張 玲，樊 華

(1.天津醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院藥劑科，天津 300210；2.天津市南開醫(yī)院藥劑科，天津 300100)

羅格列酮對順鉑所致腎損傷大鼠腎功能的改善作用及其抗氧化應(yīng)激作用機(jī)制

張 玲1，樊 華2

(1.天津醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院藥劑科，天津 300210；2.天津市南開醫(yī)院藥劑科，天津 300100)

目的 探討羅格列酮(ROM)對順鉑(DDP)所致腎損傷大鼠腎功能的改善作用及其抗氧化應(yīng)激作用機(jī)制。方法 體外實(shí)驗(yàn):DDP 0.4～100 μmol·L－1與人HEK293細(xì)胞單獨(dú)作用48 h,或者提前2 h加入ROM 0.01～1000 μmol·L－1再與DDP 25 μmol·L－1聯(lián)合作用48 h,用MTT法測定細(xì)胞存活率；提前2 h加入ROM 100 μmol·L－1再與DDP 25 μmol·L－1聯(lián)合作用48 h,用比色法測定細(xì)胞培養(yǎng)液中丙二醛(MDA)濃度和谷胱甘肽過氧化物酶(GSH)活性。體內(nèi)實(shí)驗(yàn):將60只大鼠隨機(jī)分為正常對照、模型(DDP 5 mg·kg－1)、模型＋ROM 5,10和20 mg·kg－1組,DDP 5 mg·kg－1尾靜脈注射,每周1次,連續(xù)3周,制備DDP腎損傷大鼠模型；在第1次注射DDP后,模型＋ROM 5,10和20 mg·kg－1組ig給予ROM,每天1次,連續(xù)8周。8周后腹主動(dòng)脈取血,用生化分析儀檢測大鼠血清尿素氮(BUN)和肌酐(Cr)水平,用比色法檢測腎組織一氧化氮(NO)和MDA含量及一氧化氮合酶(NOS)、GSH和超氧化物歧化酶(SOD)活性,同時(shí)取腎組織用HE染色觀察腎組織病理改變。結(jié)果 體外實(shí)驗(yàn):DDP單獨(dú)作用48 h抑制 HEK293細(xì)胞存活的IC50值為21.0 μmol·L－1；提前2 h加入ROM 1～1000 μmol·L－1再與 DDP 25 μmol·L－1繼續(xù)共孵育48 h,與DDP 25 μmol·L－1單用組比較,HEK293細(xì)胞存活率明顯升高(P＜0.05,P＜0.01)；DDP 25 μmol·L－1與ROM 100 μmol·L－1聯(lián)合作用48 h,細(xì)胞培養(yǎng)液中MDA含量與DDP 25 μmol·L－1單用組比較明顯降低(P＜0.01), GSH活性明顯升高(P＜0.01)。體內(nèi)實(shí)驗(yàn):與正常對照組相比,模型組血清BUN和Cr含量明顯升高(P＜0.01),腎組織MDA含量升高(P＜0.01),GSH和SOD活性降低(P＜0.01),NO含量和NOS活性亦明顯降低(P＜0.05)。與模型組比較,模型＋ROM 5,10和20 mg·kg－1組血清BUN從(17.0±1.3)mmol·L－1降低至14.0±4.1,11.2±1.8和(6.1±1.0)mmol·L－1(P＜0.01)；模型＋ROM 10和20 mg·kg－1組血清Cr含量從(124.6±39.8)mmol·L－1降低至49.0±5.2和(47.1±2.9)mmol·L－1(P＜0.01),腎組織GSH和SOD活性升高(P＜0.05,P＜0.01),MDA含量降低(P＜0.05,P＜0.01),NO含量和NOS活性亦明顯升高(P＜0.05,P＜0.01),腎組織病理損傷減輕。結(jié)論 ROM對DDP所致腎損傷大鼠腎功能具有保護(hù)作用,其作用機(jī)制可能與其抗氧化應(yīng)激作用有關(guān)。

羅格列酮；順鉑；腎損傷；氧化應(yīng)激

順鉑(cisplatin，DDP)為治療多種實(shí)體瘤的一線用藥，是當(dāng)前化療中最常用的藥物之一，具有抗癌譜廣、作用強(qiáng)、與多種抗腫瘤藥有協(xié)同作用且無交叉耐藥等特點(diǎn)。但是DDP作為一種細(xì)胞毒性藥物，其在治療腫瘤的同時(shí)引起腎毒性，影響患者的生活質(zhì)量。大劑量或連續(xù)給藥時(shí)，可使腎小管損傷表現(xiàn)為不可逆性，嚴(yán)重者可導(dǎo)致腎衰竭甚至死亡[1－3]。目前，DDP所致腎毒性的機(jī)制尚不十分清楚。研究表明，DDP在機(jī)體中破壞氧自由基代謝的平衡狀態(tài)從而引發(fā)氧化應(yīng)激[4－5]。近來研究發(fā)現(xiàn)，羅格列酮(rosiglitazone，ROM)可以降低高糖環(huán)境對腎的氧化應(yīng)激損傷，對腎氧化應(yīng)激損傷有一定的保護(hù)作用[6－7]，本研究采用DDP制備大鼠腎損傷模型，探討ROM對DDP所致腎氧化應(yīng)激損傷是否有保護(hù)作用，從而為臨床DDP所致氧化應(yīng)激的輔助治療提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物、藥物、試劑和儀器

雄性SD大鼠，體質(zhì)量200～240 g，SPF級，北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，動(dòng)物許可證號: SCXX(京)2007-0001。ROM，濟(jì)南中科一通化工有限公司，批號:101N852，生理鹽水溶解備用；DDP針劑，濟(jì)南齊魯制藥有限公司，批號1020032DB。MTT，美國Sigma公司；胎牛血清、DMEM培養(yǎng)基和胰酶，美國Gibco公司；超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)、丙二醛(malondialdehyde，MDA)、谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase，GSH)、一氧化氮(nitric oxide，NO)和一氧化氮合酶(nitric oxide synthase，NOS)測定試劑盒，南京建成生物工程研究所。全自動(dòng)血液生化分析儀，日本Hitachi公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

人胚腎細(xì)胞HEK293細(xì)胞，上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞庫；培養(yǎng)基為含雙抗及10%新生牛血清的DMEM(含丙酮酸鈉)，于37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，取處于指數(shù)生長期的細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

1.3 MTT法測定細(xì)胞存活率[8]

將HEK293細(xì)胞接種于96孔板中，每孔4.0×103細(xì)胞，24 h后分別加入不同濃度的DDP，使其終濃度分別為0.4，0.8，1.6，3.125，6.25，12.5，25，50和100 μmol·L－1，每個(gè)濃度設(shè)3復(fù)孔，孵育48 h后后加入MTT 0.5 g·L－1，每孔20 μL，于37℃下共孵育4 h，吸除培養(yǎng)液后加入等體積的DMSO，室溫振蕩10 min，490 nm測定其吸光度(A490nm)值。

將HEK293細(xì)胞接種于96孔板中，每孔5×103細(xì)胞，分為溶劑對照組、DDP 25 μmol·L－1組和DDP＋ROM 0.01，0.1，1，10，100和1000 μmol·L－1組，每組均設(shè)6復(fù)孔，培養(yǎng)24 h后，DDP＋ROM組加入不同濃度的ROM，2 h后加入DDP 25 μmol·L－1，孵育48 h后同上檢測細(xì)胞存活率。細(xì)胞存活率(%)＝實(shí)驗(yàn)組A490nm/對照組A490nm×100%。

1.4 細(xì)胞內(nèi)MDA含量和GSH活性測定

將HEK293細(xì)胞3 mL接種到6孔板中，接種密度為3×107L－1，分成正常對照、DDP、ROM和DDP＋ROM組，24 h后ROM和DDP＋ROM組加入ROM，終濃度為100 μmol·L－1，2 h后DDP和DDP＋ROM組加入終濃度為25 μmol·L－1的DDP，48 h后消化并收集細(xì)胞，PBS洗2次，1680×g離心15 min，棄上清液，PBS清洗，反復(fù)凍融3次，1680×g離心15 min，取上清液為細(xì)胞勻漿，考馬斯亮藍(lán)法測定蛋白質(zhì)含量[9]，按照試劑盒說明書測定MDA含量和GSH活性。

1.5 酶標(biāo)法測定大鼠血清BUN和Cr含量、腎組織NO和MDA含量及NOS，SOD和GSH酶活性

將60只SD鼠隨機(jī)分為正常對照、模型(DDP 5 mg·kg－1)、模型＋ROM 5，10和20 mg·kg－1組，每組12只。除正常對照組外，其余各組尾靜脈注射DDP 5 mg·kg－1，每周1次，連續(xù)3周，制備DDP腎毒性模型。正常對照組給予等量生理鹽水，模型＋ROM 5，10和20 mg·kg－1組在第1次注射DDP后ig給予相應(yīng)劑量的ROM，正常對照組和模型組給予相應(yīng)體積的生理鹽水，連續(xù)給藥8周，末次給藥24 h后將大鼠麻醉后在無菌條件下腹主動(dòng)脈取血，制備血清，全自動(dòng)生化分析儀檢測BUN和Cr含量。取出1 g腎組織加入9 mL生理鹽水于玻璃勻漿管中制成10%組織勻漿，勻漿后于4℃12 000×g離心20 min，取上清，考馬斯亮藍(lán)法測定腎組織蛋白含量[9]，嚴(yán)格按照試劑盒說明測定MDA水平、SOD和GSH的活性、NO含量和NOS活性。

1.6 HE染色觀察腎組織病理變化

腎組織用體積分?jǐn)?shù)為0.04甲醛固定48 h，脫水后石蠟包埋，制片，HE染色，在光鏡下檢查。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 DDP對HEK293細(xì)胞存活率的影響

由圖1可知，DDP體外對HEK293存活具有抑制作用，隨DDP濃度的升高，細(xì)胞存活率下降，IC50值為20.1 μmol·L－1。

Fig.1 Effect of cisplatin(DDP)on cell survival of human HEK293 cells in vitro.HEK293 Cells were cultured with DDP 0.4，0.8，1.6，3.125，6.25，12.5，25，50 and 100 μmol·L－1for 48 h，and MTT assay was used to detect survival cells.Survival rate(%)＝A490nmof DDP group/A490nmof control group×100%.，n＝3.

2.2 ROM對DDP損傷HEK293細(xì)胞存活率的影響

由表1可知，DDP 25 μmol·L－1與HEK293細(xì)胞單獨(dú)孵育48 h，細(xì)胞存活率為(27.6±3.2)%；ROM 1～100 μmol·L－1預(yù)孵育 2 h可顯著提高HEK293細(xì)胞存活率(P＜0.05，P＜0.01)，表明ROM可減輕DDP對HEK293細(xì)胞的毒性作用。

Tab.1 Effect of rosiglitazone(ROM)on survival rate of HEK293 cells damaged by DDP in vitro

2.3 ROM對DDP損傷HEK293細(xì)胞MDA和GSH的影響

由表2可知，與正常對照組相比，ROM組MDA含量和GSH活性無明顯變化；DDP組細(xì)胞內(nèi)MDA含量升高(P＜0.01)，GSH活性降低(P＜0.05)。與DDP組相比，DDP＋ROM組MDA含量顯著降低(P＜0.01)，GSH活性升高(P＜0.01)，其中GSH活性接近正常對照組水平。

Tab.2 Effect of ROM on malondialdehyde(MDA)and glutathione peroxidase(GSH)in HEK293 cells damaged by DDP in vitro

2.4 ROM對DDP損傷大鼠血清BUN和Cr水平的影響

如表3所示，與正常對照組相比，模型組血清BUN和Cr含量明顯升高(P＜0.01)；模型＋ROM 5，10和20 mg·kg－1組血清BUN和Cr含量與模型相比明顯下降(P＜0.05，P＜0.01)，其中模型＋ROM 20 mg·kg－1組接近正常對照組水平。

Tab.3 Effect of ROM on serum level of blood urea nitrogen(BUN)and creatinine(Cr)of rats damaged by DDP

2.5 ROM對DDP損傷大鼠腎組織MDA水平、GSH和SOD活性的影響

如表4所示，與正常對照組相比，模型組MDA水平明顯升高(P＜0.01)，GSH和SOD活性明顯降低(P＜0.01)；模型＋ROM 10和 20 mg·kg－1組MDA含量與模型組相比明顯降低(P＜0.05)，SOD和GSH活性明顯升高(P＜0.05，P＜0.01)，其中模型＋ROM 20 mg·kg－1接近正常對照組水平。

Tab.4 Effect of ROM on MDA level and activities of superoxide dismutase(SOD)and GSH in renal tissue of rats damaged by DDP

2.6 ROM對DDP損傷大鼠腎組織NO含量和NOS活性的影響

如表5所示，與正常對照組相比，模型組NO水平明顯降低(P＜0.01)，NOS活性也明顯下降(P＜0.05)；模型＋ROM 5，10和20 mg·kg－1組與模型組相比NO含量和NOS活性顯著升高(P＜0.05，P＜0.01)，其中模型＋ROM 20 mg·kg－1組接近正常對照組水平。

Tab.5 Effect of ROM on nitric oxide(NO)level and nitric oxide synthase(NOS)activity in renal tissue of rats damaged by DDP

2.7 ROM對DDP損傷大鼠腎組織病理變化的影響

Fig.2 Effect of ROM on histopathological changes in renal tissue of rats damaged by DDP(HE，×100).A: normal control；B:model group，the arrows indicated diffuse renal tubular degeneration，and inflammatory cell infiltration；C:model＋ROM 5 mg·kg－1，the arrow indicated interstitial inflammatory infiltration；D:model＋ROM 10 mg·kg－1，the arrow indicated interstitial inflammatory infiltration；E:model＋ROM 20 mg·kg－1，the arrow indicated interstitial inflammatory infiltration.

由圖2結(jié)果表明，正常對照組大鼠腎小球、腎小管結(jié)構(gòu)清晰，形態(tài)正常，無明顯病理變化(圖2A)。模型組大鼠腎小管彌漫性腎小管濁腫變性，部分管腔擴(kuò)張，炎性細(xì)胞浸潤，上皮細(xì)胞空泡變性(圖2B)。與模型組比較，模型＋ROM 5 mg·kg－1組病理變化減輕不明顯，模型＋ROM 10和20 mg·kg－1組病理變化減輕，表現(xiàn)為輕度炎性浸潤(圖2C，D，E)。

3 討論

DDP是一種廣泛應(yīng)用的抗癌藥物，與氧化應(yīng)激有關(guān)的氧化損傷可能是DDP腎毒性的主要原因。DDP的腎毒性一方面是氧自由基的大量產(chǎn)生，另一方面是抗氧化劑防護(hù)作用的缺失，DDP可誘發(fā)機(jī)體抗氧化水平降低，導(dǎo)致機(jī)體對抗癌藥物產(chǎn)生的自由基引起的防護(hù)作用減弱。一些天然產(chǎn)物及合成的抗氧化劑能明顯拮抗DDP的腎毒性。近年來研究顯示，ROM在糖尿病腎病中具有腎保護(hù)作用，可以降低高糖環(huán)境下引起的腎組織活性氧增多，增強(qiáng)機(jī)體抗氧化酶活性，提高清除自由基的能力[7]。但對ROM在藥物性腎氧化應(yīng)激損傷方面的研究報(bào)道較少。

本研究通過體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，DDP對HEK293細(xì)胞有損傷作用。隨后用遞增濃度的 ROM與HEK293細(xì)胞預(yù)孵育2 h，結(jié)果表明，ROM可明顯降低DDP對HEK293細(xì)胞的損傷，當(dāng)ROM在100 μmol·L－1時(shí) HEK293細(xì)胞存活率為(72.3± 9.7)%，明顯高于DDP 25 μmol·L－1與HEK293細(xì)胞單獨(dú)孵育時(shí)的細(xì)胞存活率(27.6±3.2)%。而且發(fā)現(xiàn)，在此濃度下，ROM可有效拮抗DDP導(dǎo)致的MDA濃度升高以及GSH活性的降低。由此推測，ROM對DDP造成的細(xì)胞損傷具有保護(hù)作用，可能是通過提高抗氧化應(yīng)激作用實(shí)現(xiàn)的。

為了進(jìn)一步驗(yàn)證體外實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，本研究采用DDP制備腎損傷模型。據(jù)報(bào)道，腎損傷時(shí)腎排出Cr和BUN的能力下降[10]，引起血清中Cr和BUN含量升高，因此血清中Cr和BUN的含量是評價(jià)腎功能的主要指標(biāo)。本研究結(jié)果表明，DDP 5 mg·kg－1組Cr和BUN含量明顯增高，表明DDP對大鼠腎功能造成損傷；DDP 5 mg·kg－1＋ROM 5，10和20 mg·kg－1組血清中Cr和BUN的含量與DDP 5 mg·kg－1組相比均明顯下降，表明ROM可以改善DDP對腎造成的損傷。

MDA是脂質(zhì)過氧化的產(chǎn)物，MDA含量可以反映脂質(zhì)過氧化程度。SOD和GSH是機(jī)體主要的抗氧化酶[11－12]，SOD和GSH水平是反映機(jī)體抗氧化能力的重要指標(biāo)。本研究結(jié)果表明，與 DDP5 mg·kg－1組相比，DDP＋ROM 10和20 mg·kg－1能顯著降低MDA含量，提高SOD和GSH活性，表明ROM可提高DDP腎損傷大鼠的氧化應(yīng)激作用。腎組織病理學(xué)檢查同樣證實(shí)，給予ROM 8周，可明顯改善DDP引起的腎組織嗜堿性變以及炎性浸潤。

NO和NOS也是機(jī)體抗氧化能力的重要指標(biāo)[13]，NO在腎血管內(nèi)皮細(xì)胞通過NOS合成。本研究結(jié)果表明，與正常對照組比較，DDP 5 mg·kg－1組NO含量降低，NOS活性降低，提示DDP對血管內(nèi)皮細(xì)胞的NOS活性有損傷作用，使NO含量下降，從而降低腎抗氧化能力。經(jīng)過ROM干預(yù)后，NOS活性增加，NO含量升高，進(jìn)一步提示ROM對DDP導(dǎo)致的腎氧化損傷具有改善作用。

綜上所述，ROM對DDP造成的大鼠腎損傷具有保護(hù)作用，其作用機(jī)制可能通過降低腎組織MDA含量、增加GSH含量和SOD活性以及增加NO含量和NOS活性，從而提高機(jī)體組織抗氧化能力。

[1] Taguchi T，Nazneen A，Abid MR，Razzaque MS. Cisplatin-associated nephrotoxicity and pathological events[J].Contrib Nephrol，2005，148(8):107-121.

[2] Liu XH，Li QX.Effects of ligustrazine on renal cell apoptosis and expression of apoptosis-related proteins in rats with cisplatin-induced renal injury[J]. Chin J Pharmacol Toxicol(中國藥理學(xué)與毒理學(xué)雜志)，2005，19(5):352-356.

[3] Badary OA，Abdel-Maksoud S，Ahmed WA，Owieda GH.Naringenin attenuates cisplatin nephrotoxicity in rats[J].Life Sci，2005，76(18):2125-2135.

[4] Atessahin A，Yilmaz S，Karahan I，Ceribasi AO，Karaoglu A.Effects of lycopene against cisplatin-induced nephrotoxicity and oxidative stress in rats [J].Toxicology，2005，212(2-3):116-123.

[5] Luo J，Tsuji T，Yasuda H，Sun Y，F(xiàn)ujigaki Y，Hishida A.The molecular mechanisms of the attenuation of cisplatin-induced acute renal failure by N-acetylcysteine in rats[J].Nephrol Dial Transplant，2008，23(7):2198-2205.

[6] Cheng GY，Liu ZS，Li JS，Dong J，Quao SX.Protective effect of rosiglitazone on acute nephrotoxicity induced by cyclosporine A[J].Clin Med China (中國綜合臨床)，2010，26(4):377-379.

[7] Pistrosch F，Herbrig K，Kindel B，Passauer J，F(xiàn)ischer S，Gross P.Rosiglitazone improves glomerular hyperfiltration，renal endothelial dysfunction，and microalbuminuria of incipient diabetic nephropathy in patients[J].Diabetes，2005，54(7):2206-2211.

[8] Ren JY，Huang YL.Protective effect and mechanism ofrosiglitazone in rats with doxorubicininduced nephropathy[J].China Pharm(中國藥師)，2012，15(6):756-759.

[9] Sharma SK，Goyal N.Protective effect of heliotropium eichwaldi against cisplatin-induced nephrotoxicity in mice[J].J Chin Integr Med，2012，10(5): 555-560.

[10] Han B，Zhang LL，You ZQ，Xin YF，Chen YX，Chen GC，et al.Renal toxicity and oxidative stress mechanism of NG-nitro-D-arginine on the kidney of mice[J].Chin J Pharmacol Toxicol(中國藥理學(xué)與毒理學(xué)雜志)，2011，25(3):275-279.

[11] Muraoka S，Miura T.Free radicals mediate cardiac toxicity induced byadriamycin[J].Yakugaku Zasshi，2003，123(10):855-866.

[12] Fogli S， Nieri P， Breschi MC.The role of nitric oxide in anthracycline toxicity and prospects for pharmacologic prevention of cardiac damage[J]. FASEB J，2004，18(6):664-675.

[13] Fang F，Wu YG，Dong J，Ren KJ，Qi XM，Liang C，et al.Effects of total glucosides of paeony on oxidative stress in renal tissue of diabetic rats[J]. Chin J Pharmacol Toxicol(中國藥理學(xué)與毒理學(xué)雜志)，2008，22(3):199-204.

R965，R977

A

1000-3002(2014)04-0525-06

10.3867/j.issn.1000-3002.2014.04.009

張 玲(1979－)，女，藥師，主要從事心血管藥理學(xué)研究。

樊 華，Tel:(022)27435025，E-mail: songyu＠bankofshanghai.com