張晶晶, 艾紅佳， 牛慶元, 馬德順

(沈陽大學(xué) 生命科學(xué)與工程學(xué)院， 沈陽 110044)

近期研究發(fā)現(xiàn)α-SMA與腫瘤的發(fā)展之間存在相關(guān)性。國內(nèi)學(xué)者研究金地鼠頰囊白斑癌變模型標(biāo)本的α-SMA表達(dá)情況時發(fā)現(xiàn)，隨著細(xì)胞癌變程度增高，其α-SMA的表達(dá)量越低[1]。而其他學(xué)者在對乳腺癌侵潤行為的研究中發(fā)現(xiàn)，α-SMA的表達(dá)程度與乳腺癌侵潤進(jìn)程相關(guān)[2]。而Chen在研究中證實α-SMA能夠加強(qiáng)細(xì)胞牽引力(cell traction forces，CTFs)[3]。國外的學(xué)者發(fā)現(xiàn)α-SMA是一種機(jī)械敏感性蛋白，介導(dǎo)應(yīng)力纖維的收縮[4-6]。Kraning-Rush等以人的乳腺癌、前列腺癌與肺癌為研究對象，各研究對象均取具轉(zhuǎn)移性與不具轉(zhuǎn)移性兩種細(xì)胞樣本；對比各組牽引力時發(fā)現(xiàn)，隨著癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移的潛能性增加，其細(xì)胞牽引力顯著性增大[7]。Indra等對比4個具有不同轉(zhuǎn)移能力、同一來源的乳腺腫瘤細(xì)胞系的牽引力時，得出小鼠腫瘤細(xì)胞隨著轉(zhuǎn)移潛能的增加，其牽引力在2D水平上表現(xiàn)出減小的趨勢，但在3D水平上具有增大的傾向[8]。

這些研究初步探索了腫瘤細(xì)胞與α-SMA以及腫瘤細(xì)胞與細(xì)胞牽引力的關(guān)系，然而，單個細(xì)胞水平的α-SMA表達(dá)與腫瘤發(fā)生以及CTFs之間的關(guān)系尚未見報道。因此，本實驗以α-SMA，CTFs為研究對象，輔以細(xì)胞微絲的觀察，研究了小鼠腫瘤細(xì)胞與二者的相關(guān)性,試圖探索它們與腫瘤侵潤過程的相關(guān)性。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及試劑

Hepatoma cells (Hepa1-6)以及Lewis肺腺癌細(xì)胞株(LLC)細(xì)胞由中科院提供。C57BL/6j小鼠購自沈陽醫(yī)學(xué)院動物實驗中心，4周齡，體重17 g±2 g，雌性。實驗條件符合SPF要求，所用物品均經(jīng)高壓滅菌消毒。高糖DMEM培養(yǎng)基購于Invitrogen公司，胎牛血清購于德國Biochrom公司，抗體及鬼筆環(huán)肽購于Sigma公司。胰蛋白酶購自Sigma公司。自制雙抗(含青霉素、鏈霉素)。

1.2 細(xì)胞的獲取與培養(yǎng)

1.2.1 小鼠細(xì)胞原代培養(yǎng)

小鼠肝細(xì)胞原代培養(yǎng)。取4周齡SPF級雌性C57BL/6j，頸椎脫臼法處死，解離小鼠肝組織。剝?nèi)ソM織外包裹的膜，將組織剪碎，加入無菌PBS反復(fù)漂洗，當(dāng)組織塊顏色由深紅變?yōu)闇\白后，1500 r/min離心5 min，棄上清。向組織塊中加入3倍體積，濃度為0.1%的Ⅱ型膠原蛋白酶溶液，4°C冰箱消化過夜。次日，取出裝有消化中的組織塊的離心管，吸打至組織塊分散為細(xì)胞團(tuán)，用200目細(xì)胞篩剔除體積較大的組織或細(xì)胞團(tuán)，將篩出的液體1500 r/min低溫離心5 min，棄上清，加入5 mL含10%胎牛血清的培養(yǎng)基，接入培養(yǎng)瓶中，置于37℃，CO2濃度為5%的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。1 h左右觀察細(xì)胞貼壁情況，舍棄貼壁較快的成纖維細(xì)胞，將培養(yǎng)液移至另一瓶中，反復(fù)2～3次，對細(xì)胞進(jìn)行初步純化，待細(xì)胞長滿培養(yǎng)瓶底面積的80%～90%后，利用不同細(xì)胞對胰蛋白酶的耐受性不同，進(jìn)一步對細(xì)胞進(jìn)行純化，得到純度較高的肝細(xì)胞。對所得肝細(xì)胞通過形態(tài)學(xué)以及PAS染色法進(jìn)行鑒定[9]，

小鼠肺細(xì)胞原代培養(yǎng)。剖離小鼠肺組織，于1%PBS中除去氣管、血管等組織，用PBS清洗組織內(nèi)的血污后，用眼科剪將組織剪成大小為1 mm3左右的小塊，并加入3倍體積、濃度為0.25%的胰酶，置于37℃下消化10～20 min后，加入等量的含有10%FBS的DMEM培養(yǎng)基終止消化，200目篩網(wǎng)過濾后，1500 r/min低溫離心5 min，去上清，再將沉淀加入0.1%Ⅰ型膠原酶在37℃下消化10～15 min，加入含有10%FBS的DMEM培養(yǎng)基終止消化，1500 r/min離心5 min，將細(xì)胞懸液接種于培養(yǎng)瓶中，置37℃，5%CO2的培養(yǎng)箱中培育，1 h左右觀察細(xì)胞貼壁情況，此時貼壁的多為成纖維細(xì)胞，懸浮的多數(shù)為肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞和其他雜細(xì)胞，將培養(yǎng)液小心吸出置于另一瓶中繼續(xù)培養(yǎng)，反復(fù)2～3次，最后吸出培養(yǎng)液，1000 r/min離心5 min，棄上清，用含10%FBS的DMEM培養(yǎng)基重懸沉淀細(xì)胞，接種于培養(yǎng)瓶置37℃，5%CO2的培養(yǎng)箱中培育。對肺細(xì)胞通過SP-C免疫熒光染色進(jìn)行鑒定[10-11]。

1.2.2 小鼠癌細(xì)胞建系培養(yǎng)

取Hepal-6細(xì)胞株與LLC細(xì)胞株，置于含5%CO2，37℃ 的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)基為含10%FBS的DMEM高糖培養(yǎng)基，每2 d換液1次，顯微鏡下觀察，待培養(yǎng)細(xì)胞總量達(dá)到實驗需求、細(xì)胞處于對數(shù)生長期時進(jìn)行消化，血球計數(shù)板進(jìn)行計數(shù)，制成濃度為1×107/mL的細(xì)胞懸液。取4周齡SPF級雌性C57BL/6j，按0.2 mL/鼠的量接種于4周齡雌性C57BL/6j小鼠前肢部皮下，接種細(xì)胞后，觀察小鼠皮下成瘤與腫瘤生長情況。待成瘤后，頸椎脫臼法處死小鼠，分離皮下的腫瘤組織，并按照正常細(xì)胞的制取方法獲得Hepal-6與LLC細(xì)胞。培養(yǎng)的初始階段細(xì)胞的形態(tài)并不穩(wěn)定，傳代至細(xì)胞形態(tài)基本穩(wěn)定時，即可用于后續(xù)試驗。

1.3 α-SMA的免疫熒光染色

將去除殘余培養(yǎng)基后的細(xì)胞爬片于3.7%的甲醛-PEMD固定液中固定7 min，1%Triton X-100中通透10 min，37℃ 1%山羊血清中孵育1 h，以封閉爬片上的非特異性抗原，洗去山羊血清后，加入一抗于4℃孵育過夜；洗去一抗后加入FITC標(biāo)記的二抗，于37℃避光染色2 h，每次更換溶液期間，都以如下程序漂洗：PBS 5 min×3次，ddH2O 3 min×1次，以保證后續(xù)的步驟不被影響。染色結(jié)束后置于熒光顯微鏡(Leica 3000B)下觀察并拍照記錄。由于熒光本身具有淬滅特性，為了后續(xù)圖像分析的準(zhǔn)確性，拍照時應(yīng)在最短時間內(nèi)完成。

1.4 鬼筆環(huán)肽染色

取密度適中的細(xì)胞爬片，用PBS輕柔洗滌；3.7%的甲醛-PEMD固定10 min，PBS洗去固定液，略干燥后滴0.1%Triton X-100處理10 min，PBS稍洗，加入20 μL 5 μg/mL鬼筆環(huán)肽染液到清潔載玻片上，將爬片有細(xì)胞的一面反扣其上，避光染色40 min，取出后用PBS和蒸餾水沖洗，顯微鏡下觀察。

1.5 細(xì)胞牽引力的測算

1.5.1 CTF技術(shù)的基本原理

細(xì)胞貼附于彈性基質(zhì)時，會使貼附表面發(fā)生形變，根據(jù)材料力學(xué)原理，計算基質(zhì)的形變程度可以間接測算細(xì)胞牽引力的大小，方向及其他力學(xué)特征量。

1.5.2 操作步驟

確定所需彈性基質(zhì)的剛度，并按所需各成分的配比制備彈性基質(zhì)。本實驗采用硬度為3000(Pa)的雙層聚丙烯酰胺凝膠，下層為無熒光微珠的基底層，上層則摻入了3%～4%的熒光微珠。在制備好的彈性基質(zhì)上，按照1000～1500細(xì)胞/盤的密度種植細(xì)胞，并于37℃，5% CO2的條件下避光培養(yǎng),待細(xì)胞貼壁后，補(bǔ)充2.5 mL培養(yǎng)基，整個細(xì)胞培養(yǎng)的時間應(yīng)控制在6 h。每個樣本需拍攝3張圖片供后續(xù)計算：第1張應(yīng)記錄細(xì)胞在普通光源下的形態(tài)與位置；第2張應(yīng)記錄在有細(xì)胞貼附時，各熒光微珠所處位置；第3張應(yīng)記錄細(xì)胞脫離基質(zhì)后，各熒光微珠所處位置[12-14]。

1.5.3 圖像數(shù)據(jù)的分析與處理

將拍攝好的圖片導(dǎo)入MATLAB7.0中計算各樣本的均方根牽引力，投影面積，最大牽引力等各項數(shù)據(jù)，將所得數(shù)據(jù)匯總錄入spss17.0進(jìn)行K-S檢驗及t檢驗。

2 結(jié)果

A—為小鼠肝細(xì)胞α-SMA的分布；B—為小鼠Hepa1-6細(xì)胞α-SMA的分布；C—為小鼠肺細(xì)胞α-SMA的分布；D—為小鼠LLC細(xì)胞α-SMA的分布。

圖1小鼠肝細(xì)胞、肺細(xì)胞癌變前后α-SMA分布的變化

Fig 1 The changes of the α-SMA expression level in mouse hepatic cells and lung cells before & after the canceration

由圖1可清晰的反映出α-SMA在兩種細(xì)胞內(nèi)表達(dá)強(qiáng)度的不同。在小鼠肝細(xì)胞的胞質(zhì)內(nèi)，α-SMA的分布較為均勻且表達(dá)量較高，而Hepa1-6細(xì)胞中α-SMA的分布稀疏，表達(dá)的強(qiáng)度也有明顯降低，通過軟件imagepro-plus6.0可以對圖像做進(jìn)一步的分析， 所測算出的結(jié)果匯總于圖3。

由圖2中A與B、C與D二組牽引力的分布圖可以看出，正常細(xì)胞的牽引力分布較均勻，著力點較多，力的分布面積較大。而腫瘤細(xì)胞的牽引力分布較為集中，著力點較單一，面積也相對較小。

通過K-S檢驗和t檢驗，測算出的正常細(xì)胞與腫瘤的牽引力均方根值與α-SMA的平均光密度的結(jié)果見圖3。

A—為小鼠肝細(xì)胞牽引力的測算結(jié)果；B—為小鼠Hepa1-6細(xì)胞牽引力的測算結(jié)果；C—為小鼠肺細(xì)胞牽引力的測算結(jié)果；D—為小鼠LLC細(xì)胞牽引力的測算結(jié)果。

圖2小鼠肝、肺細(xì)胞癌變前后細(xì)胞牽引力的變化

Fig 2 The calculation of cell traction force in mouse hepatic and lung cells before & after the canceration

A—小鼠肝細(xì)胞以及肝腫瘤細(xì)胞；B—小鼠肺細(xì)胞以及肺腫瘤細(xì)胞

圖3小鼠肝、肺細(xì)胞癌變前后均方根牽引力及平均光密度的測算結(jié)果

Fig 3 The calculation of RMS traction and mean density in mouse hepatic and lung cells before & after the canceration

A—小鼠肝細(xì)胞內(nèi)微細(xì)分布； B—小鼠肝腫瘤細(xì)胞內(nèi)微分布

圖4對比肝細(xì)胞與Hepa1-6細(xì)胞的微絲變化

Fig 4 The changes of microfilament between hepatic cells and Hepa1-6 cells

由上圖的數(shù)據(jù)分析得出：小鼠細(xì)胞癌變后，與正常細(xì)胞相比，肝腫瘤細(xì)胞與肺腫瘤細(xì)胞的均方根牽引力分別減小了53.4%和49.7%，t檢驗表明二者之間具有顯著性差異；二者相比，α-SMA的平均光密度分別47.9%和52.3%，t檢驗顯示其間有顯著性差異。

對比圖4中的細(xì)胞微絲可以發(fā)現(xiàn)Hepa1-6細(xì)胞內(nèi)的微絲明顯加粗、扭曲，并呈現(xiàn)不規(guī)則的排布。放大肝細(xì)胞內(nèi)部分微絲可在底面見到清晰的回落點，而在Hepa1-6細(xì)胞內(nèi)，并無明顯的回落點。

3 討論

對4細(xì)胞系、各40組樣本的均方根牽引力以及α-SMA的表達(dá)量進(jìn)行t檢驗，發(fā)現(xiàn)肝細(xì)胞與肝腫瘤細(xì)胞、肺細(xì)胞與肺腫瘤細(xì)胞在均方根牽引力的比較中P<0.05，差異顯著。這個結(jié)果提示α-SMA的表達(dá)與牽引力的變化、細(xì)胞癌變密切相關(guān)。并且，α-SMA的表達(dá)與牽引力的變化呈現(xiàn)一致性，印證了Chen的研究結(jié)果[3]。綜合α-SMA、微絲的染色結(jié)果與牽引力的分析圖來看，細(xì)胞癌變后，α-SMA的表達(dá)量的變化影響了FAs(focal adhesions)的成熟進(jìn)程[15]，微絲在貼附面無明顯回落點也支持此結(jié)論，然而胞內(nèi)產(chǎn)生牽引力需借由FAs才能傳遞至胞外基質(zhì)，這就解釋了牽引力分析結(jié)果中著力點數(shù)量、分布面積都明顯減少的現(xiàn)象。在正常細(xì)胞內(nèi)，牽引力借由完善的微絲系統(tǒng)，將牽引力通過微絲均勻分布，形成穩(wěn)定的張力平衡，并通過FAs與基質(zhì)面結(jié)合，這對于細(xì)胞自身結(jié)構(gòu)的維持，以及細(xì)胞在組織內(nèi)空間位置的固定都是有利的；相比之下，腫瘤細(xì)胞內(nèi)微絲加粗，呈扭曲狀，說明微絲處于包含能量的狀態(tài)，微絲的這種變化使細(xì)胞處于不穩(wěn)定狀態(tài)，加之牽引力分布的不均衡，使細(xì)胞趨向于運(yùn)動。綜合以上我們認(rèn)為，細(xì)胞癌變過程中，α-SMA表達(dá)的下調(diào)造成了FAs、細(xì)胞牽引力以及細(xì)胞微絲的變化，最終影響了細(xì)胞的穩(wěn)定性，使細(xì)胞趨向于運(yùn)動，這也許是腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移行為發(fā)生的基礎(chǔ)條件之一。

目前在人與小鼠之間，對于細(xì)胞癌變過程中牽引力變化趨勢的研究得出了相對立的結(jié)果。在以人的組織細(xì)胞為樣本的研究中，牽引力隨著細(xì)胞癌變的發(fā)生，表現(xiàn)出牽引力增大的趨勢[7]；而在以小鼠組織細(xì)胞為樣本的研究中，牽引力則隨著癌癥的發(fā)展表現(xiàn)出減小的傾向[9]。在人與小鼠之間，α-SMA的表達(dá)量的變化與牽引力的變化表現(xiàn)出了一致性[1-2],由此可以推測α-SMA的調(diào)節(jié)機(jī)制不同是導(dǎo)致人與小鼠細(xì)胞癌變過程中牽引力變化趨勢的不同的原因之一。

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