楊洺揚，王 煒，李真光，董 鵬，胡桂學，武 華，陳立志，程世鵬，冷 雪＊

（1.中國農(nóng)業(yè)科學院特產(chǎn)研究所特種經(jīng)濟動物分子生物學國家重點實驗室，吉林吉林130122；2.吉林農(nóng)業(yè)大學，吉林長春130118；3.華威特（北京）生物科技有限公司，北京100085）

牛呼吸道合胞體病毒（Bovine respiratory syncytial virus，BRSV）屬于副黏病毒科肺病毒亞科肺病毒屬，為單股負鏈RNA病毒［1］。病毒基因組從3′端到5′端轉(zhuǎn)錄，得到10個mRNA，這10個mRNA翻譯11個蛋白，分別為 NS1、NS2、N、P、M、SH、G、F、M2－1、M2－2和 L［2－3］。20世紀70年代初牛呼吸道合胞體病被公認為犢牛呼吸道系統(tǒng)主要疾病，BRSV呈世界性分布，廣泛分布于美國、加拿大、瑞士、比利時、澳大利亞、日本等國家。犢牛較為易感，潛伏期可長達幾個月，因此牛群間的潛伏期感染很難得到控制。其高發(fā)病率、高病死率對養(yǎng)牛業(yè)及奶制品市場造成了嚴重影響［4］。目前，我國市場上尚無用于該病防控的疫苗應用，因此，建立快速的檢測方法，淘汰陽性牛，對于降低該病造成的損失就顯得尤為重要。國內(nèi)外對BRSV的檢測均進行了大量研究，首先結(jié)合流行病學和臨床檢查做出初步診斷，然后根據(jù)實驗室方法進行確診，實驗室方法主要包括病原學和血清學方法，現(xiàn)對其進行綜述如下。

1 流行病學

1970年首次從患病牛體內(nèi)分離到BRSV，隨后在歐洲和北美等國家相繼報道出現(xiàn)BRSV。牛呼吸道合胞體病廣泛分布于世界各國，是具有很強傳染性的急性、熱性牛呼吸道疾病，山羊、豬和馬也可能感染［5］。牛呼吸道合胞體病常發(fā)生于秋冬季溫帶地區(qū)，往往由動物轉(zhuǎn)群引起，既能夠通過動物之間直接接觸傳播，也可以通過帶毒動物呼吸道分泌物或氣霧傳播，其發(fā)病率很高占乳牛呼吸道疾病的60%。一般來說其發(fā)病情況與種群密度、年齡結(jié)構(gòu)密切相關(guān)［6－7］。目前有研究認為，其最具威脅的傳染源來自亞臨床感染動物本身［8］，它們攜帶的病毒可能引起疫情在牛群中暴發(fā)，但仍需進一步證明。

2 臨床癥狀

病牛表現(xiàn)為精神沉郁、體溫升高、干咳、呼吸道有漿液性鼻液或伴有濕性咳嗽［9］。潛伏期大約3d～5d，急性型突然發(fā)熱、呼吸困難、呼吸頻率加快、張口呼吸［10］。肺部聽診支氣管音增強有濕啰音、捻發(fā)音。肺泡呈間質(zhì)性肺炎變化，可能伴有肺水腫和肺氣腫，背部區(qū)肺泡壁破裂。少數(shù)患病牛有皮下肺氣腫，肺腹側(cè)粘連，背側(cè)部腫脹。胸膜、肺小葉有氣腫性損傷。剖檢可見肺臟堅實，肺泡膈葉腫大，有纖維蛋白滲出。乳牛在感染BRSV后表現(xiàn)為泌乳量減少或停乳，妊娠母牛感染BRSV后會引起流產(chǎn)。

3 病原學檢測

3.1 細胞分離培養(yǎng)

細胞分離培養(yǎng)鑒定是最直觀的病毒鑒定方法。培養(yǎng)BRSV可以用Vero細胞、MDBK細胞或牛鼻甲骨細胞［11］。將待檢病料接種細胞后傳代培養(yǎng)，第一代一般不出現(xiàn)細胞病變效應（cytopathic effect，CPE），隨著傳代次數(shù)增加，出現(xiàn)CPE時間縮短，病變初期出現(xiàn)細胞融合，晚期聚集、圓縮，形成合胞體［12］，細胞液可見輪廓明顯嗜酸性包涵體［13］。

3.2 聚合酶鏈反應

聚合酶鏈反應（polymerase chain reaction，PCR）通過擴增病毒基因片段來檢測病毒，是近年來快速發(fā)展和應用的病原學檢測方法，PCR以它特異性強、敏感性高、高效快速的特點已經(jīng)成為實驗室診斷最常用的方法。Vilcek M等［14］建立了BRSV套式PCR檢測方法，這種方法大大提高了檢測的敏感性，在對35個臨床樣品的檢測中陽性檢出率達到89%，遠高于采用傳統(tǒng)免疫熒光方法檢測的66%。Boxus M 等［15］建立了RT－PCR方法檢測BRSV，引物及探針設(shè)計來自于BRSV核蛋白保守區(qū)序列，具有很好的重復性和特異性，敏感性能夠達到傳統(tǒng)PCR方法的100倍。在國內(nèi)，王紅等［16］在2008年也建立了BRSV的RT－PCR檢測方法。Thonur L等［17］開發(fā)了一步多重實時定量RT－PCR檢測方法，該方法可以快速的同時檢測牛呼吸道合胞體病毒、牛皰疹病毒1型和牛副流感病毒3型3種主要牛呼吸道病毒。陽性檢出率高達97%，敏感性與單一PCR基本一致。我國科研工作者也于2013年建立了牛病毒性腹瀉病毒、牛呼吸道合胞體病毒、牛副流感病毒3型的多重PCR檢測方法［18］。這種方法憑借它快速、高特異性、敏感性以及節(jié)約成本等特點，將在牛呼吸道病毒檢測中得到廣泛應用。Masayuki U等［19］在2013年開發(fā)的微滴RT－PCR可在10min內(nèi)完成PCR檢測，大大提高了診斷效率。

4 血清學診斷

4.1 中和試驗

以待檢血清和標準毒進行中和試驗，將待檢血清用稀釋液進行2倍遞增稀釋之后加入等量標準病毒液（200TCID50／0.1mL）充分混合。37℃感作1h后將混合液接種在鋪滿單層Vero細胞的96孔培養(yǎng)板，置于37℃、體積分數(shù)為5%的CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，48h后開始觀察，14d判定最終結(jié)果。中和抗體效價2倍以上為陽性血清［20］。中和試驗是傳統(tǒng)的病毒診斷方法，但診斷時間較長，對人工免疫后動物無法診斷。

4.2 酶聯(lián)免疫吸附試驗

酶聯(lián)免疫吸附試驗（enzyme－linked immunosorbent assay，ELISA）作為一項血清學診斷技術(shù)，已在動物疫病診斷工作中已經(jīng)得到了廣泛應用。由于酶的高效催化作用使其對抗原抗體結(jié)合識別起到了放大作用，從而達到了快速、靈敏、高效的檢測要求，是重要的疫病早期診斷方法。Rhodes M B等［21］開發(fā)了阻斷ELISA檢測BRSV的方法，采用辣根過氧化氫酶標記抗體，抗原抗體特異結(jié)合后洗滌，滴加底物溶液，通過測定底物吸光值確定抗原抗體含量。相比于傳統(tǒng)中和滴定試驗，這種方法能夠更早期的檢測到血清中的抗體，而且其特異性明顯優(yōu)于其他ELISA方法。在我國，王紅等建立了以BRSV重組N蛋白為包被抗原的的間接ELISA檢測方法，并且進一步證明這種方法的符合率、敏感性、特異性分別達到了87.7%、90.9%和85.0%，為今后開發(fā)ELISA試劑盒提供了有效的技術(shù)手段。近些年，國內(nèi)外還報道了斑點ELISA［22］、夾心ELISA［23］、多重 ELISA［24］及 Luminex多元血清檢測［25］等方法，都顯示出相比于傳統(tǒng)檢測方法更高的敏感性和更快的速度。

4.3 直接免疫熒光抗體試驗

將待檢牛鼻拭子處理后固定在載玻片上，用可以與BRSV F蛋白特異結(jié)合的熒光標記物質(zhì)結(jié)合，培養(yǎng)后洗去未結(jié)合的熒光物質(zhì)，在熒光顯微鏡下觀察是否有熒光物質(zhì)［26］。這種方法敏感性高，速度快，但非特異性染色仍有待解決，結(jié)果判定客觀性不足，試驗操作比較復雜。

隨著國內(nèi)外科研工作者對牛合胞體病毒的潛心研究，特異性強、敏感性高、操作簡便快捷的檢測方法將逐漸取代傳統(tǒng)的檢測手段，不斷優(yōu)化的商品化BRSV檢測試劑盒的問世也將為牛呼吸道合胞體病的診斷和預防提供有力的保障。

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