盧 昌，吳國華，王 曼，顏新敏，趙志荀，吳 娜，朱海霞，李 健，張 強

（中國農(nóng)業(yè)科學院蘭州獸醫(yī)研究所 家畜疫病病原生物學國家重點實驗室，國家口蹄疫參考實驗室，甘肅省生物檢測工程技術研究中心，甘肅 蘭州 730046）

痘病毒是一種比較大的、復雜的、有包膜的DNA病毒，該病毒可以在脊椎動物或非脊椎動物細胞的細胞質(zhì)內(nèi)完成復制。痘病毒大約有100個或更多的同源性較高的基因存在于所有脊椎動物痘病毒中，50個同源基因存在于脊椎動物痘病毒和昆蟲痘病毒中。這些高度保守基因的產(chǎn)物參與了病毒的入侵、基因表達、DNA復制、分子內(nèi)二硫鍵的形成以及病毒粒子組裝。然而，那些保守性不高基因的產(chǎn)物則參與了病毒與宿主的特異性反應[1]。目前研究最為透徹的屬于正痘病毒基因組，包括天花病毒、痘苗病毒、牛痘病毒。由于天花病毒、猴痘病毒可能被作為潛在的生物武器使用，人們對正痘病毒的研究也越來越多。痘苗病毒是痘病毒科最典型的成員，其曾經(jīng)作為天花病毒的疫苗使用。雖然天花病毒的疫苗可以為人們提供不錯的保護，但是接種以后仍然會引起皮膚膿瘡以及淋巴結疾病和發(fā)熱，嚴重的甚至可以威脅生命安全，因此也需要一種安全而有效的天花疫苗。痘苗病毒的研究不僅為有效的天花疫苗研究提供了基礎，還為痘病毒科其他成員的研究提供了模板[2]。

絕大多數(shù)DNA病毒可以利用宿主細胞的蛋白來完成自身基因組的復制和蛋白的表達。然而，痘苗病毒（Vaccinia virus，VACV）完全可以利用病毒自身編碼的蛋白在宿主細胞的細胞質(zhì)種完成它的生命活動。當感染性病毒粒子入侵到宿主細胞質(zhì)以后，病毒利用包膜上的蛋白質(zhì)和酶完成病毒早期mRNA和蛋白質(zhì)的合成，緊接著VACV利用這些蛋白質(zhì)完成病毒DNA的復制。隨后VACV以復制的DNA為模板完成中后期mRNA的合成，其合成的蛋白質(zhì)參與痘病毒的生命周期，如VACV的抗病毒作用以及痘苗病毒入侵宿主細胞。VACV與痘苗病毒屬其他成員一樣有許多不同感染形式，如成熟的病毒粒子（MV）、有包膜的病毒粒子（WV）以及細胞外的病毒粒子（EV）。VACV的MV包括一個含有雙鏈DNA的病毒核心，兩個蛋白側體以及一層囊膜，囊膜上含有20多種病毒蛋白。一些MV可以被修飾后的高爾基體膜或者包內(nèi)囊泡包裹，從而形成MV，同時另外一些MV隨著細胞的裂解釋放到細胞外。EV外膜上含有6種不同的病毒蛋白。MV的產(chǎn)量比較高，可以介導病毒在不同宿主間的傳播，而EV介導病毒在同一宿主體內(nèi)的傳播[3]。

許多有包膜的病毒只需要編碼一種或兩種蛋白質(zhì)就可以滿足病毒的吸附和入侵，然而痘苗病毒需要11種～12種蛋白質(zhì)完成這個過程。這些蛋白最初是通過鑒定跨膜蛋白的時候被發(fā)現(xiàn)，并且它們在所有痘病毒種十分的保守，并且構建突變株來確定它們的表型。目前9種蛋白（A16、A21、A28、G3、G9、H2、J5、L5和 O3）可以構成完整的入侵融合復合體（entry／fusion complex，EFC），并且將 F9和L1定義為EFC相關蛋白[4]。EFC隨著痘苗病毒DNA復制的完成而合成，并且專門用于進行病毒入侵。

1 入侵融合復合體亞基蛋白的結構

VACV的MV囊膜上含有20多種結構蛋白，這些蛋白主要參與病毒囊膜與內(nèi)吞小泡膜之間的融合，使得病毒核心能夠進入細胞質(zhì)。VACV的融合是由EFC介導的，而EFC由MV或MV樣例子的囊膜蛋白組成的，其中包括 A16[5]、A21[6]、A28[7]、G3[8]、G9[9]、H2[10]、J5[11]、L5[12]、O3[13]及 F9[14]和L1[15]。其中 A16、A21、A28、G3、G9、H2、J5、L5或O3其中任何一種蛋白不能表達時，則不會形成穩(wěn)定的EFC，它們組成EFC的核心。而L1和F9并不是EFC組裝所必須的，L1和F9結合在EFC周圍，被稱為EFC相關蛋白。經(jīng)多序列比對發(fā)現(xiàn)，VACV的這11種蛋白同系物之間有著一些保守的特征，比如保守的擴膜結構域，保守的Cys殘疾以及分子內(nèi)二硫鍵。對這11種蛋白的同源物進行BLAST搜索，我們可以找到包括羊痘病毒屬在內(nèi)的多種痘病毒與之同源的蛋白，并且在其他病毒中沒有找到與之同源的蛋白。編碼EFC蛋白基因的轉錄本都是在病毒感染晚期檢測到的，且試驗證明EFC蛋白是VACV晚期基因編碼的重要結構蛋白。對這些基因的序列分析發(fā)現(xiàn)，其ORF上有啟動子附近存在著保守的TAAATGG序列，該序列是VACV晚期啟動子所特有的[16]。

EFC結構蛋白的大小約在4ku～43ku之間，與其他病毒的Ⅰ型和Ⅱ入侵融合蛋白不同，VACV的EFC蛋白都是非糖基化的蛋白。EFC蛋白最初是通過鑒定跨膜蛋白的時候發(fā)現(xiàn)的，其中A21、G3、H2和O3擁有N端跨膜結構域，而A16、F9、G9、J5、L1和L5擁有C端跨膜結構域。研究發(fā)現(xiàn)，這些蛋白通過其跨膜結構域與MV相連接，非跨膜結構域暴露于MV的囊膜外，發(fā)揮一定的生物學功能。疏水結構分析發(fā)現(xiàn)，G3L有2個疏水結構域，分別位于N端和C端。而G3L通過其N端疏水結構域結合到MV囊膜上，其C端結構域可能結合到EV的囊膜表面。同時，G3L中間區(qū)域的保守型遠低于其N端和C端的疏水結構域，具體原因還不清楚[8]。值得注意的是含有35個氨基酸殘基的O3是VACV編碼的最小的蛋白。O3其他痘病毒的同源蛋白大小在29個～48個氨基酸殘基之間，并且它們之間氨基酸的一致性比較低，但是可以彌補O3的刪除突變。痘病毒科O3L的TM結構域十分的重要，其N端螺旋結構長度一樣，且后面都含有一個基礎的氨基酸和Pro殘基，再者其C端沒有保守的結構，長度變化很大，這說明EFC結構成員之間的相互作用可能是由TM決定的[13]。

VACV基因組可以編碼3種氧化還原酶（E10、A2.5和G4），這3種酶可以催化IMV的膜蛋白形成分子內(nèi)二硫鍵。除了O3L和G3L以外，VACV的其他入侵融合蛋白都是通過VACV特有的氧化還原途徑形成保守的分子內(nèi)二硫鍵。迄今為止，尚未發(fā)現(xiàn)VACV其他蛋白通過該途徑形成分子內(nèi)二硫鍵。Senkevich T G等[17]研究發(fā)現(xiàn)，EFC蛋白的分子內(nèi)二硫鍵并不參與EFC的形成，可能在穩(wěn)定EFC結構和EFC發(fā)揮生理功能時起著一定的作用。其他病毒的EFC分子內(nèi)二硫鍵在病毒與宿主細胞膜融合過程中有著重要作用，因而我們假設VACV的EFC分子內(nèi)二硫鍵也可能起著同樣的作用。

EFC相關蛋白L1是目前為止研究的比較清楚的蛋白質(zhì)。L1蛋白是VACV一個強有力的中和性抗體，且其暴露于MV的表面。研究發(fā)現(xiàn)，L1R至少存在2個抗原位點，其中一個中和表位位于118～128，且抗L1R的中和抗體可以促進VIG的效應。L1蛋白的N－端結構十分的保守，存在烷基化保守的結構 G－X－X－X－S／T。該蛋白可以在其 N 端的倒數(shù)第2個甘氨酸殘基上發(fā)生烷基化，并且烷基化需要其N端12個氨基酸殘基的參與。N端甘氨酸的突變可以抑制感染性VACV的互補作用，共聚焦顯微鏡數(shù)據(jù)顯示該突變可以改變L1在細胞內(nèi)的定位，并且可以減少分子內(nèi)二硫鍵的形成。但是N端甘氨酸的突變并沒有影響其與EFC和MV的結合。L1的晶體結構是α－螺旋束包裹兩條的β－折疊。L1蛋白的胞外結構含有一個內(nèi)部疏水凹陷，該凹陷可以容納一個十四烷酸分子，且該凹陷接近于L1蛋白的N端。L1蛋白的烷基化位點是通過蛋白酶水解暴露出來的，且L1蛋白的二硫鍵可以穩(wěn)定該結構。此外，可溶性L1可以在病毒吸附階段抑制VACV的入侵，并且L1可以結合到細胞表面，與細胞表面的黏多糖發(fā)生相互作用，這些證據(jù)都表明L1蛋白可能是病毒受體蛋白[18]。

2 入侵融合復合體亞基蛋白的作用

VACV的EFC蛋白最早是從感染細胞膜上分離得到的，隨后通過免疫共沉淀等技術對VACV其他的EFC蛋白進行了初步的分離和鑒定。通過對EFC缺失毒株的研究發(fā)現(xiàn)，EFC蛋白在VACV新陳代謝過程中有著比較相似的作用。在噬斑試驗中，EFC亞基缺失毒株形成的噬斑明顯小于野生型毒株形成的噬斑，同時EFC亞基缺失毒株的病毒滴度明顯低于野生型。這些數(shù)據(jù)都表明EFC亞基是VACV完成復制所必須的，與病毒的獨立密切相關。在電子顯微鏡下對EFC亞基缺失的VACV病毒粒子和野生型VACV病毒粒子的形態(tài)進行觀察，發(fā)現(xiàn)2個病毒粒子的形態(tài)幾乎完全相同，無法在電子顯微鏡下進行區(qū)別。這表明，EFC亞基并不參與病毒粒子的組裝，EFC亞基的缺失不會影響病毒粒子的形態(tài)。

有研究表明，VACV的MV是通過胞吞的方式內(nèi)化進入宿主細胞的。病毒以胞吞方式侵入宿主細胞主要包括兩個步驟結合和內(nèi)化。VACV入侵宿主細胞的最后一步是病毒囊膜與內(nèi)吞小泡膜發(fā)生融合，結果使病毒核心進入細胞質(zhì)。用MV膜上L1蛋白抗體檢測病毒粒子與細胞膜的結合，用A4核心蛋白抗體檢測細胞之內(nèi)病毒粒子的核心[19]，結果顯示EFC亞基缺失不會影響MV結合到細胞膜上，但是會影響病毒粒子的脫殼，阻礙病毒粒子進入細胞質(zhì)內(nèi)。野生型VACV感染的細胞如果暴露于低pH環(huán)境就可以形成合胞體，這種過程被稱為從內(nèi)部融合，這個過程主要依賴于感染細胞表面的MV。研究發(fā)現(xiàn)，EFC也參與VACV內(nèi)部融合的合胞體的形成過程，EFC亞基的缺失將阻礙VACV感染細胞合胞體的形成[20]。

MV囊膜上的A25／A26蛋白異二聚體可以抑制EFC的功能，因此可以防止EFC介導的融合提前發(fā)生，當缺少其中任何一種蛋白時膜融合就能在中性pH條件下發(fā)生。因此可以簡單的推測，內(nèi)吞小泡內(nèi)的酸性環(huán)境使A25／A26異二聚體解離，從而解除對EFC功能的抑制，導致膜融合發(fā)生。但是用酸或蛋白酶對MV進行預處理可以加速病毒的入侵，這表明酸性環(huán)境導致的A25／A26異二聚體解離是部分可逆的，或者不足以啟動融合。一些VACV毒株不需要酸性條件即可發(fā)生融合，這可能因為他們不表達A25／A26蛋白異二聚體[21]。

此外，許多病毒編碼的蛋白質(zhì)都可以被十四烷酸所修飾，且這些蛋白一般位于病毒的衣殼或囊膜上。烷基化的蛋白在病毒代謝過程中有著重要的作用，例如小核糖核酸病毒的烷基化蛋白VP4是感染性病毒粒子組裝所必須的，也影響著病毒感染細胞過程中病毒脫衣殼。同樣在痘苗病毒的EFC中也存在著3種可以烷基化的蛋白質(zhì)，G9R、A16L和L1R，這些蛋白的N端存在著可以發(fā)生烷基化的位點。這些蛋白的烷基化可以調(diào)節(jié)其余病毒囊膜或病毒其他成分之間的反應，從而影響病毒粒子的組裝、成熟與釋放。除了L1R蛋白的烷基化研究的比較透徹以外，其他兩類蛋白是如何烷基化的，以及烷基化后對病毒的影響還不是十分的清楚。

3 入侵融合復合體亞基之間的相互關系

當EFC蛋白中的任何一種蛋白合成被抑制時，EFC將變的十分的不穩(wěn)定[10]，這說明EFC是通過亞基之間的相互作用結合到一起的。然而即使在一些不穩(wěn)定條件下，一些EFC亞基之間的作用依然存在，如G3和L5之間的相互作用[8]。EFC亞基之間的相互作用包括 H2與 A28[10]、A16與 G9[9]、G3與L5[8]等。H2蛋白的性質(zhì)與A28比較相似，Nelason等研究發(fā)現(xiàn)H2與A28之間可以發(fā)生直接的相互作用。A28是VACV重要的中和抗體，其免疫原性可以增強與H2之間的相互作用。Shinoda K等[22]研究發(fā)現(xiàn)，A28與H2共表達可以增強A28的中和活性，并且VACV的中和表位存在于A28蛋白的C－端區(qū)域。G3L可能也與A28L、H2R、A21L發(fā)生結合作用，但是在EFC形成過程中G3L是如何與這些蛋白相互作用的還不清楚。A16∶G9也可以與融合調(diào)節(jié)蛋白異質(zhì)二聚體A56∶K2相互作用，也可以與A26蛋白相互作用，這種結合可以抑制感染細胞多合胞體的形成。

在EFC亞基中，J5、A16和G9之間的同源性比較高，它們在痘病毒科中都十分的保守，且它們有可能起源于同一個基因，經(jīng)過不同的進化而在痘病毒入侵過程中行使不同的功能。值得注意的是，這3種蛋白中Cys殘基的位置十分保守，即A16中分子內(nèi)二硫鍵形成的位置與G9和J5中分子內(nèi)二硫鍵形成的位置完全一樣。

4 小結

VACV的MV上將近有20多種跨膜蛋白，其中有9種蛋白屬于VACV的EFC蛋白，2種蛋白屬于EFC相關蛋白。這11種蛋白在結構上幾乎沒有相關性，且每一種蛋白都是痘苗病毒入侵／融合所必須的，因此它們在功能和結構上并不存在冗余。然而，這些蛋白卻有著一些共同的性質(zhì)：①在所有痘病毒屬中都十分保守，是一個普遍的入侵機制；②在病毒感染晚期的病毒粒子組裝時表達；③擁有一個跨膜區(qū)域；④屬于MV囊膜上的非糖基化蛋白；⑤可以通過痘病毒細胞質(zhì)的氧化途徑形成一個或多個分子內(nèi)二硫鍵；⑥不影響病毒粒子的形態(tài)。目前我們還不能很好地解釋為什么痘病毒入侵需要如此多的蛋白質(zhì)參與。

此外，小分子質(zhì)量蛋白I2的條件致死性突變表型與其他EFC蛋白的條件致死性表型一樣，因此該蛋白可能屬于EFC蛋白。由于I2蛋白的分子質(zhì)量較小及其疏水性的緣故，不能使用質(zhì)譜法對該復合物進行純化，無法對該蛋白的性質(zhì)進行進一步的研究[23]。

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