黨小利+陳文強+彭浩+鄧百萬+解修超

摘要：對2種不同形態(tài)豬苓（Polyporus umbellatus）菌核液體發(fā)酵生產(chǎn)胞外多糖進行了研究。結(jié)果表明，豬苓菌核液體發(fā)酵生產(chǎn)胞外多糖的發(fā)酵條件是溫度28 ℃，pH 4.8～5.5， 振蕩速度110 r/min，通氣量4 L/min，罐壓0.090 0 MPa，發(fā)酵7 d，每12 h取樣測其胞外多糖的含量，在72 h和60 h時豬苓（FrCM2）和豬苓（FrCM3）液體發(fā)酵產(chǎn)胞外多糖的含量分別為1.783和0.044 mg/mL，豬苓（FrCM2）液體發(fā)酵產(chǎn)胞外多糖含量明顯高于豬苓（FrCM3）。

關(guān)鍵詞：豬苓（Polyporus umbellatus）；液體發(fā)酵；胞外多糖

中圖分類號：S567.3；R282.7 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2014）01-0171-04

Exopolysaccharide Production by Liquid Fermentation of Two Polyporus umbellatus

DANG Xiao-li1，CHEN Wen-qiang2，PENG Hao2，DENG Bai-wan2，XIE Xiu-chao2

（1.Weinan Vocational Technical College， Weinan 714000， Shaanxi， China； 2. School of Biological Science and Engineering， Shaanxi University of Technology/Shaanxi Engineering Research Center of Edible and Medicated Fungi， Hanzhong 723001， Shaanxi， China）

Abstract： The exopolysaccharide of two Polyporus umbellatus by liquid fermentation was analyzed. The results showed when fermented 7 d under 28 ℃ and pH 4.8～5.5 with rotational speed 110 r/min， ventilation quantity 4 L/min and pot press 0.0900 MPa， the exopolysaccharide content of P. umbellatus（FrCM2） and P. umbellatus（FrCM3） reached peak at 72 h and 60 h， and the contents were o 1.783 mg/mL and 0.044 mg/mL respectively. It indicated that the contents of exopolysaccharide of P.umbellatus（FrCM2） were significantly higher than that of P.s umbellatus（FrCM3）.

Key words： Polyporus umbellatus； liquid fermentation； exopolysaccharide

收稿日期：2013-05-10

作者簡介：黨小利（1979-），女，陜西澄城人，副教授，主要從事微生物學教學和研究工作，（電話）15129849122（電子信箱）dangwangyan@sohu.com；

通訊作者，陳文強（1956-），男，陜西洋縣人，教授，碩士生導(dǎo)師，主要從事微生物資源保護與開發(fā)利用研究，（電子信箱）

wenqiangc@126.com。

豬苓（Polypro umbelletus）是一種重要的藥用真菌，屬擔子菌門擔子菌綱多孔菌目（非褶菌目）多孔菌科豬苓屬，別名豬茯苓、豬屎苓、地烏桃。其菌核體的大小和形狀與生姜的根莖相似[1]，呈長形塊狀或不規(guī)則塊狀，半木質(zhì)化，稍扁，表面灰黑或黑色，凹凸不平。子實體從埋生于地下的菌核內(nèi)生出，多數(shù)合生，菌柄往往于基部相連或大量分枝，形成一叢菌蓋[2]，菌蓋圓形，中部下凹進呈淺漏斗形，邊緣內(nèi)卷，總直徑達到15 cm以上，俗稱“豬苓花”，可食用且味道鮮美。中國野生豬苓主要分布在河北、河南、安徽、浙江、福建、湖南、湖北、四川、貴州、云南、山西、陜西、甘肅、青海、內(nèi)蒙古及東北等地。

近年來，國內(nèi)外研究發(fā)現(xiàn)豬苓中含水溶性多聚糖化合物、豬苓聚糖（Gu-1）、麥角甾醇（Ergostol，C28H44O）、α-羥基-廿四碳酸（α-Hydroxy-tetracosanoic acid，C24H48O3）、生物素（維生素H、Biotin）、粗蛋白等，具有廣闊的開發(fā)價值和應(yīng)用前景。多糖是由許多單糖分子以糖苷鍵結(jié)合而成的天然高分子化合物，是生命有機體的重要組成部分，廣泛存在于各種生物體組織中，根據(jù)功能不同可分為結(jié)構(gòu)多糖和活性多糖?；钚远嗵怯钟屑兌嗵呛碗s多糖之分，活性多糖專指具有某種特殊生物活性的多糖化合物，如真菌多糖、植物多糖和殼聚糖等。這些多糖具有復(fù)雜的多方面的生理活性和功能，如具有免疫調(diào)節(jié)功能、抗腫瘤作用、延緩衰老作用、降血脂抗血栓作用等功能，因而越來越引起人們的關(guān)注[3]。真菌多糖是從食藥用真菌子實體、菌絲體和發(fā)酵液中分離出的代謝產(chǎn)物，在國際上被稱為“生物反應(yīng)調(diào)節(jié)劑”（簡稱BRM）[4]，是食藥用真菌中具有生物活性的有效組分之一，且來源于食藥用真菌多糖的部分產(chǎn)品已進入臨床試驗，用于癌癥等疾病的免疫治療[5]。

20世紀70年代，日本學者首次從豬苓菌核中提取而成具有顯著生理活性的一類物質(zhì)—豬苓多糖[6-8]，豬苓多糖是存在于豬苓的菌絲體和子實體中的水溶性多糖，中醫(yī)臨床上常用于治療急性腎炎、全身浮腫、小便不暢、尿急尿頻、尿道疼痛、受暑水瀉以及急性肝炎、急性胃炎等疾病。近年來的研究表明，從野生豬苓中提取的豬苓多糖是一種非特異性細胞免疫刺激劑，能顯著地增強網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)吞噬細胞的功能，使癌細胞生長受到抑制，具有明顯的抗腫瘤作用，臨床上用于肺癌、白血病、肝癌等放射治療（放療）和化學藥物治療（化療）的輔助治療，可提高患者的抗病能力，這引起了醫(yī)學界對豬苓研究的重視。研究證明，從液體培養(yǎng)的豬苓菌絲體和發(fā)酵液中提取的豬苓多糖與從野生豬苓菌核提取的豬苓多糖一樣具有抗腫瘤作用[9]。豬苓胞外多糖液體發(fā)酵法可以不受季節(jié)限制進行工業(yè)化連續(xù)生產(chǎn)，其規(guī)模大、產(chǎn)量高、發(fā)酵周期短、生產(chǎn)成本低，具有廣闊的發(fā)展前景[9，10]。

在豬苓液體發(fā)酵過程中除菌絲或孢子大量增殖外，還會產(chǎn)生多糖、多肽、生物堿、萜類化合物及甾醇、酶、核酸、氨基酸、維生素、植物激素等多種具有生理活性的物質(zhì)，具有抗癌、抗炎、抗菌、抗衰老、抗?jié)兊裙π11]。雖然從子實體中也可獲得這些物質(zhì)，但無論從生產(chǎn)規(guī)模、生產(chǎn)周期及經(jīng)濟效益等方面均不及用液體發(fā)酵來獲取[12，13]。因此，以豬苓深層液體發(fā)酵生產(chǎn)豬苓胞外多糖為目的產(chǎn)物，可以簡化生產(chǎn)工藝、降低成本、提高生產(chǎn)效率。

目前有關(guān)豬苓液體發(fā)酵生產(chǎn)胞外多糖的研究報道較少，本研究對秦巴山區(qū)2種不同形態(tài)豬苓菌核（當?shù)厮酌u屎苓、鐵蛋豬屎苓）液體發(fā)酵生產(chǎn)胞外多糖進行了分析，旨在為工業(yè)化生產(chǎn)豬苓胞外多糖提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌種 豬苓由陜西省食藥用菌工程技術(shù)研究中心提供。分兩種：一種為分枝少呈長形塊狀，表面較光滑，俗稱豬屎苓 （FrCM2）；一種呈不規(guī)則球形，俗稱鐵蛋豬屎苓（FrCM3）。

1.1.2 培養(yǎng)基 PDA培養(yǎng)基（馬鈴薯200.0 g，葡萄糖20.0 g，KH2PO4 5.0 g，MgSO4·7H2O 3.0 g，維生素B1 0.1 g，瓊脂18.0 g，pH自然）；液體種子培養(yǎng)基（玉米粉30.0 g，酵母膏 30.0 g，KH2PO4 1.0 g，MgSO4·7H2O 1.0 g，CaCO3 1.0 g，維生素B1 0.1 g，pH 5.4～5.8）；液體發(fā)酵培養(yǎng)基（土豆100.0 g，KH2PO4 5.0 g，MgSO4·7H2O 2.5 g，維生素B1 0.01 g，玉米粉10.0 g，豆餅粉 2.0 g，pH 4.5～5.8）。

1.1.3 試劑 5%苯酚溶液（放置在棕色試劑瓶中冷藏于冰箱），98%H2SO4，0.1 mg/mL的標準葡萄糖溶液。

1.1.4 主要儀器與設(shè)備 BIOTECH-7BGZ型在位滅菌發(fā)酵罐（上海保興生物設(shè)備工程有限公司），722型分光光度儀（上海光譜儀器有限公司），GTR25-1型高速冷凍離心機（江蘇南通理能實驗器材有限公司），HZ2014A型恒溫培養(yǎng)箱（上海智誠分析儀器制造有限公司），ZHWY-210 2C型搖床（上海志成公司），BHC-1300IIA2型超凈工作臺（蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司），F(xiàn)A1604型電子天平（上海精科天美科學儀器有限公司）等。

1.2 方法

1.2.1 菌種活化 配制PDA培養(yǎng)基，分裝試管，121.3 ℃滅菌30 min，擺斜面。接種，在25～28 ℃恒溫箱中培養(yǎng)，待菌絲滿管后置4 ℃冰箱保藏備用。

1.2.2 一級種制備 配制液體種子培養(yǎng)基，分裝于100 mL三角瓶中，裝液量30 mL，121.3 ℃滅菌30 min，冷卻后接0.5～1.0 cm2活化的菌塊，160 r/min振蕩，28 ℃恒溫培養(yǎng)10～15 d。

1.2.3 二級種制備 配制液體種子培養(yǎng)基，分裝于1 000 mL三角瓶中，裝液量為500 mL，121.3 ℃滅菌30 min，冷卻后接一級液體種，接種量為10%，160 r/min振蕩，28 ℃恒溫培養(yǎng)10～15 d。

1.2.4 液體發(fā)酵 配制5 000 mL液體發(fā)酵培養(yǎng)基裝入發(fā)酵罐中，加入0.1%的植物油作為消泡劑，121.3 ℃滅菌30 min，冷卻后接豬苓二級液體種，接種量為10%。在通氣量4 L/min，振蕩速度110 r/min，pH 4.8～5.5，28 ℃條件下進行液體發(fā)酵，發(fā)酵時間為7 d。

1.2.5 豬苓菌核胞外多糖含量的測定 5%苯酚溶液的制備：精確稱量苯酚晶體5.0 g，加去離子水溶解并定容至100 mL，混勻后再轉(zhuǎn)入棕色試劑瓶，超聲波處理30 min后置于冰箱中保存?zhèn)溆?。繪制葡萄糖標準曲線：精確稱取105 ℃干燥至恒重的葡萄糖標準品100.0 mg于100 mL容量瓶中，定容至100 mL，混勻后取10 mL于另一個100 mL的容量瓶中，定容至100 mL，制成0.1 mg/mL的對照品溶液，分別稀釋至5.0、10.0、20.0、30.0、40.0、50.0 μg/mL 6種濃度。吸取不同濃度對照品溶液各1.0 mL置于試管中，加5%的苯酚溶液1.5 mL，混勻后迅速加入7.5 mL的98% H2SO4，用純水作空白對照，搖勻后40 ℃水浴30 min，冰浴5 min，在490 nm處用分光光度計測定其吸光度，以葡萄糖濃度（μg/mL）為橫坐標x，吸光度為縱坐標y，經(jīng)計算得回歸方程：y=0.022 7x-0.032 0，R2=0.998 6。繪制葡萄糖標準曲線（圖1）。結(jié)果表明，葡萄糖濃度在10～50 μg/mL濃度范圍內(nèi)與吸光度呈良好的線性關(guān)系。

豬苓菌核胞外多糖檢測：將50 mL豬苓菌核發(fā)酵液 6 000 r/min離心20 min[14]，取離心后的上清液0.2 mL于100 mL的容量瓶中，定容至100 mL，搖勻后吸取1.0 mL于試管中，加入5%苯酚1.5 mL搖勻，再迅速加入98%H2SO4 7.5 mL，40 ℃水浴放置30 min，冰浴5 min，在490 nm下測定其吸光度。根據(jù)標準曲線和回歸方程計算其多糖含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 2種不同形態(tài)豬苓菌核（FrCM2、FrCM3）液體發(fā)酵產(chǎn)胞外多糖的結(jié)果

在發(fā)酵溫度為28 ℃，通氣量4 L/min，接種量10%，振蕩速度110 r/min， pH 4.8～5.5條件下發(fā)酵7 d。發(fā)酵過程中每12 h取樣50 mL，6 000 r/min離心20 min，取上清液，測定2種不同形態(tài)豬苓菌核（FrCM2、FrCM3）液體發(fā)酵產(chǎn)生的胞外多糖，結(jié)果見圖2、圖3。

由圖2可見， 不同發(fā)酵時間對豬苓（FrCM2）液體發(fā)酵產(chǎn)胞外多糖的含量有明顯影響。在培養(yǎng)12 h后，豬苓菌絲體產(chǎn)生的胞外多糖含量呈緩慢增加趨勢，48 h時豬苓胞外多糖的含量開始明顯增加。表明豬苓菌絲細胞處于對數(shù)生長期，菌絲體生成速度加快，pH相對比較穩(wěn)定，此時胞外多糖大量合成，在72 h時達到最大值1.783 mg/mL。之后由于發(fā)酵后期底物濃度大大降低，加之在代謝產(chǎn)物抑制等因素的影響下，豬苓菌絲體已不能維持正常的生長代謝，細胞大量死亡自溶，且分泌產(chǎn)生的胞外多糖可能又被自身利用，因此豬苓（FrCM2）胞外多糖的含量逐漸下降。

由圖3可見，不同發(fā)酵時間對豬苓（FrCM3）液體發(fā)酵產(chǎn)胞外多糖的含量亦有較明顯影響。在發(fā)酵60 h時豬苓胞外多糖含量達到峰值，之后隨培養(yǎng)時間的延長豬苓胞外多糖含量隨之降低，此變化曲線與微生物生長的規(guī)律相一致。在發(fā)酵開始時豬苓胞外多糖含量無明顯的變化，48 h后呈增加趨勢，此時豬苓菌絲體逐漸進入對數(shù)生長期，生長速度加快，至60 h時其胞外多糖含量增至最高值，達0.044 mg/mL；之后豬苓胞外多糖含量開始緩慢降低，此時豬苓菌絲生長速度減慢，再加之營養(yǎng)物質(zhì)消耗和代謝產(chǎn)物積累，在發(fā)酵120 h后，豬苓菌絲體已不能維持正常的生長代謝，細胞大量死亡自溶，因此豬苓（FrCM3）胞外多糖的含量逐漸下降。

2.2 2種豬苓菌核液體發(fā)酵生產(chǎn)胞外多糖的比較分析

圖2和圖3結(jié)果表明，2種不同形態(tài)豬苓菌核液體發(fā)酵生產(chǎn)胞外多糖在發(fā)酵的不同時期，胞外多糖含量差異較大。豬苓（FrCM2）發(fā)酵液中胞外多糖含量高于豬苓（FrCM3）發(fā)酵液中胞外多糖的含量。發(fā)酵72 h時，豬苓（FrCM2）發(fā)酵液中胞外多糖含量達到峰值1.783 mg/mL，發(fā)酵60 h時，豬苓（FrCM3）發(fā)酵液中胞外多糖含量達峰值0.044 mg/mL。豬苓（FrCM2）液體發(fā)酵產(chǎn)胞外多糖含量明顯高于豬苓（FrCM3）。

3 小結(jié)與討論

1）本試驗在相同條件下對2種不同形態(tài)豬苓菌核進行了液體發(fā)酵生產(chǎn)胞外多糖的研究，在發(fā)酵72 h時豬苓（FrCM2）發(fā)酵液中胞外多糖含量達到1.783 mg/mL，在發(fā)酵60 h豬苓（FrCM3）發(fā)酵液中胞外多糖含量達到0.044 mg/mL。豬苓（FrCM2）和（FrCM3）液體發(fā)酵所產(chǎn)生的胞外多糖含量差異較大，原因可能是這2種豬苓屬不同的物種，但要確定豬苓（FrCM2）和（FrCM3）是否屬于不同物種尚有待進一步研究。

2）本試驗采用苯酚-硫酸法測定發(fā)酵液中豬苓胞外多糖的含量，此法具有穩(wěn)定性和重現(xiàn)性好等優(yōu)點，在測定胞外多糖含量過程中被廣泛采用。

3）液體發(fā)酵宜采用二級菌種接種。這樣可避免雜菌污染，有利于菌種成活。

4）豬苓液體發(fā)酵培養(yǎng)基中含有玉米粉，在測定發(fā)酵液中胞外多糖含量時，有些可溶性的淀粉和其他多糖會混合其中，影響其測定結(jié)果的準確性。尚需對豬苓液體發(fā)酵液中胞外多糖的檢測標準進行進一步研究。

參考文獻：

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（責任編輯 曾德芳）

由圖3可見，不同發(fā)酵時間對豬苓（FrCM3）液體發(fā)酵產(chǎn)胞外多糖的含量亦有較明顯影響。在發(fā)酵60 h時豬苓胞外多糖含量達到峰值，之后隨培養(yǎng)時間的延長豬苓胞外多糖含量隨之降低，此變化曲線與微生物生長的規(guī)律相一致。在發(fā)酵開始時豬苓胞外多糖含量無明顯的變化，48 h后呈增加趨勢，此時豬苓菌絲體逐漸進入對數(shù)生長期，生長速度加快，至60 h時其胞外多糖含量增至最高值，達0.044 mg/mL；之后豬苓胞外多糖含量開始緩慢降低，此時豬苓菌絲生長速度減慢，再加之營養(yǎng)物質(zhì)消耗和代謝產(chǎn)物積累，在發(fā)酵120 h后，豬苓菌絲體已不能維持正常的生長代謝，細胞大量死亡自溶，因此豬苓（FrCM3）胞外多糖的含量逐漸下降。

2.2 2種豬苓菌核液體發(fā)酵生產(chǎn)胞外多糖的比較分析

圖2和圖3結(jié)果表明，2種不同形態(tài)豬苓菌核液體發(fā)酵生產(chǎn)胞外多糖在發(fā)酵的不同時期，胞外多糖含量差異較大。豬苓（FrCM2）發(fā)酵液中胞外多糖含量高于豬苓（FrCM3）發(fā)酵液中胞外多糖的含量。發(fā)酵72 h時，豬苓（FrCM2）發(fā)酵液中胞外多糖含量達到峰值1.783 mg/mL，發(fā)酵60 h時，豬苓（FrCM3）發(fā)酵液中胞外多糖含量達峰值0.044 mg/mL。豬苓（FrCM2）液體發(fā)酵產(chǎn)胞外多糖含量明顯高于豬苓（FrCM3）。

3 小結(jié)與討論

1）本試驗在相同條件下對2種不同形態(tài)豬苓菌核進行了液體發(fā)酵生產(chǎn)胞外多糖的研究，在發(fā)酵72 h時豬苓（FrCM2）發(fā)酵液中胞外多糖含量達到1.783 mg/mL，在發(fā)酵60 h豬苓（FrCM3）發(fā)酵液中胞外多糖含量達到0.044 mg/mL。豬苓（FrCM2）和（FrCM3）液體發(fā)酵所產(chǎn)生的胞外多糖含量差異較大，原因可能是這2種豬苓屬不同的物種，但要確定豬苓（FrCM2）和（FrCM3）是否屬于不同物種尚有待進一步研究。

2）本試驗采用苯酚-硫酸法測定發(fā)酵液中豬苓胞外多糖的含量，此法具有穩(wěn)定性和重現(xiàn)性好等優(yōu)點，在測定胞外多糖含量過程中被廣泛采用。

3）液體發(fā)酵宜采用二級菌種接種。這樣可避免雜菌污染，有利于菌種成活。

4）豬苓液體發(fā)酵培養(yǎng)基中含有玉米粉，在測定發(fā)酵液中胞外多糖含量時，有些可溶性的淀粉和其他多糖會混合其中，影響其測定結(jié)果的準確性。尚需對豬苓液體發(fā)酵液中胞外多糖的檢測標準進行進一步研究。

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（責任編輯 曾德芳）

由圖3可見，不同發(fā)酵時間對豬苓（FrCM3）液體發(fā)酵產(chǎn)胞外多糖的含量亦有較明顯影響。在發(fā)酵60 h時豬苓胞外多糖含量達到峰值，之后隨培養(yǎng)時間的延長豬苓胞外多糖含量隨之降低，此變化曲線與微生物生長的規(guī)律相一致。在發(fā)酵開始時豬苓胞外多糖含量無明顯的變化，48 h后呈增加趨勢，此時豬苓菌絲體逐漸進入對數(shù)生長期，生長速度加快，至60 h時其胞外多糖含量增至最高值，達0.044 mg/mL；之后豬苓胞外多糖含量開始緩慢降低，此時豬苓菌絲生長速度減慢，再加之營養(yǎng)物質(zhì)消耗和代謝產(chǎn)物積累，在發(fā)酵120 h后，豬苓菌絲體已不能維持正常的生長代謝，細胞大量死亡自溶，因此豬苓（FrCM3）胞外多糖的含量逐漸下降。

2.2 2種豬苓菌核液體發(fā)酵生產(chǎn)胞外多糖的比較分析

圖2和圖3結(jié)果表明，2種不同形態(tài)豬苓菌核液體發(fā)酵生產(chǎn)胞外多糖在發(fā)酵的不同時期，胞外多糖含量差異較大。豬苓（FrCM2）發(fā)酵液中胞外多糖含量高于豬苓（FrCM3）發(fā)酵液中胞外多糖的含量。發(fā)酵72 h時，豬苓（FrCM2）發(fā)酵液中胞外多糖含量達到峰值1.783 mg/mL，發(fā)酵60 h時，豬苓（FrCM3）發(fā)酵液中胞外多糖含量達峰值0.044 mg/mL。豬苓（FrCM2）液體發(fā)酵產(chǎn)胞外多糖含量明顯高于豬苓（FrCM3）。

3 小結(jié)與討論

1）本試驗在相同條件下對2種不同形態(tài)豬苓菌核進行了液體發(fā)酵生產(chǎn)胞外多糖的研究，在發(fā)酵72 h時豬苓（FrCM2）發(fā)酵液中胞外多糖含量達到1.783 mg/mL，在發(fā)酵60 h豬苓（FrCM3）發(fā)酵液中胞外多糖含量達到0.044 mg/mL。豬苓（FrCM2）和（FrCM3）液體發(fā)酵所產(chǎn)生的胞外多糖含量差異較大，原因可能是這2種豬苓屬不同的物種，但要確定豬苓（FrCM2）和（FrCM3）是否屬于不同物種尚有待進一步研究。

2）本試驗采用苯酚-硫酸法測定發(fā)酵液中豬苓胞外多糖的含量，此法具有穩(wěn)定性和重現(xiàn)性好等優(yōu)點，在測定胞外多糖含量過程中被廣泛采用。

3）液體發(fā)酵宜采用二級菌種接種。這樣可避免雜菌污染，有利于菌種成活。

4）豬苓液體發(fā)酵培養(yǎng)基中含有玉米粉，在測定發(fā)酵液中胞外多糖含量時，有些可溶性的淀粉和其他多糖會混合其中，影響其測定結(jié)果的準確性。尚需對豬苓液體發(fā)酵液中胞外多糖的檢測標準進行進一步研究。

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（責任編輯 曾德芳）