徐 濱，朱祥云，魏開金，馬寶珊

(中國水產(chǎn)科學(xué)研究院 長江水產(chǎn)研究所；農(nóng)業(yè)部淡水生物多樣性保護(hù)重點(diǎn)實(shí)驗室，湖北 武漢 430223)

巖原鯉，地方名巖鯉巴、巖鯉、黑鯉。20世紀(jì)30年代張春霖對巖原鯉進(jìn)行了形態(tài)學(xué)研究，將其命名為Procyprisrabaudi(Tchang)，其后林書顏建立了原鯉屬[1]，將其歸于鯉形目、鯉科、鯉亞科、原鯉屬，是一種棲居于長江流域江河巖石縫間的底層魚，在宜昌以上長江水系的干支流及金沙江中上游的江河中多有分布，目前主要分布于四川境內(nèi)的江河中，尤其是嘉陵江和岷江。巖原鯉魚肉質(zhì)肥嫩味道鮮美，肌間刺少，是上等的食用魚類，深受消費(fèi)者所喜愛。由于人們在長江水系中的過度捕撈(尤其是用電網(wǎng)捕撈), 加之長江三峽水利樞紐的興建，長江上游水位大幅度上升，對巖原鯉的生存環(huán)境產(chǎn)生了很大影響，其野生資源日益枯竭。在長江上游的干流以及支流的沱江、嘉陵江、岷江、赤水河等江河中，巖原鯉現(xiàn)存數(shù)量極少，已瀕于滅絕[2]。巖原鯉人工飼養(yǎng)還未形成規(guī)模，其主要原因是人工繁殖的苗種極為有限，有些地方供給飼養(yǎng)單位的苗種不純，許多是利用巖原鯉的雄魚與其他鯉魚雜交的后代作為巖原鯉飼養(yǎng)。因此，保護(hù)巖原鯉這一優(yōu)質(zhì)魚類資源及開展其人工繁殖、飼養(yǎng)和餌料研究工作已迫在眉睫。

染色體是遺傳物質(zhì)的主要載體，染色體的數(shù)目和結(jié)構(gòu)決定了物種的特征，染色體核型可以反映物種的分化親緣關(guān)系、演化途徑和進(jìn)化歷史[3]。生物的歷史記載在染色體上[4]，分析魚類的染色體核型對于研究魚類的遺傳變異、分類地位、系統(tǒng)演化、性別決定和雜交育種均具有重要意義。為此，本研究利用體內(nèi)注射植物血球凝集素(PHA)的腎細(xì)胞體內(nèi)培養(yǎng)法，對巖原鯉染色體核型進(jìn)行了研究，旨在了解其細(xì)胞生物學(xué)特征，從而為巖原鯉的遺傳育種工作提供基礎(chǔ)資料。

1 材料與方法

1.1 材 料

試驗用巖原鯉于2012-10取自重慶市萬州市水產(chǎn)研究所養(yǎng)殖基地，共50尾，體長為(28.01±1.47) cm，體質(zhì)量為(516±81) g/尾。試驗前暫養(yǎng)于長江水產(chǎn)研究所循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)內(nèi)，飼養(yǎng)用水為經(jīng)顆?；钚蕴康确椒ㄟ^濾曝氣的自來水，水中溶氧(7.0±0.3) mg/L，水溫(21±1) ℃，pH 7.5±0.1。

1.2 方 法

1.2.1 PHA和秋水仙素注射 參考國標(biāo)GB/T 18654.12-2008[5]的方法進(jìn)行試驗。具體操作如下：按照廠家推薦劑量用質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.7%生理鹽水配制植物血球凝集素(PHA)，向巖原鯉腹腔注射PHA溶液，飼養(yǎng)12 h后，在同一部位腹腔注射秋水仙素溶液，劑量1.5 μg/g。注射時以30°傾斜刺入腹腔，不要插入過深，以免插到內(nèi)臟造成試驗魚死亡。

1.2.2 細(xì)胞懸液的制備 注射秋水仙素4 h后，剪斷鰓血管，放血后取出頭腎，放入盛有3 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.7%生理鹽水的小燒杯中，剪碎后吸出細(xì)胞懸液，1 000 r/min離心5 min收集腎細(xì)胞，加入0.075 mol/L KCl溶液37 ℃水浴低滲20 min，1 000 r/min 離心5 min后加入新制備的卡諾氏固定液(V(甲醇)∶V(冰醋酸)=3∶1)室溫固定20 min，重復(fù)固定3次，然后1 000 r/min離心5 min，取細(xì)胞沉淀，加入適量現(xiàn)配固定液，將細(xì)胞吹打均勻。

1.2.3 滴 片 用吸管吸取細(xì)胞懸液，在約45°傾斜的冰凍玻片上滴2～3滴，靜置干燥，用質(zhì)量分?jǐn)?shù)10% Giemsa染液(pH=6.8的磷酸緩沖液配制)染色20 min，在室溫下自然干燥后，置于顯微鏡下觀察拍照。

1.3 核型分析

將染色體玻片置于顯微鏡下觀察，選取50個染色體中期分裂相進(jìn)行染色體計數(shù)。并選取10個清晰的中期分裂相進(jìn)行顯微拍照、放大和測量。染色體類型按照Levan等[6]的標(biāo)準(zhǔn)確定，即按臂比將染色體分為4 組:(1)中部著絲點(diǎn)染色體為m 組，臂比為≥1.00～≤1.70；(2)亞中部著絲點(diǎn)染色體為sm 組，臂比為>1.70～≤3.00;(3)亞端部著絲點(diǎn)染色體為st 組，臂比為>3.00～≤7.00；(4) 端部著絲點(diǎn)染色體為t 組，臂比>7.00。 m 和sm 染色體臂數(shù)為2，st 和t 染色體臂數(shù)為1。臂比=長臂/短臂，染色體相對長度=(每條染色體長度/單倍體組染色體總長度)×100。數(shù)據(jù)用Excel軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析，結(jié)果采用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(Mean±SD)”表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 巖原鯉染色體數(shù)目的確定

在顯微鏡下對巖原鯉分散良好的50個染色體中期分裂相進(jìn)行計數(shù)。結(jié)果顯示，巖原鯉的染色體眾數(shù)為100，占分裂相總數(shù)的78%(表1)。非眾數(shù)部分的染色體數(shù)目可能是由于制片過程中染色體丟失或細(xì)胞重疊所致。通過核型分析可知巖原鯉染色體數(shù)為2n=100。

表1 巖原鯉染色體數(shù)目出現(xiàn)頻率

2.2 巖原鯉的染色體組型

巖原鯉各染色體的類型、相對長度、臂比見表2。結(jié)果顯示，巖原鯉具有50對染色體，其中11對為中部著絲點(diǎn)染色體(m)、13對為亞中部著絲點(diǎn)染色體(sm)、11對為亞端部著絲點(diǎn)染色體(st)、15對為端部著絲點(diǎn)染色體(t)。組型公式為：2n=22m+26sm+22st+30t。臂數(shù)(NF)：148。巖原鯉的中期分裂相和核型圖譜見圖1。

表2 巖原鯉染色體核型分析數(shù)據(jù)

圖1 巖原鯉中期染色體分裂相及其核型

2.3 巖原鯉與鯉科魚類的核型比較

由表3可知，巖原鯉與鯉亞科其他魚類和鲃亞科部分魚類的染色體核型2n數(shù)相同，均為100，但是核型公式和染色體臂數(shù)略有差異，可能是進(jìn)化過程中該亞科魚類染色體重排所致。因為只有通過染色體重排這種方式，才不會導(dǎo)致染色體數(shù)目的改變，而只引起其臂數(shù)的變化。

3 討 論

3.1 巖原鯉在進(jìn)化中的地位

研究發(fā)現(xiàn)，鯉科魚類中2n=100左右的魚有38種或亞種，包括鯉亞科20種或亞種，鲃亞科15種或亞種，魚句亞科1種，裂腹魚亞科2種[8]。鲃亞科和鯉亞科具有很近的親緣關(guān)系，關(guān)于二者的親緣關(guān)系問題，歷來是魚類學(xué)家極感興趣和廣泛爭議的問題。Nichols[11]、Zhu[12]和Smith[13]曾將鯉亞科和鲃亞科合并為一個亞科；Rendahl[14]、Lin[15]、Fang[16]、張春霖[17]、伍獻(xiàn)文[18]和王幼槐[19]則主張將其分開。一般認(rèn)為，巖原鯉屬鯉亞科原鯉屬，刁曉明等[20]對巖原鯉腦顱的研究發(fā)現(xiàn)，在系統(tǒng)發(fā)育中巖原鯉與鯉的親緣關(guān)系較近,而與同屬的烏原鯉關(guān)系較遠(yuǎn)；劉思陽等[21]采用RAPD標(biāo)記技術(shù)對巖原鯉與鯉亞科、鲃亞科的若干種類進(jìn)行遺傳比較分析，發(fā)現(xiàn)巖原鯉的遺傳特性更偏向于鲃亞科而不是鯉亞科。

表3 鯉亞科和鲃亞科染色體核型的比較

從目前的化石記錄看，鲃亞科和鯉亞科均是較古老的魚，鯉亞科魚類出現(xiàn)于中新世，鲃亞科魚類出現(xiàn)于始新世，后者較前者更早[8]。有關(guān)這2個亞科劃分的主要特征和其中某些種類的歸屬一直存在爭議，作為有一定性狀交叉的親緣關(guān)系較近的物種之間的分類，要重新討論巖原鯉的歸屬，尚需更多細(xì)致的工作和證據(jù)。

3.2 巖原鯉的核型

鯉科魚類基本的染色體二倍數(shù)是50或者48，這已為魚類核型研究學(xué)者所公認(rèn)[21-22]。Arai[23]在總結(jié)分析歐亞大陸已進(jìn)行過核型分析的141種鯉科魚類的基礎(chǔ)上，認(rèn)為2n=50是鯉科魚類最原始的核型，并由2n=50朝幾個方向演化，即：(1)通過非整倍性增加或著絲粒斷裂，由2n=50變?yōu)?n=52；(2)通過著絲粒斷裂，由2n=50或48變?yōu)?n=78；(3)通過多倍化增加，由2n=50變?yōu)?n=100或98；(4)通過羅伯遜易位，由2n=50變?yōu)?n=48，由2n=48變?yōu)?n=44；(5)通過缺失或減少，由2n=48變?yōu)?n=46。巖原鯉和其他2n=100左右的鯉科魚類一樣，都應(yīng)該是四倍體物種，雖然這些魚類的染色體數(shù)和臂數(shù)以及核中的DNA含量和某些同工酶的表達(dá)量是一般二倍體魚類的2倍，但又有一定的差異。因此認(rèn)為，現(xiàn)存的多倍體魚類可能是多倍化后再經(jīng)歷了二倍化過程演變而來的，是二倍化了的多倍體[24]。

3.3 巖原鯉核型特征與選育

著名魚類學(xué)家Николъский[25]認(rèn)為，具有四倍體核型的物種，可表現(xiàn)出較強(qiáng)的適應(yīng)性和較大的變異能力。我國學(xué)者李樹深等[26]贊成這一觀點(diǎn)，認(rèn)為云南湖泊中鯉類分化強(qiáng)烈就是因為其具有四倍體核型，通過基因重組或突變以及生殖隔離機(jī)制而產(chǎn)生變異。因此，對巖原鯉和其他鯉科魚類之間進(jìn)行雜交，將有可能獲得可育的具有雜交優(yōu)勢的后代。

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