徐一馨，王 飛，張成雙，慕自新

(西北農(nóng)林科技大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，陜西 楊凌712100)

隨著全球氣候的變化，干旱發(fā)生的頻率和持續(xù)的時(shí)間均在增加，對(duì)糧食安全造成了嚴(yán)重的威脅[1]。一氧化氮(NO)幾乎在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中參與了所有的生理活動(dòng)，如心血管放松、神經(jīng)遞質(zhì)轉(zhuǎn)導(dǎo)、平滑肌放松以及免疫反應(yīng)等[2]；在植物中，NO參與了植物生長發(fā)育及對(duì)外界脅迫反應(yīng)等多種生理過程，包括促進(jìn)種子萌發(fā)、降低種子休眠、調(diào)節(jié)植物的成熟和衰老、抑制植物開花等[3-5]。當(dāng)受到生物和非生物脅迫時(shí)，植物體產(chǎn)生的內(nèi)源NO經(jīng)過一系列的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，通過調(diào)節(jié)氣孔運(yùn)動(dòng)、激活抗氧化酶或者誘導(dǎo)脅迫應(yīng)答基因的表達(dá)等方式來行使抗逆功能[6-7]。而體外施加NO，也可以增強(qiáng)植物對(duì)環(huán)境逆境(干旱、高鹽、冷(凍)害、磷虧缺、重金屬、UV-B輻射、除草劑和病原等)的抗性[8-9]。

1 材料與方法

1.1 材 料

供試玉米種子為鄭丹958，購自陜西楊凌金諾種業(yè)公司。營養(yǎng)基質(zhì)于2012-04購自楊凌正高肥料有限公司，其營養(yǎng)成分為N+P2O2+K2O≥1%，腐殖酸≥10%,有機(jī)質(zhì)≥20%，EC≤1.8 mS/cm。GSH購自Sigma公司，NaNO2購自西隴制藥公司。

1.2 幼苗的培養(yǎng)與處理

1.2.1 幼苗培養(yǎng) 選擇適量籽粒飽滿、大小一致的玉米種子，先用質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%次氯酸鈉消毒15 min，自來水沖洗數(shù)次，再用蒸餾水浸泡過夜，使其充分吸水。之后，將玉米種子放在墊有1層海綿的托盤中，在28 ℃的溫箱中黑暗催芽。將營養(yǎng)土分裝到規(guī)格為10 cm×11 cm2的黑色盆缽中，每盆裝土約0.262 kg，再將各個(gè)盆缽浸水24 h，使其充分吸水；待玉米種子露白后，挑選生長一致的萌發(fā)種子移植到盆缽中。然后將發(fā)芽種子置于光照培養(yǎng)間(光照強(qiáng)度100 μmol/(m2·s)，光暗時(shí)數(shù)14 h/10 h，晝夜溫差28 ℃/20 ℃，空氣相對(duì)濕度70%)中培養(yǎng)。

1.2.2 GSNO的制備 將等體積的10 mmol/L NaNO2(在100 mmol/L HCl中)與等體積的10 mmol/L GSH(在100 mmol/L pH 7.4的磷酸緩沖液中)反應(yīng)，即可形成5 mmol/L GSNO。將5 mmol/L GSNO稀釋成需要的濃度(50，100，250，500，800，1 000 μmol/L)。室溫條件下，在100 mmol/L pH 7.4的磷酸緩沖液中(內(nèi)含50 μmol/L DTT)，GSNO可以釋放出NO，其中500 μmol/L GSNO 30 min釋放出的NO濃度約為 3.25 μmol/L[12]。

1.2.3 幼苗處理 參照Bethke等[13]的方法，待玉米幼苗長到三葉一心時(shí)，挑選長勢(shì)一致的幼苗，分別將50，100，250，500，800，1 000 μmol/L GSNO連同植株一同放置到密閉的培養(yǎng)箱中，氣體熏蒸3 h。采用人工控水法對(duì)所有幼苗進(jìn)行干旱脅迫，使土壤相對(duì)含水量(RWC)為55%～45%。先充分供水至RWC的上限，之后2 d稱質(zhì)量1次，待RWC降至下限時(shí)采取微量給水法保證土壤含水量。試驗(yàn)設(shè)置干旱脅迫對(duì)照(即只單獨(dú)進(jìn)行干旱脅迫，不進(jìn)行GSNO處理)，分別于干旱脅迫后的1，4和7 d，取干旱對(duì)照和各處理植株的倒二葉, 進(jìn)行生長和生理指標(biāo)的測(cè)定。

1.3 測(cè)定指標(biāo)與方法

1.3.1 株高、莖粗和葉面積 干旱脅迫7 d后分別用直尺和游標(biāo)卡尺測(cè)量玉米植株的株高和莖粗。葉面積采用Francis等[14]的方法進(jìn)行測(cè)算，即葉面積=葉長×葉寬×葉面積系數(shù)(0.75)，每組數(shù)據(jù)重復(fù)測(cè)量8次取平均值。

1.3.2 葉片失水速率 將干旱脅迫7 d幼苗的離體葉片放置在光強(qiáng)度為200 μmol/(m2·s)的白熾燈下，1 h后稱量葉片1次，共測(cè)量6次，分別記錄葉片離體1～6 h時(shí)質(zhì)量的變化；最后，將離體葉片置80 ℃烘箱干燥至質(zhì)量恒定，稱取葉片干質(zhì)量，求失水速率。

1.3.3 抗氧化酶活性 將用液氮研磨干旱脅迫1，4和7 d的幼苗倒二葉約500 mg，溶解于50 μmol/L的磷酸鉀緩沖液(包含1 mmol/L EDTA、質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%的PVP)中，在4 ℃、15 000×g下離心20 min，取上清液用Elavarthi 等[15]的方法測(cè)定抗氧化酶活性。

1.3.5 光合色素含量 采用質(zhì)量測(cè)定法，取不同處理植株葉片剪勻(0.2 cm×2 cm，避開葉脈)，稱取 0.1～0.2 g放入試管中，加入0.5 mL純丙酮和10 mL體積分?jǐn)?shù)80%的丙酮，用封口膜封住試管，將試管放入搖床于黑暗處浸提過夜，直到發(fā)白為止。利用UV-2450型紫外可見分光光度計(jì)分別在波長663，645和470 nm處測(cè)定吸光度值，然后計(jì)算葉綠素總量和葉綠素a、葉綠素b、類胡蘿卜素含量[18]。

1.3.6 丙二醛(MDA)含量 采用Zhao等[19]的方法進(jìn)行測(cè)定。

1.4 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)數(shù)據(jù)用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示。用DPS軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析和新復(fù)極差法比較，用Origin軟件做圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 GSNO處理對(duì)干旱脅迫玉米幼苗生長的影響

由圖1可知，干旱脅迫7 d后，干旱對(duì)照的玉米植株嚴(yán)重倒伏并萎蔫，且葉片均出現(xiàn)卷曲；50～1 000 μmol/L GSNO處理的玉米植株葉片頂部雖略有萎蔫，但仍呈舒張狀態(tài)，莖干部位仍然直挺，也未見嚴(yán)重枯萎。

圖1 GSNO處理對(duì)干旱脅迫玉米幼苗生長的影響

表1顯示，干旱對(duì)照組植株地上部分生長指標(biāo)均顯著低于GSNO處理組，說明GSNO處理液產(chǎn)生的NO能夠極大緩解干旱對(duì)玉米幼苗地上部生長的影響，進(jìn)而維持植株的正常生長。與干旱對(duì)照組相比，GSNO濃度為250與500 μmol/L時(shí)，其抗旱能力得到最大發(fā)揮，其中在500 μmol/L GSNO處理下，玉米幼苗的株高、莖粗和葉面積分別較干旱對(duì)照提高32.26%，45.83%和53.13%。鑒于50,250,800 μmol/L GSNO處理后玉米形態(tài)的變化與50,500,1 000 μmol/L GSNO處理基本一致，故本試驗(yàn)后續(xù)研究中只分析50，500和1 000 μmol/L GSNO處理對(duì)玉米生理指標(biāo)變化的影響。

表1 GSNO處理對(duì)干旱脅迫7 d玉米幼苗形態(tài)指標(biāo)的影響

2.2 GSNO處理對(duì)干旱脅迫玉米幼苗葉片失水速率的影響

干旱脅迫7 d后，分別測(cè)定各處理玉米離體葉片的失水速率，結(jié)果如圖2所示。由圖2可知，干旱對(duì)照玉米離體葉片失水速率的下降趨勢(shì)最為明顯，到測(cè)定后期其葉片失水速率幾乎降為0，表明葉片在離體6 h后其質(zhì)量已經(jīng)接近干質(zhì)量；各GSNO處理組離體葉片失水速率的下降趨勢(shì)相對(duì)較為平緩，其變化趨勢(shì)表現(xiàn)為500 μmol/L<50 μmol/L<1 000 μmol/L，說明GSNO處理可以顯著降低離體葉片的水分散失，并表現(xiàn)出一定的濃度依賴性。

圖2 GSNO處理對(duì)干旱脅迫下玉米離體葉片失水速率的影響

2.3 GSNO處理對(duì)干旱脅迫玉米幼苗葉片活性氧代謝的影響

由圖3可知，隨著脅迫時(shí)間的延長，各處理玉米幼苗的SOD和GR活性均呈下降趨勢(shì)，其中GR活性在干旱脅迫期間均顯著高于干旱對(duì)照，500和1 000 μmol/L GSNO處理的SOD活性與干旱對(duì)照也存在顯著差異。各處理的CAT活性均在干旱脅迫第4天達(dá)到最大值，之后有所下降，其中干旱對(duì)照的下降幅度明顯大于其他處理。與脅迫1 d相比，各GSNO處理幼苗的APX活性在脅迫第4天時(shí)變化不大，到后期總體呈上升趨勢(shì)，且GSNO處理幼苗的APX活性均顯著高于干旱對(duì)照。各處理組相比，均以500 μmol/L GSNO處理對(duì)酶活的促進(jìn)作用最明顯。由此推論，與干旱對(duì)照相比，NaNO2+GSH產(chǎn)生的GSNO處理能使干旱脅迫幼苗中的抗氧化酶活性得以激活，從而增強(qiáng)了玉米的抗氧化能力。

2.4 GSNO處理對(duì)干旱脅迫玉米幼苗葉片H2O2和的影響

2.5 GSNO處理對(duì)干旱脅迫玉米幼苗光合色素含量的影響

由圖5可見，隨著干旱脅迫時(shí)間的延長，各處理玉米葉片中的葉綠素總量、葉綠素a和葉綠素b含量總體上呈降低趨勢(shì)。但與干旱對(duì)照相比，干旱脅迫期間500 μmol/L GSNO處理玉米幼苗的葉綠素總量和葉綠素a含量均顯著增高，干旱脅迫1，4，7 d時(shí)其葉綠素總量分別較干旱對(duì)照增加10.12%，27.64% 和8.50%，葉綠素a含量分別增加 21.12%，28.18%和7.29%。隨著脅迫時(shí)間的延長，各處理的類胡蘿卜素含量無明顯變化規(guī)律，但GSNO處理的類胡蘿卜素含量總體高于干旱對(duì)照。上述結(jié)果表明，在干旱脅迫條件下，尤其是在干旱脅迫初期階段，經(jīng)500 μmol/L GSNO處理后，玉米幼苗葉片的葉綠素和類胡蘿卜素含量均有所提高。

圖3 GSNO處理對(duì)干旱脅迫玉米幼苗抗氧化酶活性的影響

圖4 GSNO處理對(duì)干旱脅迫玉米幼苗H2O2和含量的影響

圖5 GSNO處理對(duì)干旱脅迫玉米葉片光合色素含量的影響

2.6 GSNO處理對(duì)干旱脅迫玉米幼苗膜脂過氧化的影響

圖6顯示，在干旱脅迫初期(1～4 d)，MDA含量在所有處理中基本保持不變，且各GSNO處理玉米幼苗的MDA含量均稍低于干旱對(duì)照。干旱脅迫7 d后，各處理的MDA含量雖有所增加，但仍明顯低于干旱對(duì)照，表明GSNO處理降低了干旱脅迫下玉米幼苗的膜脂過氧化水平，增強(qiáng)了植株的抗逆性。

圖6 GSNO處理對(duì)干旱脅迫玉米幼苗MDA含量的影響

3 結(jié)論與討論

NO能否發(fā)揮作用及其發(fā)揮何種作用取決于其在植物體中的分布和濃度，低濃度NO可以降低ROS的水平，緩解亞硝基化脅迫，相反高濃度的NO可以引起氧化脅迫與亞硝基化損害[1,7]。由于NO具有兩面性，因此維持合適的NO濃度至關(guān)重要。干旱脅迫可以打破細(xì)胞的氧化還原平衡，最終導(dǎo)致ROS的積累與氧化脅迫[20]，誘導(dǎo)植物體內(nèi)NO的產(chǎn)生。Arasimowicz-Jelonek等[21]報(bào)道，當(dāng)黃瓜(Cucurbitaceae)遭受微量水分虧缺時(shí)(5～10 h)，其根部伸長區(qū)就會(huì)有微量的NO產(chǎn)生；而當(dāng)遭受嚴(yán)重水分虧缺時(shí)(17 h)根部會(huì)有大量NO產(chǎn)生；Guo等[10]報(bào)道，在干旱環(huán)境下豌豆(Pisumsativum)、小麥(Triticumaestivuml)以及煙草(Nicotianatabacum)中都會(huì)有NO的產(chǎn)生。

在干旱脅迫條件下，植物通過調(diào)節(jié)細(xì)胞分裂和細(xì)胞擴(kuò)張主動(dòng)重塑自身的生長發(fā)育過程，而NO正是通過調(diào)控氣孔的開度，將生長發(fā)育和非生物逆境應(yīng)答聯(lián)系起來[23]。Tan等[22]施加SNP為外源NO，發(fā)現(xiàn)外源NO能夠誘導(dǎo)氣孔關(guān)閉，有利于維持較高的葉片含水量。本研究表明，干旱脅迫6 h時(shí)，各GSNO處理的離體玉米葉片的失水速率均明顯低于干旱對(duì)照，其失水速率表現(xiàn)為500 μmol/L GSNO<50 μmol/L GSNO<1 000 μmol/L GSNO<干旱對(duì)照，這可能是由于NO誘導(dǎo)了氣孔開度的減小所致[23]。光合色素不僅在植物吸收光能過程中發(fā)揮了重要作用，而且還能夠增強(qiáng)植物的抗氧化能力，葉綠素a和葉綠素b對(duì)干旱比較敏感，而類胡蘿卜素有抵御干旱的能力。Graziano等[24]發(fā)現(xiàn)，NO能夠通過增加玉米葉片葉綠體膜上Fe離子的濃度來促進(jìn)葉綠素含量的升高。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，GSNO處理可以提高干旱脅迫玉米幼苗的葉綠素和類胡蘿卜素含量。

綜上所述，500 μmol/L GSNO處理對(duì)玉米幼苗抗旱性的提高效果最為明顯，該濃度也在已經(jīng)鑒定的其他物種的最適GSNO處理濃度范圍之內(nèi)[15-21]。外施GSNO可以通過對(duì)植物生長的調(diào)控，維持植物體內(nèi)的水分平衡，激活其抗氧化防御系統(tǒng)，增強(qiáng)ROS的清除能力及光合能力，進(jìn)而增強(qiáng)玉米幼苗的抗旱性。

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