王心童，王虹蛟，王 強(qiáng)，孟威宏，顏煒群，任立群

（1.吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，吉林 長春 130033；2.解放軍第461醫(yī)院內(nèi)科，吉林 長春 130021；3.沈陽軍區(qū)總醫(yī)院心血管內(nèi)科，遼寧 沈陽 110015；4.吉林大學(xué)再生醫(yī)學(xué)科學(xué)研究所再生醫(yī)學(xué)系，吉林 長春 130021）

牛胰蛋白酶抑制劑（bovine pancreatic trypsin inhibitor，BPTI）是Kunitz家族的絲氨酸蛋白酶抑制劑，已用于急、慢性肝損傷的研究［1－6］。但BPTI是1種從牛肺中提純的堿性蛋白酶抑制劑，為異體蛋白，具有抗原性，長期反復(fù)應(yīng)用能夠產(chǎn)生特異性抗體，引起機(jī)體免疫反應(yīng)。KD／APP是人Kunitz型蛋白酶抑制劑（Kunitz protease inhibitor，KPI），具有抑制絲氨酸蛋白酶的活性，是較為理想的BPTI替代品。雖然KD／APP與BPTI在結(jié)構(gòu)、生物活性等方面有很多相似之處，但由于KD／APP活性中心的氨基酸殘基是Arg15－Ala16－Met17（RAM），BPTI是Lys15－Ala16－Arg17（KAR），兩者在酶的專一性、親和常數(shù)和抑制酶譜等方面存在較大的差異。本研究利用KD／APP為基本骨架，用BPTI活性中心氨基酸殘基KAR替代KD／APP活性中心的RAM，構(gòu)建新的重組KD／APP變異體（rhKD／APPvar），并構(gòu)建rhKD／APPvar真核表達(dá)質(zhì)粒，實(shí)現(xiàn)其在畢赤酵母中的分泌表達(dá)，建立大規(guī)模發(fā)酵、純化rhKD／APPvar的工藝，為篩選具有與BPTI在生物活性（抑制酶譜）和藥效學(xué)類似的新的抑制劑提供物質(zhì)基礎(chǔ)。目前國內(nèi)外尚未見相關(guān)報(bào)道。

1 材料與方法

1.1 菌株和主要試劑 表達(dá)質(zhì)粒pPICZα和酵母菌株X－33購自美國Invitrogen公司；感受態(tài)菌XL1－Blue購自北京鼎國生物公司；LA Taq酶、T質(zhì)粒、限制性內(nèi)切酶和T4DNA連接酶購自日本Takara公司；感受態(tài)菌XL1－Blue和DNA快速純化／回收試劑盒購自北京鼎國生物公司；質(zhì)粒提取試劑盒購自美國Promega公司；SP Sepharose XL陽離子交換樹脂購自瑞典Pharmacia公司；rhKD／APP－pPICZα重組質(zhì)粒由吉林大學(xué)再生醫(yī)學(xué)科學(xué)研究所提供。

1.2 構(gòu)建rhKD／APPvar－pPICZα表達(dá)質(zhì)粒 利用已構(gòu)建好的rhKD／APP－pPICZα表達(dá)質(zhì)粒，在KD／APP活性中心兩側(cè)設(shè)計(jì)2個(gè)酶切位點(diǎn)（ApaⅠ和SacⅡ），將KD／APP的活性中心RAM替換成BPTI的活性中心KAR。①在KD／APP活性中心5′端引入ApaⅠ位點(diǎn)：根據(jù)在KD／APP序列，設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增5′端引入ApaⅠ限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)。上游引物：5′－GGTCTGCAGTGAACAAGC－CGAGACTGGGCCCTG－3′（下劃線部分為酶切位點(diǎn)）；下游引物：5′－GAAGTCTAGATTAAATGGCGCTGCCACACA－3′。以KD／APP－pPICZα重組質(zhì)粒為模板，行PCR反應(yīng)，PCR反應(yīng)程序：94℃變性4min；94℃變性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min，共30個(gè)循環(huán)；72℃再延伸5min?；厥誔CR產(chǎn)物約200bp片段，經(jīng)PstⅠ和XbalⅠ雙酶切后，連接經(jīng)PstⅠ和XbalⅠ雙酶切的pPICZ質(zhì)粒。②在KD／APP活性中心3′端引入SacⅡ位點(diǎn)：上游引物，5′－ATGGGGCCCTG－TAGAGCAATGATCCCGCGGTGG－3′（下劃線部分為酶切位點(diǎn)）；下游引物，5′－GAAGTCTAGATTAAATGGCGCTGCCACACA－3′。以①中獲得的重組質(zhì)粒為模板，PCR反應(yīng)程序：94℃變性4min；94℃變性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min，30個(gè)循環(huán)；72℃再延伸5min?；厥誔CR產(chǎn)物200bp片段，經(jīng)PstⅠ和XbalⅠ雙酶切后，連接同樣經(jīng)PstⅠ和XbalⅠ雙酶切的pPICZ質(zhì)粒，構(gòu)建重組質(zhì)粒Kas。用SacⅠ和SacⅡ雙酶切鑒定，經(jīng)酶切鑒定正確的重組質(zhì)粒Kas經(jīng)ApaⅠ和SacⅡ雙酶切，去除KD／APP活性中心的RAM。③活性中心的替換：合成編碼BPTI活性中心KAR的短鏈DNA，序列為5′－CTGTAAAGCTAGAATCTCGC－3′和5′－GAGATTCTAGCTTTACAGGGCC－3′。引物退火后獲得的黏性末端與ApaⅠ和SacⅡ雙酶切后的黏性末端連接。利用此特性將重組質(zhì)粒Kas中的活性中心RAM與BPTI活性中心KAR的DNA進(jìn)行替換，獲得rhKD／APPvar－pPICZα重組表達(dá)質(zhì)粒。經(jīng)酶切鑒定正確的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)XL1－Blue，大量擴(kuò)增，并用質(zhì)?？焖偬崛≡噭┖刑崛≠|(zhì)粒用于酶切鑒定及核酸序列分析。

1.3 rhKD／APPvar－pPICZαz轉(zhuǎn)化畢氏酵母 將20μg rhKD／APPvar－pPICZα質(zhì)粒用SacⅠ酶切，酚氯仿抽提，用10μL無菌水溶解。與80μL新鮮制備的X33感受態(tài)混勻，加入0.2cm電轉(zhuǎn)杯，冰浴5min，以Bio－Rad Gene Pulser電轉(zhuǎn)儀于1500V、25μF、200Ω條件下轉(zhuǎn)化，同時(shí)加入1.0mL山梨醇，將菌液涂布于YPD（含100mg·L－1的Zeocin）的選擇培養(yǎng)板上，30℃培養(yǎng)2～3d，篩選具有Zeocin抗性的生長良好的表達(dá)菌株。

1.4 酵母工程菌的誘導(dǎo)表達(dá) 取上述鑒定結(jié)果陽性的克隆接種于10mL BMGY（pH 6.0）培養(yǎng)基中，30℃震蕩培養(yǎng)24h，至吸光度（A600）值達(dá)2.0～6.0收集細(xì)胞。等體積（10mL）BMMY（pH 6.0）重懸細(xì)胞沉淀，30℃震蕩培養(yǎng)，誘導(dǎo)表達(dá)。在誘導(dǎo)過程中，每24h補(bǔ)充一次甲醇至終濃度為0.5%，同時(shí)補(bǔ)充滅菌超純水，使發(fā)酵液總體積保持不變。在培養(yǎng)0、24、48、72、96和120h等時(shí)間點(diǎn)各取0.5mL發(fā)酵液，離心取上清用于聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS－PAGE）分析。

1.5 畢赤酵母表達(dá)rhKD／APPvar最佳pH值的確定 將生長培養(yǎng)基的菌體等量接入pH值分別為3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5和6.0的誘導(dǎo)培養(yǎng)基內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng)。在培養(yǎng)0、24、48、72、96和120h等時(shí)間點(diǎn)各取0.5mL發(fā)酵液，離心取上清用于SDS－PAGE分析。

1.6 rhKD／APP的純化 將rhKD／APPvar發(fā)酵液離心，取上清，用3倍體積水稀釋并加入1／10體積的200mmol·L－1醋酸鹽緩沖液（pH 4.0），用HCl調(diào)節(jié)其pH值為3.5。用10倍柱體積20mmol·L－1醋酸鹽緩沖液（pH3.5）平衡SP Sepharose FF陽離子樹脂。加樣品rhKD／APPvar于平衡好的SP Sepharose FF陽離子樹脂柱，用波長280nm監(jiān)測。待穿透液有目的蛋白出現(xiàn)時(shí)，停止加樣，用20mmol·L－1醋酸鹽緩沖液沖洗樹脂至A280值降至基線。用含1mol·L－1NaCl的20mmol·L－1醋酸鹽緩沖液洗脫，并分步收集蛋白峰。用超濾純化裝置濃縮純化后的rhKD／APPvar，并用水倍比稀釋3～5次以除鹽。應(yīng)用SDS－PAGE分析確定純化后蛋白的純度和濃度，Bradford法精確定量。

2 結(jié) 果

2.1 重組質(zhì)粒Kas的鑒定 利用已構(gòu)建好的rhKD／APP－pPICZα表達(dá)質(zhì)粒，在KD／APP活性中心兩側(cè)通過PCR引入2個(gè)酶切位點(diǎn)（ApaⅠ和SacⅡ），連接pPICZ質(zhì)粒后，小提質(zhì)粒進(jìn)行酶切鑒定。用SacⅠ和SacⅡ雙酶切重組質(zhì)粒結(jié)果：重組質(zhì)粒成功切下1000bp的片段，而對照組質(zhì)粒未見此片段，證明2個(gè)酶切位點(diǎn)（ApaⅠ和SacⅡ）成功引入KD／APP活性中心兩側(cè)，且PCR獲得的目的片段成功插入pPICZ質(zhì)粒，構(gòu)建了重組質(zhì)粒Kas。見圖1。

圖1 SacⅠ和SacⅡ雙酶切質(zhì)粒產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳圖Fig.1 Agarose gel electrophoregram of plasmid digested by SacⅠ和SacⅡ

2.2 活性中心替換的鑒定 合成編碼BPTI活性中心KAR的短鏈DNA，退火后獲得的黏性末端可與ApaⅠ和SacⅡ雙酶切后的黏性末端連接。利用此特性將重組質(zhì)粒Kas與BPTI活性中心KAR的DNA序列連接，獲得rhKD／APPvar－pPICZα表達(dá)質(zhì)粒。連接BPTI活性中心KAR后，SacⅡ位點(diǎn)消失，可以作為鑒定依據(jù)。經(jīng)SacⅠ和SacⅡ雙酶切，活性中心替換成功的KD／APPvar－pPICZα重組表達(dá)質(zhì)粒無1000bp片段（圖2）。

圖2 活性中心替換鑒定的瓊脂糖凝膠電泳圖譜Fig.2 Agarose gel electrophoregram of substitute identification of active site

2.3 rhKD／APPvar－pPICZαz重組質(zhì)粒測序rhKD／APPvar－pPICZαz重組質(zhì)粒測序結(jié)果顯示DNA序列與預(yù)期相符。見圖3。

圖3 替換后質(zhì)粒DNA測序圖譜Fig.3 Sequencing diagram of vector DNA after substituting

2.4 rhKD／APPvar蛋白表達(dá) 最適表達(dá)時(shí)間的優(yōu)化：SDS－PAGE結(jié)果：甲醇誘導(dǎo)表達(dá)后在相對分子質(zhì)量約6700處出現(xiàn)蛋白條帶，誘導(dǎo)表達(dá)24h有蛋白分泌，隨著誘導(dǎo)時(shí)間的延長其表達(dá)水平升高，120h即達(dá)到高峰。發(fā)酵液上清rhKD／APPvar表達(dá)水平可達(dá)285mg·L－1。見圖4。畢赤酵母表達(dá)rhKD／APPvar的最佳pH值：畢赤酵母在pH 2.5～6.0培養(yǎng)基均能很好地生長，本實(shí)驗(yàn)在pH 6.0時(shí)發(fā)酵外源蛋白表達(dá)水平最高。見圖5。

圖4 rhKD／APPvar經(jīng)時(shí)變化的SDS－PAGE圖譜（考馬斯亮藍(lán)染色）Fig.4 SDS－PAGE graph of ongoing changes of rhKD／APPvar（Coomassie blue staining）

2.5 rhKD／APPvar的純化 rhKD／APPvar發(fā)酵液離心取上清，經(jīng)Sepharose SP FF陽離子交換層析，得到1個(gè)活性洗脫主峰，除鹽濃縮后rhKD／APPvar在15%SDS－PAGE中顯示1條考馬斯亮藍(lán)區(qū)帶。純化后純度可達(dá)95%以上。見圖6。

3 討 論

圖5 rhKD／APPvar SDS－PAGE圖譜（考馬斯亮藍(lán)染色）Fig.5 SDS－PAGE graph of rhKD／APPvar（Coomassie blue staining）

圖6 大規(guī)模純化rhHKD／APPvar的SDS－PAGE圖譜（考馬斯亮藍(lán)染色）Fig.6 SDS－PAGE graph of rhKD／APPvar with large－scale purification（Coomassie blue staining）

蛋白酶抑制劑在機(jī)體中參與凝血、纖溶、細(xì)胞遷移、細(xì)胞分化、凋亡和炎癥反應(yīng)等，在臨床上主要應(yīng)用于細(xì)胞凋亡、凝血、骨質(zhì)疏松和腫瘤等疾病治療［7］。目前絲氨酸蛋白酶抑制劑是研究最多、最為清楚的一類抑制劑，其中Kunitz家族的牛胰蛋白酶抑制劑（BPTI）的結(jié)構(gòu)、功能及藥理學(xué)方面的研究比較深入，已廣泛應(yīng)用于臨床。BPTI是一種廣譜的絲氨酸蛋白酶抑制劑，其相對分子質(zhì)量為6500，是由58個(gè)氨基酸殘基組成的堿性蛋白，分別在Cys14－Cys38、Cys5－Cys55和Cys30－Cys51連接半胱氨酸形成3對二硫鍵。其中1對二硫鍵（Cys14－Cys38）位于分子表面，其使2段肽鏈（32～42，9～21）連接在一起，這1對二硫鍵被還原和重新氧化后不影響抑制劑活力。另外2對二硫鍵（Cys5－Cys55，Cys30－Cys51）位于分子內(nèi)部，還原后抑制劑失活。Kunitz家族蛋白酶抑制劑分子空間構(gòu)相高度保守，有許多共同特征，BPTI整個(gè)分子呈梨型，由2條反平行的β－折疊、2段α－螺旋、β－轉(zhuǎn)角和一些環(huán)組成，其最主要的結(jié)構(gòu)特征是含有2片180度扭曲的反平行β－折疊，這個(gè)折疊分別和β轉(zhuǎn)角與1對二硫鍵（Cys14－Cys38）相連。這個(gè)分子的主要片段1～14和38～58殘基沿著β－折疊來回彎曲折疊，以使末端殘基1和殘基58能夠在β轉(zhuǎn)角處相互靠近，二硫鍵的共價(jià)連接也使這兩端靠攏并和β轉(zhuǎn)角（30～51殘基組成）靠近。N端的殘基形成了一個(gè)短的螺旋段，C端形成了1個(gè)更長的、有規(guī)律的α螺旋（48～56殘基）。分子的自然折疊和半胱氨酸以獨(dú)特的方式共價(jià)連接使整個(gè)分子變得緊湊、穩(wěn)定［8］。自Kunitz［9］發(fā)現(xiàn)BPTI可以抑制激肽酶和胰蛋白酶以來，許多科研工作者就致力于BPTI的研究。1993年12月美國食品藥品監(jiān)督管理局（FDA）批準(zhǔn)將BPTI應(yīng)用于臨床心肺胸外科手術(shù)中［10］，用于減少出血和滲血以及有凝血障礙可能出現(xiàn)大出血情況的患者治療中。目前國產(chǎn)的BPTI制品主要是從牛肺中提取，BPTI作為異源蛋白具有免疫原性，大量使用可出現(xiàn)過敏反應(yīng)等不良臨床反應(yīng)。每千克的牛肺組織中僅可提取1mg的BPTI，且提取工藝復(fù)雜［11］、產(chǎn)量低、產(chǎn)品的純度不高。

本實(shí)驗(yàn)選用了甲基營養(yǎng)型酵母——畢赤巴斯德酵母（Pichia.pastoris）。畢赤酵母系統(tǒng)的廣泛應(yīng)用，除該系統(tǒng)具有一般酵母所具有的特點(diǎn)外，還具有以下幾個(gè)優(yōu)點(diǎn)［12－14］：①具有醇氧化酶AOX1基因啟動(dòng)子，該啟動(dòng)因子是目前調(diào)控機(jī)制最嚴(yán)格的啟動(dòng)子之一；②表達(dá)質(zhì)粒能在基因組的特定位點(diǎn)以單拷貝或多拷貝的形式穩(wěn)定整合；③菌株易于進(jìn)行高密度發(fā)酵，外源蛋白表達(dá)量高；④畢赤酵母中存在過氧化物酶體，表達(dá)的蛋白貯存其中，可免受蛋白酶的降解，而且減少對細(xì)胞的毒害作用。經(jīng)近十年發(fā)展畢赤巴斯德酵母基因表達(dá)系統(tǒng)已成為較完善的外源基因表達(dá)系統(tǒng)，具有易于高密度發(fā)酵、表達(dá)基因穩(wěn)定整合在宿主基因組中、能使產(chǎn)物有效分泌并適當(dāng)糖基化和培養(yǎng)方便經(jīng)濟(jì)等特點(diǎn)。畢赤巴斯德酵母表達(dá)系統(tǒng)在生物工程領(lǐng)域?qū)l(fā)揮越來越重要的作用，促進(jìn)更多外源基因在該系統(tǒng)的高效表達(dá)，提供更為廣泛的基因工程產(chǎn)品［15］。

本實(shí)驗(yàn)采用pPICZα質(zhì)粒構(gòu)建KD／APPvar的分泌型表達(dá)質(zhì)粒，電轉(zhuǎn)化畢赤酵母X－33菌種，構(gòu)建了高效分泌表達(dá)rhKD／APPvar的工程菌，并對畢赤酵母大規(guī)模表達(dá)rhKD／APPvar的發(fā)酵條件進(jìn)行了優(yōu)化。純化過程中，采用pH 3.5條件下進(jìn)行陽離子交換層析可很好地避免核酸和內(nèi)毒素的污染，且得到純度較高的rhKD／APPvar，除鹽濃縮后，可直接用于生物活性的鑒定和藥效學(xué)實(shí)驗(yàn)，該純化方法簡單、成本低，適合于大規(guī)模純化。

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