辛 穎,張 濤,2,張優(yōu)優(yōu),張智英

(1 西北農(nóng)林科技大學(xué) 動物科技學(xué)院，陜西 楊凌 712100；2 陜西理工學(xué)院 生物科學(xué)與工程學(xué)院，陜西 漢中 723001)

自1980年第一只轉(zhuǎn)基因小鼠[1]問世以來，科學(xué)家們便能夠在體內(nèi)選擇性地修飾一個基因，來進行復(fù)雜的基因組精確操作，這對基礎(chǔ)遺傳學(xué)和應(yīng)用遺傳學(xué)來說是一個意義重大的跨越。轉(zhuǎn)基因動物生產(chǎn)技術(shù)經(jīng)過20多年發(fā)展，極大地促進了基礎(chǔ)生命科學(xué)、醫(yī)學(xué)及動物育種的快速發(fā)展。傳統(tǒng)的轉(zhuǎn)基因動物生產(chǎn)技術(shù)是把外源基因注射到一個單細胞的胚胎，然后將胚胎移植到假孕的母體，但由于實驗花費昂貴，費力費時，并且需要數(shù)個雌性供體，這嚴重限制了轉(zhuǎn)基因動物的發(fā)展。近年來，有報道通過慢病毒感染體外分離的小鼠精原干細胞，再篩選感染成功的精原干細胞，將其注射到經(jīng)過處理的不育小鼠睪丸內(nèi)，以此生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因動物，此項技術(shù)不涉及體外顯微操作和胚胎移植，發(fā)展非常迅速。

慢病毒屬于逆轉(zhuǎn)錄病毒科，不但可以感染分裂期細胞，還能感染靜止期細胞，并且能把攜帶的外源基因整合到宿主基因組內(nèi)進行長期、穩(wěn)定、高效表達，不易誘發(fā)宿主免疫反應(yīng)，安全性較好[2-3]。目前，廣泛應(yīng)用的慢病毒載體系統(tǒng)多是以HIV-1為基本骨架的3載體系統(tǒng)，該系統(tǒng)刪除了致病基因和長末端重復(fù)序列(Long terminal repeat，LTR)上的U3，造成慢病毒大部分基因轉(zhuǎn)錄失活，基因組復(fù)制受到限制，從而使其安全性顯著提高[4-5]。精原干細胞(Spermatogonial stem cells，SSCs)是睪丸內(nèi)能夠自我更新，具有生精能力并能將遺傳信息傳遞給子代的一類細胞，是對生殖細胞系進行修飾的適當靶點。對精原干細胞進行的基因修飾是可遺傳的，通過受精即可傳遞給后代，獲得整合位點不同的轉(zhuǎn)基因動物[6-7]。慢病毒感染精原干細胞生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因動物的方法主要是用慢病毒感染體外培養(yǎng)的精原干細胞，然后將精原干細胞移植到受體動物睪丸內(nèi)，使受體能夠產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因精子，進而通過各種途徑獲得轉(zhuǎn)基因后代[8]。Hamra等[9]用攜帶綠色熒光蛋白(EGFP)基因的慢病毒載體感染大鼠精原干細胞，在其后代中有30%攜帶有外源基因。但是由于對不同物種的精原干細胞自身增殖和分化的機制還不清楚，精原干細胞的分離純化、長期培養(yǎng)和移植等技術(shù)也不成熟，不能在很多實驗室進行，這嚴重限制了該技術(shù)的廣泛推廣。

本研究把攜帶有EGFP基因的慢病毒注射到小鼠睪丸曲細精管中，通過慢病毒感染睪丸未分化的精原細胞，在活體上把EGFP基因轉(zhuǎn)移到小鼠精原干細胞中，然后進行自然交配，獲得攜帶有EGFP的轉(zhuǎn)基因后代，以建立一個操作簡單、花費少且高效的慢病毒介導(dǎo)的在活體上修飾精原干細胞生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因動物的技術(shù)平臺。

1 材料與方法

1.1 試驗動物

試驗動物為雄性昆明小白鼠，購自第四軍醫(yī)大學(xué)實驗動物中心，實驗室長期飼養(yǎng)繁殖。

1.2 試劑與設(shè)備

慢病毒載體系統(tǒng)由pLL3.7載體、pSPAX2載體和pMD2.G載體3質(zhì)粒組成，由西北農(nóng)林科技大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院華進聯(lián)教授惠贈。質(zhì)粒抽提試劑盒購自AXYGEN 生物技術(shù)有限公司，明膠、青霉素、鏈霉素、TritonX-100 等購自Sigma公司；大腸桿菌JM109、DH5α感受態(tài)菌種和293T細胞均為西北農(nóng)林科技大學(xué)動物基因組學(xué)實驗室保存；Lipofectamine 2000、DMEM-高糖培養(yǎng)基和胰蛋白酶購自Invitrogen公司，優(yōu)級胎牛血清購自Hyclone；TaqDNA 聚合酶、DNA Marker購自北京全式金生物科技有限公司。PCR引物由上海博尚生物技術(shù)有限分司合成。GFP抗體購自碧云天生物科技有限公司，PLZF一抗選用羊源PLZF抗體，購自美國SANTA，PLZF二抗為Alexa Fluor?488 Donkey Anti-Goat IgG (H+L) Antibody，購自Life technology公司。

1.3 慢病毒的制備

將293T細胞于轉(zhuǎn)染前24 h以105mL-1的密度接種于10 cm 細胞培養(yǎng)皿中，37 ℃、體積分數(shù)5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，待細胞融合度達70%～80%時用于轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染前2 h，將293T細胞培養(yǎng)基更換為無血清培養(yǎng)基。取pLL3.7 載體10 μg、pSPAX2 載體7.5 μg，pMD2.G 載體4.5 μg，加入Opti-MEM 溶液，使得混合溶液的總體積為1 mL，將混合溶液在室溫下溫育5 min。取40 μL Lipofectamine 2000試劑在另一管中與0.9 mL Opti-MEM 混合，在室溫下溫育5 min。把稀釋的混合載體與稀釋的Lipofectamine 2000混合，輕輕顛倒混勻，在室溫下溫育20 min后移至293T細胞培養(yǎng)液中，于37 ℃、體積分數(shù)5% CO2細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)， 8 h后倒掉含轉(zhuǎn)染混和物的培養(yǎng)基，用PBS液清洗，每瓶細胞中加入含體積分數(shù)10%胎牛血清的培養(yǎng)基8 mL，于37 ℃、體積分數(shù)5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)。為減少慢病毒包裝過程中需通過超速、長時間離心濃縮才能獲得高滴度病毒的繁瑣過程，在轉(zhuǎn)染20 h時棄掉培養(yǎng)液，消化下293T細胞，50g離心5 min，沉淀用少量PBS溶液重懸，在液氮和37 ℃水浴鍋中反復(fù)凍融3 次以裂解細胞釋放病毒，試驗中應(yīng)盡可能減少PBS裂解液的體積，以獲得高滴度的慢病毒。采用孔稀釋法測定慢病毒滴度。

1.4 慢病毒的注射和轉(zhuǎn)基因鼠產(chǎn)生

取出生21 d的雄性小鼠，腹膜內(nèi)注射速眠新(0.019 mL/g) 麻醉后剃除小鼠腹股溝部毛發(fā)，將外科手術(shù)部位用酒精清洗干凈。于小鼠陰莖前，用滅菌外科剪刀在無菌條件下于腹正中線剪開長度大約為1～1.5 cm的皮膚切口，鈍性分開肌肉和腹膜，用滅菌的彎曲鑷子輕輕地拉與睪丸相連的背部脂肪，緩緩把睪丸通過切口從陰囊中撥出，將10 μL含有臺盼藍的慢病毒溶液用一個30規(guī)格的針頭慢慢注射到睪丸曲細精管中，縫合創(chuàng)口，建立F0代小鼠。手術(shù)過程中，為了避免小鼠體溫下降，將其放在加熱板上直到蘇醒。取注射后5 d小鼠1只，脫頸處死，迅速取睪丸組織，剝開睪丸外漿膜白膜，釋放曲細精管，取部分曲細精管制作冰凍切片。在熒光體視鏡和熒光顯微鏡下觀察曲細精管及其冰凍切片，初步判定慢病毒能否在活體上感染小鼠精原干細胞。

1.5 精原干細胞的免疫雙熒光檢測

另取1只注射后5 d的小鼠和1只同日齡正常小鼠(對照)，脫頸處死，取其睪丸組織，觀察2組睪丸組織形態(tài)。用PBS溶液清洗試驗組睪丸若干次，用苦味酸固定過夜，次日用PBS清洗3～4次，然后用體積分數(shù)70%酒精清洗3 次，組織切成適宜大小，按照常規(guī)方法制備5 μm厚的石蠟切片，通過免疫雙熒光染色檢測精原干細胞是否被慢病毒感染。免疫雙熒光染色時，用特異抗體PLZF識別睪丸精原干細胞，二抗攜帶的綠色熒光會將精原干細胞染成綠色。細胞被慢病毒感染后會表達EGFP蛋白，免疫雙熒光染色時，EGFP的二抗攜帶有紅色熒光，會將表達EGFP蛋白的細胞染成紅色。免疫雙熒光染色流程為：切片脫蠟→體積分數(shù)0.5%的Tritonx-100室溫孵育→抗原修復(fù)→血清封閉→羊源PLZF一抗孵育→驢抗羊二抗孵育→PLZF顯色→體積分數(shù)80%甘油緩沖液封片→熒光顯微鏡觀察。

1.6 轉(zhuǎn)基因小鼠的PCR鑒定

將注射后35 d的雄性小鼠與野生型母鼠按1∶1比例共同飼養(yǎng)進行交配，獲得F1代轉(zhuǎn)基因小鼠。剪取F1代小鼠尾部長約0.5 cm的組織，按照《分子克隆試驗指南》[10]采用SDS法提取其基因組DNA。以小鼠基因組DNA為模板，用引物F:5′-TGGTTCTGGCGGAATCACCA-3′，R:5′-ACAATCTCCACTTTGCCACTG-3′擴增內(nèi)參基因GAPDH，以確定基因組的提取效果。

在確定提取基因組質(zhì)量良好后，用Primer 5.0軟件設(shè)計慢病毒pLL3.7載體引物，用于PCR檢測轉(zhuǎn)基因的效率，引物序列為：F：5′-GGTGTTGTCG-GGGAAATCATC-3′；R：5′-ACACAACAGACGG-GCACACAC-3′。

PCR反應(yīng)總體系為25 μL：10×PCR緩沖液(含Mg2+)2.5 μL，dNTP(25 pmol/μL)2.0 μL，上、下游引物(10 mmol/L)各1 μL，TaqDNA聚合酶(5 U/μL)0.2 μL，DNA模板(50 ng/μL)1.0 μL，超純水17.3 μL。PCR反應(yīng)程序:94 ℃預(yù)變性5 min;94 ℃變性30 s,60 ℃退火30 s,72 ℃延伸1 min,33個循環(huán);72 ℃延伸10 min，12 ℃保存。試驗同時設(shè)以質(zhì)粒pLL3.7載體作模板的陽性對照(CK1)，以野生型小鼠的基因組DNA作模板的陰性對照(CK2)和超純水空白對照(CK3)。

2 結(jié)果與分析

2.1 慢病毒包裝效果的檢測

用Lipofectamine 2000試劑共轉(zhuǎn)染3質(zhì)粒至293T包裝細胞，轉(zhuǎn)染20 h后在熒光顯微鏡下觀察，細胞狀態(tài)良好，并有大量細胞表達綠色熒光，初步判定轉(zhuǎn)染效率在70%左右。通過孔稀釋法測定獲得的慢病毒滴度，結(jié)果在10 倍稀釋時，可見大量綠色熒光表達(圖1)，轉(zhuǎn)染效率>80%，經(jīng)計算本試驗獲得的慢病毒滴度為106TU/mL，能夠達到在活體上注射睪丸，感染精原干細胞的要求。

圖1 10倍稀釋攜帶有EGFP基因慢病毒感染的293T細胞(×400)

2.2 睪丸曲細精管及其冰凍切片的觀察

通過慢病毒注射雄性小鼠睪丸組織，建立F0代小鼠10只，全部成活且生長良好。

將注射5 d后的曲細精管及其冰凍切片放置在熒光顯微鏡下觀察，結(jié)果發(fā)現(xiàn)曲細精管內(nèi)壁及其冰凍切片有綠色熒光分布(圖2)。精原干細胞一般位于曲細精管內(nèi)壁的基底部，通過觀察發(fā)現(xiàn)曲細精管內(nèi)壁基底部有綠色熒光均勻分布，因此，可初步判定慢病毒在活體上可以感染睪丸組織中的細胞，但感染的細胞是否是精原干細胞，還需要通過免疫雙熒光分析來證實。

圖2 攜帶有EGFP基因的慢病毒感染小鼠曲細精管(A)及其冰凍切片(B)的觀察(×100)

2.3 小鼠睪丸組織的免疫雙熒光檢測

制作小鼠睪丸組織石蠟切片，觀察發(fā)現(xiàn)注射慢病毒后小鼠睪丸發(fā)育正常，形態(tài)上與正常小鼠睪丸組織相比沒有異常變化。PLZF可特異性地標記精原干細胞，其二抗攜帶綠色熒光，從圖3-A可見，在曲細精管基底部的細胞發(fā)出了綠色熒光，確認為精原干細胞。試驗中被慢病毒感染的細胞表達EGFP蛋白，標記表達EGFP蛋白的二抗攜帶紅色熒光，睪丸組織切片中發(fā)現(xiàn)了紅色熒光標記的細胞(圖3-B)，表明該細胞被慢病毒感染。為了確認表達EGFP的細胞為小鼠精原干細胞，把2張切片重疊，發(fā)現(xiàn)綠色熒光標記與紅色熒光標記在同一細胞上(圖3-C)，表明小鼠睪丸中的精原干細胞可被慢病毒感染。因此，可以確定慢病毒能夠在活體上感染精原干細胞，且效率較高。

圖3 注射攜帶有EGFP基因慢病毒后小鼠睪丸組織的免疫雙熒光染色觀察(×400)

2.4 轉(zhuǎn)基因小鼠的鑒定

將8 只F0代小鼠分為A、B、C、D、E、F、G、H 8組，注射35 d后分別與野生型母鼠按照1∶1比列交配，其中6 只母鼠受孕，共生產(chǎn)F1代小鼠41 只(表1)。內(nèi)參基因GAPDHPCR擴增結(jié)果(圖4)表明，本試驗F1代小鼠基因組提取質(zhì)量和PCR條件良好，可以用于慢病毒基因組PCR檢測。PCR檢測結(jié)果表明，41只F1代小鼠中有21只擴增出約 1 000 bp的慢病毒基因組片段(圖4)，轉(zhuǎn)基因的效率為 51.22% (表1)。由圖4可知，不同F(xiàn)1代小鼠個體之間慢病毒基因組PCR產(chǎn)物的含量不同，由于PCR檢測時，模板量統(tǒng)一為50 ng/μL，且不同個體間GAPDH的擴增量一致(圖5)，因此可初步判斷在不同F(xiàn)1個體之間，慢病毒攜帶的外源基因整合在基因組中的位點數(shù)和效率是不同的。

表1 慢病毒注射建立的F0代小鼠后代轉(zhuǎn)基因效率檢測

圖4 F1代轉(zhuǎn)基因小鼠攜帶慢病毒pLL3.7載體的PCR檢測(部分結(jié)果)

圖5 F1代轉(zhuǎn)基因小鼠GAPDH基因的PCR擴增(部分結(jié)果)

3 討 論

精原干細胞是形成雄性生殖細胞的前體,不但能自我更新生成新的干細胞,還可不斷增殖分化形成各階段的生殖細胞和精子，對后代遺傳起著決定性的作用[11-12]。Nagano等[13]用重組反轉(zhuǎn)錄病毒體外感染精原干細胞，然后通過異種移植技術(shù)把感染細胞移植到雄性鼠睪丸中，從而獲得轉(zhuǎn)基因小鼠，但生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因小鼠的成功率較低，且精原干細胞分離純化、培養(yǎng)都非常困難，難于操作。Hamra等[14]用慢病毒進行與Nagano同樣的實驗，借助慢病毒高效感染的特點，轉(zhuǎn)基因小鼠生產(chǎn)的成功率有較大提高。Pfeifer等[14]用重組的慢病毒感染受精卵，然后把胚胎移植到假孕的母體，該方法大大提高了轉(zhuǎn)基因的成功率，但過程繁瑣并需要大量雌性供體。Dhup等[15]報道通過電擊法將DNA導(dǎo)入成年鼠的睪丸，電擊處理的17 只鼠有16 只能夠生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因后代。

基于前人的研究成果，本研究構(gòu)建了一種操作簡單、花費少并且能有效地生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因鼠的技術(shù)平臺，主要是把攜帶EGFP基因的慢病毒注射到小鼠曲細精管，在活體上通過慢病毒感染精原干細胞，并把期望的外源基因整合到精原干細胞的基因組中，然后通過自然交配即可獲得轉(zhuǎn)基因動物。Hamra等[9]用慢病毒感染雄性小鼠生殖細胞，移植到野生型小鼠的睪丸組織，發(fā)現(xiàn)3 只雄性鼠中只有1只具有繁殖能力。本研究用建立的8 只F0代雄性小鼠進行交配試驗，結(jié)果有6 只產(chǎn)生了F1代， F0代的繁殖能力為75%。通過對每組產(chǎn)生的F1代小鼠進行轉(zhuǎn)基因效率檢測發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)基因效率最低為0，最高為100%，平均為51.22%。該技術(shù)體系用構(gòu)建的慢病毒載體在活體上對精原干細胞進行操作，從而生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因動物，結(jié)果表明，該方法對動物的遺傳與發(fā)育影響很小，且慢病毒介導(dǎo)的轉(zhuǎn)基因能在生殖細胞系中遺傳，這與預(yù)期的結(jié)果一致。另外，采用此技術(shù)可以整合不同的基因生產(chǎn)多種轉(zhuǎn)基因后代，建立多種轉(zhuǎn)基因品系。本試驗要求把慢病毒注射到小鼠曲細精管，使病毒易于感染精原干細胞，但在不損傷睪丸組織的前提下，精準注射到曲細精管是非常困難的。因此分析認為，造成本試驗中F0代部分小鼠繁殖能力受損和不同個體產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因后代效率差異較大的原因可能是，注射病毒時操作損傷、不能精準注射到曲細精管同等劑量的病毒及慢病毒感染和整合效率不同等。

盡管本試驗生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因動物的效率不如傳統(tǒng)的慢病毒轉(zhuǎn)基因方法，但該技術(shù)花費少，操作簡單，快捷且易于實施，對小鼠的生育能力危害小，使轉(zhuǎn)移的基因在生殖細胞中傳遞，且需要的動物數(shù)量很少，F(xiàn)0代小鼠能交配多次，可以生產(chǎn)大量的轉(zhuǎn)基因后代，生產(chǎn)成本大大降低。另外，該技術(shù)體系也可以應(yīng)用到其他動物，這將會促進生殖醫(yī)學(xué)、畜牧業(yè)遺傳育種和基因功能研究等領(lǐng)域的快速發(fā)展。

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