吳雪清， 楊思蒙， 李月華， 周強(qiáng)勇， 陳海燕， 李海鷹

（溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院，浙江 溫州 325015；1.婦科；2.心內(nèi)科）

·論 著·

肥胖對(duì)雌性大鼠交感腎上腺系統(tǒng)的長(zhǎng)期程序化作用

吳雪清1， 楊思蒙1， 李月華1， 周強(qiáng)勇1， 陳海燕1， 李海鷹2

（溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院，浙江 溫州 325015；1.婦科；2.心內(nèi)科）

目的：研究肥胖對(duì)雌性大鼠交感腎上腺系統(tǒng)的長(zhǎng)期程序化作用。方法：將雌性SD大鼠在出生當(dāng)日分成2組：①實(shí)驗(yàn)組，小窩喂養(yǎng)，每窩4只；②對(duì)照組，正常喂養(yǎng)，每窩12只。每周測(cè)體質(zhì)量，出生后28 d開(kāi)始監(jiān)測(cè)陰道口初開(kāi)放時(shí)間和陰道細(xì)胞學(xué)涂片。出生后10周，用免疫組織化學(xué)方法測(cè)定腎上腺和卵巢交感神經(jīng)興奮性的改變；用原位雜交技術(shù)測(cè)定中樞藍(lán)斑核的酪氨酸羥化酶（TH）mRNA的表達(dá)變化。結(jié)果：與對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組動(dòng)物明顯肥胖，持續(xù)終生；青春期啟動(dòng)明顯提早[實(shí)驗(yàn)組（35.5±0.8）d，對(duì)照組（37.6±0.3）d]；卵巢和腎上腺的TH免疫染色明顯增強(qiáng)和藍(lán)斑核的TH mRNA表達(dá)明顯增加，其差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）。結(jié)論：肥胖通過(guò)上調(diào)交感腎上腺興奮性影響雌鼠的生殖功能。

肥胖；腎上腺；卵巢；生殖功能；交感神經(jīng)；大鼠

隨著現(xiàn)代生活水平的提高，肥胖，尤其是青春期肥胖的發(fā)病率急劇上升。研究表明在人類(lèi)，肥胖往往伴隨著青春期發(fā)育提前[1]和下丘腦-垂體-腎上腺（HPA）軸的高反應(yīng)性，基礎(chǔ)或應(yīng)激狀態(tài)下促腎上腺皮質(zhì)激素（ACTH）和可的松分泌增加[2]。因此，研究早期肥胖對(duì)生殖功能和交感腎上腺系統(tǒng)的影響尤顯重要。但目前鮮見(jiàn)小窩喂養(yǎng)大鼠的動(dòng)物模型來(lái)研究肥胖和交感腎上腺功能異常關(guān)系的報(bào)道。本研究的目的是探討早期肥胖對(duì)雌鼠外周及中樞交感腎上腺系統(tǒng)的長(zhǎng)期程序化作用。

1 材料和方法

1.1 動(dòng)物模型普通級(jí)孕晚期的SD大鼠由溫州醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。置于該中心標(biāo)準(zhǔn)的動(dòng)物房（12 h光照，12 h黑暗，光照開(kāi)始于早上7時(shí)，溫度（22±2）℃，給予標(biāo)準(zhǔn)動(dòng)物食物和飲水。在幼鼠出生當(dāng)天（D0），稱(chēng)健康幼鼠體質(zhì)量，并將幼鼠數(shù)目調(diào)整為4只/窩（實(shí)驗(yàn)組）和12只/窩（對(duì)照組）。所有的幼鼠都在出生后21（D21）天斷奶。然后4～6只幼鼠置于同一窩中直到實(shí)驗(yàn)結(jié)束。本實(shí)驗(yàn)經(jīng)過(guò)溫州醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 方法

1.2.1 監(jiān)測(cè)青春期啟動(dòng)和卵巢周期：從出生后28 d開(kāi)始每天觀測(cè)動(dòng)物的陰道口初開(kāi)放（為大鼠的青春期啟動(dòng)的標(biāo)志）。一旦陰道口開(kāi)放，即稱(chēng)體質(zhì)量，開(kāi)始每日行陰道涂片，連續(xù)2個(gè)排卵周期。正常的卵巢周期指的是連續(xù)2個(gè)排卵周期正常（持續(xù)4～5 d，雌激素相1～2 d）。同時(shí)每周稱(chēng)動(dòng)物體質(zhì)量。

1.2.2 免疫組織化學(xué)方法測(cè)定卵巢和腎上腺的免疫染色強(qiáng)度：在出生后10周時(shí)，行卵巢和腎上腺切除術(shù)。將其制成蠟塊，并以4μ m的厚度切片，先在xylene、乙醇脫水，在0.3% Triton X-100溶液里孵化，用0.3% H2O2抑制內(nèi)源性過(guò)氧化酶。然后，待檢組織先與大鼠抗酪氨酸羥化酶（TH）第一抗體（1: 1 500卵巢；1:1 000腎上腺）在4 ℃孵化（36 h卵巢；60 h腎上腺），然后與第二抗體（山羊抗大鼠IgG）1:300卵巢及1:400腎上腺室溫下孵化60 h，再與第三抗體生物素-辣根過(guò)氧化酶（ABC復(fù)合物；1:200）室溫下孵化45 h，最后用DAB染色觀察其免疫反應(yīng)性強(qiáng)弱，棕黃色染色為陽(yáng)性。實(shí)驗(yàn)中陰性對(duì)照為鄰近的切片以不含第一抗體的非免疫血清孵化；陽(yáng)性對(duì)照為大鼠腎上腺。批間差異的控制用來(lái)自于同一卵巢的已知免疫強(qiáng)度的兩片切片組織加入每批免疫組織化學(xué)實(shí)驗(yàn)中。免疫染色強(qiáng)度的測(cè)定使用半定量的H-score方法[3]進(jìn)行評(píng)分，由兩個(gè)獨(dú)立的不知道組別的實(shí)驗(yàn)者在Zeiss顯微鏡成像系統(tǒng)下完成。

1.2.3 原位雜交法測(cè)定藍(lán)斑核TH mRNA水平：在出生后10周時(shí)，取腦組織，15μ m厚度連續(xù)切片（Bright冰凍切片機(jī)），收集藍(lán)斑核所在組織，保存于-70 ℃待檢。用TH cDNA探針對(duì)收集的藍(lán)斑核切片行原位雜交。按照說(shuō)明書(shū)要求對(duì)切片進(jìn)行常規(guī)預(yù)處理后、每張切片滴加25μL預(yù)雜交液，恒溫箱內(nèi)預(yù)雜交2 h，按每張切片25μL滴加含有TH寡核苷酸探針的雜交液，50 ℃恒溫箱內(nèi)雜交過(guò)夜，次日常規(guī)洗片，晾干。陰性對(duì)照用預(yù)雜交液代替TH寡核苷酸探針的雜交液進(jìn)行雜交，其余步驟均相同。然后將切片置入膠片盒，并蓋上BioMax MR-1膠片，密閉至于暗室內(nèi)4 d。然后對(duì)膠片進(jìn)行清洗，定影、顯影，共4周。將顯影后的膠片用連于光學(xué)顯微鏡20倍的數(shù)碼相機(jī)拍攝，使用Scion Image影像分析系統(tǒng)進(jìn)行形態(tài)學(xué)分析，并對(duì)藍(lán)斑核區(qū)域內(nèi)的TH mRNA陽(yáng)性細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)和平均灰度值（RA）檢測(cè)，取4～5片平均值代表一個(gè)動(dòng)物的藍(lán)斑核的RA。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理方法采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件，所有數(shù)據(jù)以±s表示。陰道口初開(kāi)放時(shí)間和體質(zhì)量差異比較采用一次方差分析和Dunnett-t檢驗(yàn)；TH的免疫染色強(qiáng)度的測(cè)定使用半定量的H-Score方法[3]，數(shù)據(jù)以H-評(píng)分±標(biāo)準(zhǔn)差表示。TH mRNA的表達(dá)使用二次方差分析和Dunnett-t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 小窩喂養(yǎng)對(duì)雌鼠體質(zhì)量的影響小窩喂養(yǎng)，即實(shí)驗(yàn)組大鼠較對(duì)照組體質(zhì)量明顯增加，且持續(xù)到成年（P＜0.05），見(jiàn)圖1。

圖1 小窩喂養(yǎng)對(duì)大鼠體質(zhì)量的影響

2.2 小窩喂養(yǎng)對(duì)雌鼠生殖功能的影響陰道口初開(kāi)放時(shí)間在實(shí)驗(yàn)組為（35.5±0.8）d，對(duì)照組為（37.6±0.3）d，兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。實(shí)驗(yàn)組正常卵巢周期數(shù)為37.8%，對(duì)照組為66.7%，兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

2.3 肥胖對(duì)卵巢交感神經(jīng)興奮性的影響TH在卵巢中的免疫染色分布于卵泡膜細(xì)胞和間質(zhì)組織。TH免疫染色強(qiáng)度在實(shí)驗(yàn)組為（2.74±0.20）分，對(duì)照組為（1.08±0.06）分，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見(jiàn)圖2。

2.4 肥胖對(duì)腎上腺交感神經(jīng)興奮性的影響TH在腎上腺的免疫染色局限在髓質(zhì)。TH免疫染色強(qiáng)度在實(shí)驗(yàn)組的腎上腺髓質(zhì)為（3.78±0.40）分，對(duì)照組為（1.54±0.30）分，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見(jiàn)圖3。

圖2 早期肥胖對(duì)大鼠卵巢組織中TH免疫染色的影響（ABC，×200）

圖3 早期肥胖對(duì)大鼠腎上腺組織中TH免疫染色的影響

2.5 肥胖對(duì)藍(lán)斑核TH mRNA表達(dá)的影響TH mRNA在實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組的藍(lán)斑核核團(tuán)均有表達(dá)。實(shí)驗(yàn)組為（350.20±12.34）RA，對(duì)照組為（240.80 ±10.42）RA，兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

3 討論

已經(jīng)知道，青春期的啟動(dòng)時(shí)間是和機(jī)體的營(yíng)養(yǎng)和代謝狀態(tài)緊密相關(guān)的。本實(shí)驗(yàn)證明了早期肥胖能加速大鼠青春期的發(fā)育，可能是實(shí)驗(yàn)組大鼠的高瘦素分泌導(dǎo)致了其青春期發(fā)育的提早。有研究提出瘦素可能是下丘腦kisspeptin系統(tǒng)關(guān)鍵的調(diào)節(jié)因子，參與生殖軸的代謝調(diào)控[4]。已經(jīng)知道kisspeptin是青春期的啟動(dòng)因子，因此青春期前后實(shí)驗(yàn)組大鼠的下丘腦kisspeptin及其基因和受體表達(dá)，有待于進(jìn)一步研究。在卵巢水平，其交感神經(jīng)興奮性（TH免疫反應(yīng)性）增加也是生殖功能異常的一個(gè)機(jī)制。有報(bào)道指出異常增加的卵巢交感神經(jīng)興奮性往往出現(xiàn)在卵巢周期異常、排卵減少和多囊卵巢改變之前[5]。

交感神經(jīng)系統(tǒng)和腎上腺髓質(zhì)組成了交感腎上腺系統(tǒng)，受發(fā)育早期的環(huán)境影響，包括營(yíng)養(yǎng)。新生兒時(shí)期暴露于寒冷環(huán)境導(dǎo)致永久棕色脂肪組織交感支配和交感神經(jīng)興奮性增加[6]；新生兒時(shí)期的免疫應(yīng)激導(dǎo)致長(zhǎng)期的外周交感神經(jīng)興奮性升高[7]；反之，新生兒撫觸減少成年雄性大鼠脾臟和心臟的交感神經(jīng)興奮性[8]。TH，兒茶酚胺生物合成的限速酶，在本研究中其免疫染色在肥胖組大鼠的腎上腺髓質(zhì)表達(dá)明顯增強(qiáng)。已經(jīng)知道，嗜鉻細(xì)胞的成熟有賴(lài)于早期發(fā)育時(shí)期的營(yíng)養(yǎng)狀況。交感腎上腺系統(tǒng)在遺傳性肥胖和下丘腦性肥胖[9]大鼠亦是異常增高的。

肥胖往往使得交感腎上腺興奮性基礎(chǔ)閾值增加，導(dǎo)致對(duì)應(yīng)激后的反應(yīng)減弱[10]。給大鼠喂養(yǎng)高脂飲食導(dǎo)致心臟和棕色脂肪組織的交感興奮性增加，而饑餓或限制能量攝入導(dǎo)致這些組織交感興奮性受抑制。同樣，在人類(lèi)，也有類(lèi)似表現(xiàn)。在大鼠和人類(lèi)觀察到的肥胖交感神經(jīng)興奮性增加是由于廣泛的脂肪儲(chǔ)存在脂肪組織，產(chǎn)生激素信號(hào)，包括瘦素和胰島素。這些激素可以到達(dá)下丘腦，導(dǎo)致自主輸出的改變，尤其是增加交感神經(jīng)興奮性[11]。給大鼠靜脈輸注瘦素，使其血漿水平達(dá)到人類(lèi)嚴(yán)重肥胖水平，可以使血壓和心率增加，由此證明瘦素可能是肥胖和增加的交感神經(jīng)興奮性的重要因素[12]。

為了驗(yàn)證，本研究除了檢測(cè)卵巢和腎上腺組織的交感神經(jīng)興奮性外，還測(cè)定了交感神經(jīng)中樞—藍(lán)斑核的TH mRNA的水平。結(jié)果顯示小窩喂養(yǎng)組大鼠其藍(lán)斑核中TH mRNA表達(dá)較正常喂養(yǎng)組明顯增加。這表明了中樞交感神經(jīng)系統(tǒng)興奮性基礎(chǔ)水平的上調(diào)。在該模型中，增加的胰島素和瘦素可能起到作用[13]。成年期增加的交感神經(jīng)性可能解釋了發(fā)育起源的疾病，由于交感興奮性增加如成年后發(fā)病的高血壓，在這個(gè)模型中已經(jīng)體現(xiàn)。對(duì)大鼠喂養(yǎng)高脂飲食，可使其血壓進(jìn)行性升高，并且和體質(zhì)量相關(guān)，進(jìn)一步證實(shí)了該假說(shuō)[14]。該結(jié)果也可以解釋日后生活中小窩喂養(yǎng)大鼠表現(xiàn)出一些交感神經(jīng)興奮性增高有關(guān)的疾病如高血壓等。

本研究證實(shí)了早期肥胖能通過(guò)上調(diào)交感腎上腺系統(tǒng)的興奮性而加速雌鼠青春期啟動(dòng)和影響其卵巢功能，為發(fā)育起源的疾病的預(yù)防和治療提供了研究基礎(chǔ)。

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（本文編輯：吳健敏）

Long-term programming effects of obesity on the sympathoadrenal system in female rats

WU Xueqing1,YANG Simeng1, LI Yuehua1, ZHOU Qiangyong1, CHEN Haiyan1, LI Haiying2.1.Department of Gynecology, the First Affiliated Hospital of Wenzhou Medical University, Wenzhou, 325015; 2.Department of Cardiology, the First Affiliated Hospital of Wenzhou Medical University, Wenzhou, 325015

Objective:To investigate the long-term programming effects of obesity on the sympathoadrenal system in female rats.Methods:The litter size was adjusted to 4 pups per litter for the treatment group and 12 neonates per dam in the controls at postnatal day 0. Body weights were measured weekly. Vaginal opening and vaginal cytology smears were monitored from postnatal day 28. At the 10 weeks of age, the sympathetic nerve activity in adrenals and ovaries were detected by immunohistochemistry and the expression of TH mRNA in the locus coeruleus were investigated by in situ hybridization.Results:As compared to normal litters, the small litter rats were obesity throughout life. The puberty onsets were obviously advanced (35.5±0.8 d in treatment groups vs.37.6±0.3 d) in controls. The immuno-staining of TH were significantly enhanced in both the ovaries and adrenals in small litters. The level of TH mRNA in the locus coeruleus was significantly increased in small litters. All the differences were statistically significant (P<0.05).Conclusion:Obesity programmed the reproductive function of female rats by up-regulation of the sympathoadrenal system.

obesity; adrenal; ovary; reproductive function; sympathetic nerve; rats

R711

A

1000-2138（2014）03-0157-04

2013-11-25

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（81100392）；浙江省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（Y2110606）；教育部留學(xué)回國(guó)人員科研啟動(dòng)基金資助項(xiàng)目（2012-1707）。

吳雪清（1971-），女，浙江溫州人，教授，博士。

李海鷹，主任醫(yī)師，Email：lihaiying111@gmail. com。