和正常胃黏膜上皮細(xì)胞(NGEC)

采用LCM技術(shù)分別從經(jīng)甲基綠染色正常胃黏膜上皮組織和胃腺癌組織中分離純化GAC和NGEC。根據(jù)目的細(xì)胞在切片中的位置和大小用鼠標(biāo)描出目的細(xì)胞群的輪廓,激光沿標(biāo)記的輪廓線切割,獲得目的細(xì)胞。

2.3 蛋白定量標(biāo)準(zhǔn)曲線與直線回歸方程

經(jīng)酶標(biāo)儀中自動讀出562 nm波長下的吸光值;每孔吸光值均減去蛋白濃度為0 μg/mL的吸光值;繪制出標(biāo)準(zhǔn)曲線,計算直線回歸方程(圖3),以此計算待測樣品的蛋白濃度。

圖3 標(biāo)準(zhǔn)曲線與直線回歸方程

3 討 論

胃癌是一種多基因多階段侵襲性疾病,近年來采用比較基因組雜交(cGH)、微陣列(mieroarray)等新技術(shù),從DNA或mRNA水平對胃癌進行了研究,由于基因功能的執(zhí)行者是蛋白質(zhì),且蛋白質(zhì)還存在修飾、定位、轉(zhuǎn)運、構(gòu)象變化等,因此,研究結(jié)果并不能完全真實反應(yīng)出細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)的變化。在疾病發(fā)生發(fā)展過程中,基因作用的發(fā)揮通過其表達產(chǎn)物蛋白質(zhì)實現(xiàn)[6-7]。直接從蛋白質(zhì)入手來研究胃癌,印證胃癌相關(guān)基因的改變,將更全面、真實地揭示胃癌的本質(zhì)改變[8-10]。

運用比較蛋白質(zhì)組學(xué)進行腫瘤研究,高純度組織的獲取是關(guān)鍵難題,由于間質(zhì)污染的存在,所提取的DNA、RNA或蛋白質(zhì)均難以準(zhǔn)確反應(yīng)同一類細(xì)胞的信息。因此,研究疾病發(fā)展的相關(guān)分子機制,獲取高純度細(xì)胞是獲得準(zhǔn)確結(jié)果的前提條件[11]。

激光捕獲顯微切割技術(shù),以其簡單、快速、以及精確度高等多功能特點,成功解決了從復(fù)雜組織中獲取單一細(xì)胞的難題[12]。通過電腦控制激光束的位置,沿著設(shè)定好的圖形自動切割后,特定細(xì)胞或組織就被準(zhǔn)確分離,收集于試管,切割過程自動完成。LCM技術(shù)的優(yōu)點是切割自動化、快速、定位精確、捕獲細(xì)胞形態(tài)保持完好、細(xì)胞損傷小、蛋白質(zhì)保存完好。LCM技術(shù)已廣泛應(yīng)用于石蠟、冰凍切片、細(xì)胞培養(yǎng)片、細(xì)胞涂片等各種樣本特定細(xì)胞的獲取。LCM聯(lián)合蛋白組學(xué)技術(shù)的應(yīng)用,所得實驗結(jié)果更接近真實。程愛蘭等[12]應(yīng)用LCM技術(shù),分別從鼻咽癌和正常的鼻咽上皮組織中純化出鼻咽癌細(xì)胞和正常鼻咽上皮細(xì)胞。Neubauer等[13]聯(lián)合應(yīng)用LCM與2DE技術(shù),發(fā)現(xiàn)了區(qū)別(ER)+/(PR)+和ER+/PR-乳腺預(yù)后的相關(guān)蛋白質(zhì)transgelin、cydophilinA及Neudesin,這些蛋白質(zhì)的差異表達,并發(fā)現(xiàn)ER+/PR+乳腺癌預(yù)后好于ER+/PR-的乳腺癌。上述研究表明LCM聯(lián)合蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù),可以為腫瘤標(biāo)志物的篩選提供有效方法。

采用冰凍切片,LCM切割純化目的細(xì)胞過程中染色劑的選擇亦顯重要。在蛋白質(zhì)組學(xué)研究中,LCM技術(shù)常用的組織染液包括蘇木素-伊紅、甲苯胺藍、甲基綠等[13],其中甲基綠染色劑易與DNA結(jié)合呈現(xiàn)綠色,是一種小分子堿性染料。已有研究證實甲基綠不會影響MALDI-TOF和Q-TOF結(jié)果[14-15]。因此在實驗中使用甲基綠對胃癌組織冰凍切片進行染色,可以較好的分辨復(fù)雜組織中不同類型的細(xì)胞,減少對后續(xù)質(zhì)譜的干擾。LCM冰凍切片制備與常規(guī)病理切片基本相同,因涉及到后期的核酸、蛋白質(zhì)研究應(yīng)注意避免污染。切片前,載物臺、機箱內(nèi)部均應(yīng)使用75%乙醇擦拭,晾干,組織切片的厚度以8 μm左右為好,因為切片較厚,雖捕獲所得細(xì)胞多,但易導(dǎo)致非目的細(xì)胞污染,切片太薄,雖捕獲細(xì)胞純凈,但太費時。蛋白質(zhì)的降解亦是LCM技術(shù)中的常見問題,由于進行切割時,切片必須暴露在常溫下,如切割時間過長,則會導(dǎo)致蛋白質(zhì)的降解,因此,切割操作室溫度要盡可能的調(diào)低,在甲基綠染色劑中和收集管中加入蛋白酶抑制劑可減少蛋白質(zhì)的降解。所以,事先周密的準(zhǔn)備標(biāo)本和掌握切割技巧是正確運用LCM技術(shù)的關(guān)鍵。篩選、純化胃癌和對應(yīng)正常胃黏膜上皮細(xì)胞之間的特異差異表達蛋白質(zhì),為胃癌蛋白質(zhì)組學(xué)研究提供前提基礎(chǔ)。尋找早期診斷及治療的蛋白質(zhì)分子標(biāo)志物將有待下一步深入研究與探討。

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