潘孝明 梁興國(guó)

（中國(guó)海洋大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，青島 266003）

全基因組擴(kuò)增技術(shù)原理及研究進(jìn)展

潘孝明 梁興國(guó)

（中國(guó)海洋大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，青島 266003）

DNA芯片及下一代測(cè)序等高通量技術(shù)的發(fā)展極大促進(jìn)了分子生物學(xué)技術(shù)在各領(lǐng)域的廣泛應(yīng)用，但此時(shí)樣品數(shù)量與質(zhì)量往往是制約研究進(jìn)行的重要因素，全基因組擴(kuò)增技術(shù)（Whole genome amplification, WGA）則可有效解決這一問(wèn)題，其可使極微量目標(biāo)基因組DNA同時(shí)得到擴(kuò)增從而提供滿足高通量分析研究所需的起始材料。高效可靠的全基因組擴(kuò)增技術(shù)使基于單細(xì)胞水平的大規(guī)模全基因組分析成為現(xiàn)實(shí)，且隨著研究的不斷深入，對(duì)全基因組擴(kuò)增技術(shù)提出了更高的要求。對(duì)過(guò)去常用的以及近期發(fā)展的全基因組擴(kuò)增技術(shù)進(jìn)行了概述，闡明了各種方法的原理，并對(duì)各種方法的特點(diǎn)從原理上進(jìn)行了分析總結(jié)，以期為全基因組擴(kuò)增技術(shù)的應(yīng)用提供一定的參考。

全基因組擴(kuò)增 單細(xì)胞基因組測(cè)序 基因型 基因組變異 突變檢測(cè)

現(xiàn)代分子生物學(xué)的不斷發(fā)展除了為生物學(xué)領(lǐng)域帶來(lái)了革命性的突破之外，也被廣泛應(yīng)用于其他相關(guān)領(lǐng)域，極大地推動(dòng)了諸如食品、醫(yī)學(xué)、環(huán)境等學(xué)科的研究，成為各學(xué)科前沿研究中必備的強(qiáng)大工具。分子生物學(xué)方法大多是以DNA作為最主要的研究對(duì)象，而很多情況下可供分析使用的DNA數(shù)量極少，如胚胎植入前遺傳學(xué)診斷（Preimplantation genetic diagnosis，PGD）可有效避免植入胚胎存在某些疾病而具有顯著的優(yōu)生學(xué)意義，而這一技術(shù)的實(shí)現(xiàn)僅僅允許使用1-2個(gè)胚胎細(xì)胞進(jìn)行分析檢測(cè)［1］；在法醫(yī)鑒定中往往僅能獲得痕量DNA樣品等［2］，此時(shí)下一代測(cè)序（Next generation sequencing，NGS）與DNA芯片技術(shù)等高通量分析方法往往受限于樣品量太少而無(wú)法發(fā)揮其作用［3］，全基因組擴(kuò)增技術(shù)（Whole genome amplification，WGA）能夠?qū)崿F(xiàn)對(duì)整個(gè)基因組的擴(kuò)增以提供大量可供分析樣品，因而為此類研究提供了強(qiáng)有力的支持，并且高靈敏度WGA技術(shù)的不斷進(jìn)步也極大促進(jìn)了單細(xì)胞全基因組測(cè)序技術(shù)的

發(fā)展，使很多針對(duì)單細(xì)胞的大規(guī)模研究分析成為了可能，在疾病早期診斷、微衛(wèi)星序列分析、雜合子丟失（Loss of heterozygosity，LOH）、突變檢測(cè)以及生物進(jìn)化研究中具有重要的意義。近年來(lái)應(yīng)用WGA技術(shù)的單細(xì)胞分析日臻成熟且取得了顯著成果［4-8］，本文將對(duì)目前已經(jīng)廣泛應(yīng)用的以及新出現(xiàn)的WGA方法從原理、應(yīng)用等方面進(jìn)行介紹，并對(duì)各自方法的優(yōu)點(diǎn)以及存在的問(wèn)題進(jìn)行概括性總結(jié)。

1 基于PCR技術(shù)的WGA方法

1.1 引物延伸預(yù)擴(kuò)增法

在所有WGA方法中引物延伸預(yù)擴(kuò)增法（Primerextension preamplification，PEP）是較早出現(xiàn)的一種，Zhang等［9］最早應(yīng)用PEP方法實(shí)現(xiàn)了單個(gè)單倍體細(xì)胞基因組的全擴(kuò)增。PEP法是一種基于PCR技術(shù)發(fā)展而來(lái)的WGA方法，主要原理是使用15個(gè)堿基長(zhǎng)的隨機(jī)引物（N15，理論上有415種組合）在37℃的低退火溫度下進(jìn)行較長(zhǎng)時(shí)間的退火，然后緩慢升溫至55oC進(jìn)行長(zhǎng)時(shí)間的引物延伸，如此反復(fù)多個(gè)循環(huán)（圖1）。Dietmaier等［10］對(duì)PEP方法進(jìn)行了一定的改進(jìn)，包括對(duì)模板DNA的提取方法、反應(yīng)循環(huán)條件的優(yōu)化以及高保真聚合酶的使用等，并成功實(shí)現(xiàn)同時(shí)對(duì)單個(gè)腫瘤細(xì)胞的多個(gè)突變位點(diǎn)進(jìn)行分析［10，11］；Anchordoquy等［12］通過(guò)PEP法對(duì)口腔細(xì)胞基因組全擴(kuò)增后進(jìn)行基因型分析，對(duì)多達(dá)1 890例等位基因的分析結(jié)果表明PEP法可提供足量?jī)?yōu)質(zhì)的模板滿足高通量基因型分析的要求。但由于PEP法使用隨機(jī)引物以及較為不嚴(yán)格的PCR循環(huán)參數(shù)，因此可能導(dǎo)致不均衡的擴(kuò)增結(jié)果產(chǎn)生［13，14］。

圖1 引物延伸預(yù)擴(kuò)增法原理示意圖［9］

1.2 簡(jiǎn)并寡核苷酸引物PCR

與PEP法類似，簡(jiǎn)并寡核苷酸引物PCR法（Degenerate oligonucleotide primed PCR，DOP-PCR）也是一種基于PCR技術(shù)的全擴(kuò)增方法（圖2），最早由Telenius等［15］提出，其原理是使用部分簡(jiǎn)并的引物進(jìn)行PCR反應(yīng)（引物中間部分含有6個(gè)隨機(jī)堿基），在最初的幾個(gè)循環(huán)過(guò)程中使用較低的溫度（～25℃）進(jìn)行退火以確保引物與模板的結(jié)合，并緩慢升溫至引物延伸溫度進(jìn)行引物延伸，完成最初幾個(gè)循環(huán)后使用相對(duì)較高的退火溫度（～55℃）進(jìn)行多循環(huán)常規(guī)PCR反應(yīng)，對(duì)DOP-PCR結(jié)果影響較大的是因素是聚合酶及引物濃度，因此需要進(jìn)行優(yōu)化以獲得最佳實(shí)驗(yàn)結(jié)果［15，16］。Cheung等［17］應(yīng)用DOP-PCR對(duì)不足1 ng的人類基因組DNA實(shí)現(xiàn)了數(shù)百倍的擴(kuò)增，并提供滿足上百次微衛(wèi)星序列基因型分析所需的模板；Van等［18］對(duì)傳統(tǒng)DOP-PCR進(jìn)行了一定改進(jìn)，同時(shí)使用4條簡(jiǎn)并引物進(jìn)行擴(kuò)增，且每條引物中間都含有8個(gè)隨機(jī)堿基，從而增加了引物的簡(jiǎn)并性，并將DOP-PCR產(chǎn)物使用Roche GS-FLX平臺(tái)進(jìn)行下一代測(cè)序（NGS）從而實(shí)現(xiàn)了對(duì)研究較少的大豆品種（Sinpaldalkong 2）的基因組結(jié)構(gòu)分析，表明DOPPCR法在對(duì)未知樣品分析中具有一定潛力。DOPPCR法雖然使用相對(duì)PEP法更為嚴(yán)格的PCR反應(yīng)條件，但引物與模板間結(jié)合的不確定性以及引物間的相互作用仍可能導(dǎo)致較低的全擴(kuò)增靈敏度及較高的錯(cuò)誤率［19］。因此，較大程度上限制了該方法的應(yīng)用，近年來(lái)應(yīng)用該方法的報(bào)道相對(duì)較少。

圖2 簡(jiǎn)并寡核苷酸引物PCR原理示意圖［15］

1.3 連接介導(dǎo)PCR

廣義上連接介導(dǎo)PCR（ligation-mediated PCR，LM-PCR）指的是一類有接頭連接過(guò)程參與的PCR反應(yīng)，相對(duì)于PEP與DOP-PCR，連接介導(dǎo)PCR最初并非設(shè)計(jì)用來(lái)進(jìn)行基因組全擴(kuò)增，其最早是由Pfeifer等應(yīng)用于體內(nèi)足跡研究（in vivo footprinting）、甲基化分析、DNA損傷鑒定等［20-23］，在此基礎(chǔ)上對(duì)其稍加改變即可進(jìn)行基因組全擴(kuò)增反應(yīng)［4，24］?？傮w而言LM-PCR全擴(kuò)增技術(shù)需要通過(guò)3個(gè)步驟來(lái)實(shí)現(xiàn)：（1）模板DNA的片段化處理：可通過(guò)物理剪切或限制性內(nèi)切酶處理使基因組DNA斷裂成若干適合PCR擴(kuò)增的片段。使用物理剪切法對(duì)DNA進(jìn)行處理時(shí)因無(wú)法預(yù)測(cè)片段末端結(jié)構(gòu)，因此需要對(duì)其進(jìn)行平末端化處理以滿足其與接頭進(jìn)行連接的條件［25］，如使用限制性內(nèi)切酶對(duì)模板進(jìn)行剪切，因各片段末端組成已知，因此大多數(shù)情況下無(wú)需對(duì)片段進(jìn)行處理［26］；（2）模板片段與接頭連接：根據(jù)酶切片段類型設(shè)計(jì)可與之連接的接頭，在DNA連接酶的作用下與模板片段兩端連接，接頭中含有一段外源通用引物序列，用作下一步PCR反應(yīng)中的引物；（3）全擴(kuò)增PCR反應(yīng)：連接成功的模板片段經(jīng)引物延伸后兩端形成了通用引物結(jié)合位點(diǎn)，因此可以外源引入的通用引物進(jìn)行PCR反應(yīng)，包括接頭在內(nèi)的模板片段可同時(shí)得到擴(kuò)增（圖3）。

圖3 連接介導(dǎo)PCR原理示意圖

對(duì)基因組的片段化處理是LM-PCR全擴(kuò)增技術(shù)的關(guān)鍵步驟之一，其對(duì)接下來(lái)的連接反應(yīng)及PCR反應(yīng)具有較大影響，使用物理剪切法可較好保證片段長(zhǎng)度的均一性，但需要進(jìn)行片段平末端化處理。Tanabe等［27］在傳統(tǒng)LM-PCR的基礎(chǔ)上發(fā)展了PRSG法（Adaptor-ligation PCR of randomly sheared genomic DNA）對(duì)基因組進(jìn)行全擴(kuò)增，其使用HydroShear儀將基因組DNA隨機(jī)剪切成0.5-2 kb的片段進(jìn)行接頭連接后擴(kuò)增，通過(guò)對(duì)307個(gè)微衛(wèi)星序列進(jìn)行基因分型以及287個(gè)基因座進(jìn)行CGH分析的結(jié)果表明PRSG法可準(zhǔn)確高效的實(shí)現(xiàn)全基因組擴(kuò)增。酶法剪切無(wú)需昂貴的儀器因此可在絕大多數(shù)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行，但使用限制性內(nèi)切酶對(duì)基因組進(jìn)行酶切時(shí)無(wú)法預(yù)測(cè)其片段長(zhǎng)度，尤其是無(wú)法完全避免較長(zhǎng)片段的產(chǎn)生，針對(duì)這一問(wèn)題Liu等［28］采用3種內(nèi)切酶（DpnII，HhaI，RsaI）對(duì)基因組進(jìn)行酶切，通過(guò)對(duì)石蠟包埋的腫瘤組織的全擴(kuò)增結(jié)果表明LM-PCR全擴(kuò)增覆蓋率可達(dá)到96%，進(jìn)一步將產(chǎn)物應(yīng)用于CGH以及PCR-SSCP分析（PCR-single-strand conformation polymorphism）驗(yàn)證了其擴(kuò)增產(chǎn)物的準(zhǔn)確性，說(shuō)明LM-PCR全擴(kuò)增方法在對(duì)保存狀況較差樣品的分析方面具有巨大的潛力。相對(duì)于其他基于PCR技術(shù)的全擴(kuò)增方法（如上述的PEP與DOP-PCR），LM-PCR法使用較為嚴(yán)格的擴(kuò)增條件，且使用的是一條通用引物，所有連接片段間與通用引物結(jié)合的能力相同，因此可在很大程度上保證所有片段得到相同程度的高靈敏度擴(kuò)增。目前已有Sigma公司應(yīng)用該技術(shù)開(kāi)發(fā)的GenomePlex系列試劑盒產(chǎn)品［4，24，29］。LM-PCR方法的優(yōu)點(diǎn)是擴(kuò)增效率極高，缺點(diǎn)是步驟相對(duì)繁瑣，對(duì)復(fù)雜DNA序列（如富含GC結(jié)構(gòu)的模板）的擴(kuò)增可能出現(xiàn)偏差，并且由于模板片段間具有相同的黏性末端（或平末端），因此在接頭連接過(guò)程中這些片段間會(huì)不可避免的發(fā)生“無(wú)序自連”，導(dǎo)致重組得到的片段較長(zhǎng)而擴(kuò)增失敗。針對(duì)這一“自連”問(wèn)題，作者所在課題組使用IIS型限制性內(nèi)切酶對(duì)基因組進(jìn)行酶切產(chǎn)生具有隨機(jī)堿基黏性末端的片段，配合使用具有隨機(jī)堿基黏性末端的接頭，可極大減少自連現(xiàn)象發(fā)生的幾率。以BbvI內(nèi)切酶為例（識(shí)別位點(diǎn)GCAGC（8/12）↓），其可產(chǎn)生具有4堿基隨機(jī)堿基的黏性末端NNNN，因此可將自連概率減少44=256

倍，并通過(guò)qPCR等技術(shù)驗(yàn)證了這一改良方法極高的擴(kuò)增效率，各目標(biāo)片段可較為均衡的擴(kuò)增數(shù)百萬(wàn)倍［30］。

2 恒溫全基因組擴(kuò)增反應(yīng)

2.1 多重置換擴(kuò)增反應(yīng)

基于恒溫核酸擴(kuò)增技術(shù)的多重置換擴(kuò)增法（Multiple displacement amplification，MDA）的出現(xiàn)相對(duì)PCR類全擴(kuò)增方法較晚，其基本原理是使用一條硫代修飾的六核苷酸隨機(jī)引物（N6）在恒溫條件下與基因組隨機(jī)退火，并在具有強(qiáng)鏈置換活性的phi29 DNA聚合酶的作用下發(fā)生鏈置換擴(kuò)增反應(yīng)，置換產(chǎn)生的單鏈序列又可與隨機(jī)引物任意退火延伸，形成超分支擴(kuò)增結(jié)構(gòu)［31］，由于phi29 DNA聚合酶具有較強(qiáng)的持續(xù)合成DNA的能力，因此可持續(xù)合成長(zhǎng)達(dá)50-100 kb的產(chǎn)物（圖4）。Dean等［32］最早應(yīng)用MDA法進(jìn)行全基因組擴(kuò)增，相對(duì)于PCR類方法，MDA法顯示出極高的擴(kuò)增靈敏度（1-10基因組拷貝），且通過(guò)對(duì)8個(gè)染色體位點(diǎn)的擴(kuò)增檢測(cè)結(jié)果顯示各目標(biāo)間擴(kuò)增偏差可控制在3倍以內(nèi)，遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于DOP-PCR等方法4-6個(gè)數(shù)量級(jí)的擴(kuò)增偏差。此后，有大量成功應(yīng)用MDA法進(jìn)行WGA的報(bào)道，如Hellani等［33］將MDA法成功應(yīng)用于PGD研究；Kumar等［34］應(yīng)用MDA法實(shí)現(xiàn)了對(duì)難于培養(yǎng)的伯納特氏立克次氏體基因組的全擴(kuò)增等，均顯示出其極高的WGA效率。但其對(duì)模板質(zhì)量的要求相對(duì)較高，在非最佳實(shí)驗(yàn)條件下亦可導(dǎo)致非均衡擴(kuò)增的產(chǎn)生［35］。由于MDA法是一種恒溫核酸擴(kuò)增方法，可能存在一定的非特異性擴(kuò)增問(wèn)題，即體系內(nèi)不含有模板時(shí)也會(huì)產(chǎn)生大量產(chǎn)物，針對(duì)這一問(wèn)題Marcy等［36］使用極微量的MDA體系（60 μL）對(duì)單細(xì)胞基因組DNA進(jìn)行全擴(kuò)增；Pan等［37］通過(guò)向體系中加入一種特殊的海藻糖進(jìn)行MDA反應(yīng)，均對(duì)非特異性擴(kuò)增產(chǎn)生了一定的抑制效果。

MDA法是目前公認(rèn)應(yīng)用最廣泛的WGA方法，操作簡(jiǎn)單且對(duì)實(shí)驗(yàn)儀器的要求極低，且使用非預(yù)變性的模板時(shí)也可取得良好的WGA效果，可進(jìn)一步簡(jiǎn)化實(shí)驗(yàn)操作及避免污染的產(chǎn)生［32］，可廣泛應(yīng)用于基因組測(cè)序、CGH、SNPs分析等相關(guān)領(lǐng)域，目前針對(duì)該方法開(kāi)發(fā)的產(chǎn)品較為成熟，具有代表性的為Qiagen公司的Repli-g系列全擴(kuò)增試劑盒［38-40］。

圖4 多重鏈置換法全擴(kuò)增原理示意圖［31］

2.2 基于引物酶的全基因組擴(kuò)增

由T7細(xì)菌噬菌體核酸復(fù)制方式演化而來(lái)的基于引物酶的全基因組擴(kuò)增（Primer-based whole genome amplification，pWGA）是一種恒溫全基因組擴(kuò)增方法，相對(duì)于其他所有WGA方法，pWGA最大的特點(diǎn)是在擴(kuò)增過(guò)程中不需要使用任何引物，且其不需要對(duì)模板進(jìn)行預(yù)變性處理［41］。pWGA過(guò)程中所需的T7 gp4蛋白可同時(shí)發(fā)揮解旋酶和引物酶的作用，該蛋白的C端部分可利用脫氧胸苷三磷酸（dTTP）水解產(chǎn)生的能量來(lái)將DNA雙鏈解旋；而N端則行使引物酶（primase）的作用，其特異性識(shí)別3'-CTGG（G/T）-5'和3'-CTGTG-5'并產(chǎn)生短的RNA作為擴(kuò)增引物。引物生成后在T7 DNA聚合酶全酶的作用下進(jìn)行持續(xù)的擴(kuò)增反應(yīng)，由T7 gp2.5基因編碼的單鏈DNA結(jié)合蛋白（Single-stranded DNA binding protein）與解旋產(chǎn)生的單鏈DNA結(jié)合并與解旋酶/引物酶、聚合酶一起完成整個(gè)全基因組擴(kuò)增過(guò)程（圖5），該擴(kuò)增模式與滾環(huán)擴(kuò)增（Rolling circle amplification，RCA）相似并可以產(chǎn)生長(zhǎng)達(dá)40 kb的產(chǎn)物［42］。

圖5 基于引物酶全基因組擴(kuò)增法原理示意圖［42］

除上述幾種蛋白（酶）外，pWGA反應(yīng)還需要核苷二磷酸激酶（Nucleoside diphosphokinase）、無(wú)機(jī)焦磷酸酶（Inorganic pyrophosphatase）以及由肌酸激酶（Creatine kinase）和磷酸肌酸（Phosphocreatine）組成的ATP生成系統(tǒng)。其中核苷二磷酸激酶的主要作用是將NTPs中的γ-磷酸基團(tuán)轉(zhuǎn)移至NDPs以重新形成NTPs而平衡體系中的dNDP與dNTP的比例，并可以從一定程度上彌補(bǔ)解旋過(guò)程中造成的dTTP損失；無(wú)機(jī)焦磷酸酶可以將擴(kuò)增反應(yīng)中產(chǎn)生的無(wú)機(jī)焦磷酸分解為磷酸鹽，減少因其累積而對(duì)T7 DNA聚合酶造成的抑制；最終肌酸激酶將磷酸肌酸中的高能磷酸鍵轉(zhuǎn)移至dNTPs，從而合成新的dNTPs而提高全擴(kuò)增的效率。

與MDA法相比，pWGA法僅需1 h即可完成反應(yīng)。Schaerli等［43］發(fā)展了使用T4噬菌體gp61引物酶的全擴(kuò)增體系T4 pWGA，并顯示出在基因組測(cè)序、DNA標(biāo)記、大規(guī)模菌落篩選以及DNA定量等方面的潛力，但相對(duì)于其他WGA方法，目前對(duì)pWGA法的報(bào)道仍偏少［2］，除該方法面世不久之外，反應(yīng)需要較多的蛋白（酶）、試劑組合也可能對(duì)其推廣普及產(chǎn)生一定的限制作用。

3 多次退火環(huán)狀循環(huán)擴(kuò)增技術(shù)

美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院士謝曉亮教授帶領(lǐng)的團(tuán)隊(duì)于2012年底在Science雜志上連續(xù)發(fā)表了兩篇應(yīng)用其新發(fā)明的一種WGA方法進(jìn)行單細(xì)胞測(cè)序研究的文章，引出了“多次退火環(huán)狀循環(huán)擴(kuò)增技術(shù)”（Multiple annealing and looping-based amplification cycles，MALBAC）這一全新的WGA方法，并應(yīng)用該方法成功實(shí)現(xiàn)了單細(xì)胞水平的單核苷酸變異（Singlenucleotide variations，SNVs）以及拷貝數(shù)變異（Copynumber variations，CNVs）的研究［44，45］。其結(jié)合了MDA法與PCR方法的特點(diǎn)，使用的35 nt長(zhǎng)的引物由一段固定的27 nt通用引物序列和8 nt隨機(jī)堿基序列（N8）組成，在0oC時(shí)該8 nt隨機(jī)堿基序列可與模板任意退火，梯度升溫至65oC后在具有鏈置換活性的Bst大片段DNA聚合酶作用下發(fā)生鏈置換聚合反應(yīng)，得到一系列長(zhǎng)度不一的（0.5-1.5 kb）半擴(kuò)增子（Semiamplicons），在94℃變性、0℃退火以及65℃延伸循環(huán)后，上一循環(huán)中半擴(kuò)增子形成了兩端具有互補(bǔ)結(jié)構(gòu)（27 nt）的全擴(kuò)增子（Amplicons），隨后降低溫度至58℃使得到的擴(kuò)增子兩端互補(bǔ)形成loop結(jié)構(gòu)，從而可以避免引物與其進(jìn)行結(jié)合導(dǎo)致全擴(kuò)增子倍增導(dǎo)致的不均衡擴(kuò)增，因此可以很大程度上保證該循環(huán)發(fā)生的是線性擴(kuò)增。在經(jīng)過(guò)5個(gè)上述類似線性擴(kuò)增循環(huán)后可得到大量全擴(kuò)增子并做為接下來(lái)PCR反應(yīng)的模板，并使用該27 nt通用引物進(jìn)行指數(shù)PCR反應(yīng)，因此只有全擴(kuò)增子才能得到有效擴(kuò)增，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)整個(gè)基因組的高效而又均衡的全擴(kuò)增（圖6）。

圖6 多次退火環(huán)狀循環(huán)擴(kuò)增技術(shù)原理示意圖［44］

MALBAC法顯示出比MDA法更為均衡的擴(kuò)增結(jié)果［44］，但使用單細(xì)胞進(jìn)行基因型分析時(shí)MALBAC法的假陽(yáng)性率偏高，比MDA可高出40倍，這可能是因?yàn)镸DA法使用的phi29 DNA聚合酶比MALBAC法應(yīng)用的Bst和Taq聚合酶具有更高的保真度，因此往往需要使用多個(gè)細(xì)胞以獲得更加準(zhǔn)確的結(jié)果［46］。由于MALBAC法對(duì)單細(xì)胞全基因組擴(kuò)增具有很高的覆蓋率（93%）和均衡性，甫一出現(xiàn)就引起了較多的關(guān)注，Ni等［47］成功應(yīng)用其對(duì)外周血液中極少數(shù)的循環(huán)腫瘤細(xì)胞（CTCs）進(jìn)行CNVs分析，Hou等［48］對(duì)單個(gè)卵母細(xì)胞進(jìn)行基因組測(cè)序，顯示出該方法在癌癥早期檢測(cè)以及胚胎移植等領(lǐng)域的廣闊應(yīng)用前景。

4 結(jié)語(yǔ)

綜上所述，單細(xì)胞基因組測(cè)序技術(shù)的發(fā)展極大促進(jìn)了癌癥、基因組變異等眾多領(lǐng)域研究進(jìn)展，而

決定這一技術(shù)應(yīng)用成功與否的最關(guān)鍵因素就是全基因組擴(kuò)增效果，因此對(duì)現(xiàn)有WGA方法進(jìn)行改良或研發(fā)新的高效WGA方法是目前研究的熱點(diǎn)［46，49-51］?？傮w而言現(xiàn)有WGA方法各有特點(diǎn)（表1），需根據(jù)實(shí)際情況選擇合適的WGA方法加以應(yīng)用。如PCR類全擴(kuò)增方法對(duì)樣品質(zhì)量要求相對(duì)較低且擴(kuò)增效率高，但全擴(kuò)增產(chǎn)物片段較短，指數(shù)反應(yīng)易導(dǎo)致所有片段的非均衡擴(kuò)增；而MDA法的成功應(yīng)用的前提是高質(zhì)量基因組模板的獲得，其擴(kuò)增產(chǎn)物較為均衡且更加利于全基因組測(cè)序；但無(wú)論P(yáng)CR類方法或是恒溫全擴(kuò)增方法，目前都存在一定的非特異性擴(kuò)增現(xiàn)象，即使在較為嚴(yán)格的PCR反應(yīng)條件下這一問(wèn)題仍無(wú)法完全避免［52，53］，因此對(duì)現(xiàn)有方法加以改進(jìn)抑制非特異性擴(kuò)增也是當(dāng)前WGA方法研究中需要解決的問(wèn)題，如數(shù)字微滴PCR（Digital microdroplet PCR）的發(fā)展可為基于PCR技術(shù)的WGA方法帶來(lái)一些新的思路。

表1 主要的WGA方法比較

目前已有上千種生物基因組被測(cè)序，但是相對(duì)于更多的其他物種，已測(cè)序的物種數(shù)量?jī)H占極少數(shù)［54］，如自然界中絕大多數(shù)微生物不可培養(yǎng)且難以富集，導(dǎo)致針對(duì)這類微生物的全基因組測(cè)序難度極大［55，56］。因此，高效而又可靠的WGA技術(shù)將在更多相關(guān)研究領(lǐng)域中大有可為。

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（責(zé)任編輯 狄艷紅）

Principle of Whole Genome Amplification Technology and Its Progress

Pan Xiaoming Liang Xingguo
（College of Food Science and Engineering，Ocean University of China，Qingdao 266003）

The rapid developments of DNA array and next generation sequencing technologies had greatly promoted molecular biology techniques to be used in various fields. However, the limited quantity and quality of sample DNA may affect large scale genetic analyses. To overcome these problems, the whole genome amplification（WGA）technology was employed to amplify trace amounts of genomic DNA to sufficient quantity to meet the requirements of high throughput analyses. The highly efficient and reliable WGA methods also helped to realize large scale of genetic analyses based on even single cell. Moreover, as the single cell level research continues, more efficient WGA approaches were developed. This paper summarized the general WGA methods frequently used before and newly developed methods on basic principle level as well as the advantages and disadvantages of each method, which helped to make good use of the powerful WGA techniques.

Whole genome amplification Single cell sequencing Genotyping Genome variations Mutation detection

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2014.12.008

2014-04-10

國(guó)家青年千人計(jì)劃，山東省萬(wàn)人計(jì)劃，山東省自然科學(xué)杰出青年基金（JQ201204）

潘孝明，男，博士研究生，研究方向：食品分子生物學(xué)；E-mail：pan.xiao.ming@163.com

梁興國(guó)，男，教授，研究方向：核酸化學(xué)與生物技術(shù)；E-mail：liangxg@ouc.edu.cn