劉振春,孫慧娟,耿存花,韓 宇
(吉林農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院,吉林 長(zhǎng)春 130118)
植物甾醇是廣泛存在于植物中的一種活性物質(zhì),主要以醇結(jié)構(gòu)和酯化形式存在于自然界中,其中含量較豐富的有β-谷甾醇、豆甾醇、菜油甾醇和菜籽甾醇[1-2]。植物甾醇的化學(xué)結(jié)構(gòu)類似動(dòng)物體內(nèi)的膽固醇,其可以降低血液中的總膽固醇含量,減輕心血管疾病的發(fā)生[3],現(xiàn)已被大量應(yīng)用在醫(yī)藥品(AD、ADD的前體[4])、保健品(作為抗氧化、抗癌物質(zhì)添加在食品中[5])、化妝品和飼料等領(lǐng)域,具有抗炎、退熱、降膽固醇、美容和促進(jìn)動(dòng)物生長(zhǎng)等作用[6]。
但是游離型的植物甾醇油溶性差并且具有弱疏水性,在人體內(nèi)的溶解性和生物利用率較低[7]。酯化型的植物甾醇油溶性和溶解性均較好,在人體中的吸收利用率較游離型植物甾醇提高約5倍,可以應(yīng)用于食品涂抹、色拉調(diào)料、營(yíng)養(yǎng)添加劑和飲料乳制品中[8-9]。目前,國(guó)內(nèi)外在該領(lǐng)域的研究以油酸、亞麻酸等脂肪酸為主,對(duì)共軛不飽和脂肪酸的研究較少。共軛亞油酸是一種多不飽和脂肪酸,具有提高免疫、抗動(dòng)脈粥樣硬化、降血脂的功效[10-11]。為此,本研究利用脂肪酶催化植物甾醇和共軛亞油酸進(jìn)行酯化反應(yīng)生產(chǎn)共軛亞油酸植物甾醇酯,并對(duì)其合成工藝進(jìn)行優(yōu)化,以提高甾醇在人體內(nèi)的吸收利用率,進(jìn)而為甾醇酯的安全、高效合成提供技術(shù)支持。
植物甾醇(其中β-谷甾醇、豆甾醇、菜油甾醇、菜籽甾醇總含量為950 g/kg),西安藍(lán)天生物工程有限公司;共軛亞油酸(CLA),青島澳海生物有限公司;脂肪酶Pseudomonas,蘇州奧維科生物科技有限公司;環(huán)己酮,分析純;正己烷,色譜純。
JJ-精密增力電動(dòng)攪拌器,金壇市科析儀器有限公司;QP氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀,日本島津公司;高純氮?dú)獍l(fā)生器,北京匯佳精儀公司;HH-2數(shù)顯恒溫水浴鍋,常州澳華儀器有限公司。
1.3.1 共軛亞油酸植物甾醇酯的制備 采用脂肪酶Pseudomonas催化植物甾醇與共軛亞油酸直接酯化的方法合成共軛亞油酸甾醇酯,以水作為反應(yīng)溶劑。在連接有電動(dòng)攪拌器、溫度計(jì)、油水分離器的三口燒瓶中,加入一定量的甾醇、共軛亞油酸、脂肪酶,充入自制的氮?dú)?,水浴加熱;反?yīng)物加熱后呈黏稠狀液體,用電動(dòng)攪拌器不斷攪拌進(jìn)行酯化反應(yīng),恒溫控制,待反應(yīng)結(jié)束后,將產(chǎn)物放入離心管中進(jìn)行離心,取上層油狀物,冷卻至室溫,即得到甾醇酯粗品。
1.3.2 甾醇酯的純化 將得到的甾醇酯粗品,先用NaHCO3洗滌3次,再用乙醇進(jìn)行洗滌;去除過(guò)量的共軛亞油酸和游離的植物甾醇,而后與環(huán)己酮混勻后加入到燒瓶中,加熱至完全溶解后,停止加熱;自然冷卻至25 ℃結(jié)晶,進(jìn)行抽濾,濾餅經(jīng)真空干燥至恒質(zhì)量,再經(jīng)過(guò)3次重結(jié)晶,精制后的甾醇酯純度可達(dá)到90%以上[12]。
1.3.3 甾醇酯的氣相色譜分析及酯化率的計(jì)算 將純化后的甾醇酯樣品用正己烷稀釋一定倍數(shù)后進(jìn)行氣相色譜分析[13]。條件如下:MXT-1型石英毛細(xì)管色譜柱(30.0 m×0.25 mm×0.25 μm),F(xiàn)ID檢測(cè)器;進(jìn)樣量為1.0 μL,進(jìn)樣口溫度380 ℃,載氣為高純N2,恒壓模式;分流比為10∶1,H2流速為50 mL/min,柱流速為1 mL/min,尾吹氣N2,流速30 mL/min。程序升溫:初溫300 ℃,以3 ℃/min升至330 ℃,再以2 ℃/min的速度升至350 ℃,保持1 min。
根據(jù)圖譜中各組分的峰面積計(jì)算共軛亞油酸甾醇酯的酯化率,公式為:
式中:A為植物甾醇的總峰面積,B為植物甾醇酯的峰面積,1.647為植物甾醇與植物甾醇共軛亞油酸酯的轉(zhuǎn)換系數(shù)。
1.3.4 共軛亞油酸甾醇酯酯化條件的單因素試驗(yàn) 本試驗(yàn)主要研究反應(yīng)溫度、反應(yīng)時(shí)間、物料比(共軛亞油酸與植物甾醇物質(zhì)的量比)、酶添加量4個(gè)單因素對(duì)共軛亞油酸甾醇酯酯化率的影響。
(1)反應(yīng)溫度。在物料比為3∶1、酶添加量為6%、反應(yīng)時(shí)間為40 h的條件下,考察反應(yīng)溫度(35,45,55,65和75 ℃)對(duì)酯化率的影響,確定最佳反應(yīng)溫度。
(2)反應(yīng)時(shí)間。在反應(yīng)溫度為55 ℃、物料比為3∶1、酶添加量為6%的條件下,考察反應(yīng)時(shí)間(30,35,40,45和50 h)對(duì)酯化率的影響,確定最佳反應(yīng)時(shí)間。
(3)物料比。在反應(yīng)溫度為55 ℃、酶添加量為6%、反應(yīng)時(shí)間為40 h的條件下,考察物料比(1∶1,2∶1,3∶1,4∶1和5∶1)對(duì)酯化率的影響,確定最佳物料比。
(4)酶添加量。在反應(yīng)溫度為55 ℃、物料比為3∶1、反應(yīng)時(shí)間為40 h的條件下,考察酶添加量(2%,4%,6%,8%和10%)對(duì)酯化率的影響,確定最佳的酶添加量。
1.3.5 Box-Behnken響應(yīng)面設(shè)計(jì)試驗(yàn) 根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果,采用響應(yīng)面法進(jìn)行試驗(yàn)數(shù)據(jù)處理,選用Box-Behnken模型對(duì)共軛亞油酸甾醇酯合成的影響因素進(jìn)行響應(yīng)面設(shè)計(jì),以酯化率為響應(yīng)值進(jìn)行優(yōu)化,試驗(yàn)因素和水平見(jiàn)表1。
表1 共軛亞油酸甾醇酯合成條件響應(yīng)面試驗(yàn)的因素和水平
1.3.6 最佳工藝條件的確定及論證 根據(jù)響應(yīng)面試驗(yàn)確定共軛亞油酸甾醇酯合成的最佳工藝條件,并進(jìn)行試驗(yàn)驗(yàn)證。
2.1.1 反應(yīng)溫度 從圖1可以看出,反應(yīng)溫度對(duì)酯化率有顯著的影響,隨著反應(yīng)溫度的升高酯化率迅速增加,到55 ℃時(shí)達(dá)到最高點(diǎn),之后隨著反應(yīng)溫度的繼續(xù)升高,酯化率有所下降,這可能是由于溫度過(guò)高導(dǎo)致部分酶失活,酶活力下降而不利于酯化反應(yīng)進(jìn)行所致。另外,高溫還會(huì)使產(chǎn)品顏色變深,導(dǎo)致甾醇易發(fā)生脫水反應(yīng),從而影響產(chǎn)品質(zhì)量。綜上考慮,反應(yīng)溫度選為55 ℃[14]。
圖1 反應(yīng)溫度對(duì)酯化率的影響
2.1.2 反應(yīng)時(shí)間 由圖2可見(jiàn),隨著反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng)酯化率逐漸增大,反應(yīng)前40 h酯化率提高較快,反應(yīng)超過(guò)40 h后酯化率增加緩慢,反應(yīng)逐漸趨于穩(wěn)定。反應(yīng)時(shí)間過(guò)長(zhǎng)可能會(huì)增加副反應(yīng)發(fā)生的幾率,故最佳反應(yīng)時(shí)間選為40 h。
2.1.3 物料比 由圖3可知,隨著共軛亞油酸添加比例變大,酯化率呈先增大后變小的變化趨勢(shì)。當(dāng)物料比即共軛亞油酸與植物甾醇的物質(zhì)的量比達(dá)到3∶1時(shí),酯化率達(dá)到最大值,繼續(xù)增大物料比酯化率開(kāi)始降低。這是因?yàn)檫^(guò)多的酸可以充當(dāng)反應(yīng)溶劑,增大與甾醇的接觸面積,使反應(yīng)更加充分,但過(guò)多的底物會(huì)相對(duì)減小酶的濃度,降低酶的催化能力,故3∶1為最佳物料比。
圖3 物料比對(duì)酯化率的影響
2.1.4 酶添加量 從圖4可以看出,酶對(duì)酯化反應(yīng)的催化作用十分明顯,隨著酶添加量的增大,酯化率迅速增加。當(dāng)酶添加量超過(guò)6%時(shí),酯化率呈下降趨勢(shì),這是因?yàn)槊赣昧刻髸?huì)使酶發(fā)生聚集而不能與底物充分接觸,從而降低了酶的催化能力[15]。另外考慮到經(jīng)濟(jì)因素,故選擇6%作為酶的最佳添加量。
2.2.1 試驗(yàn)結(jié)果與分析 選擇對(duì)酯化率影響較大的因素,即反應(yīng)溫度、反應(yīng)時(shí)間、酶添加量進(jìn)行三因素三水平的Box-Behnken中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì),試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2。
表2 共軛亞油酸甾醇酯合成的Box-Behnken 試驗(yàn)結(jié)果
利用軟件Design-Expert 7.0.0對(duì)表2數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合,得到酯化率(Y)對(duì)以上三因素的二次多元回歸模型為:
對(duì)該回歸方程進(jìn)行方差分析,結(jié)果如表3所示。
表3 共軛亞油酸甾醇酯合成工藝酯化率回歸方程的方差分析
2.2.2 反應(yīng)溫度和酶添加量的交互作用 當(dāng)反應(yīng)時(shí)間為40 h,物料比為3∶1時(shí),根據(jù)回歸模型繪制反應(yīng)溫度和酶添加量對(duì)酯化率影響的等高線和響應(yīng)面見(jiàn)圖5。從圖5可以看出,在反應(yīng)溫度為50~60 ℃時(shí),酯化率呈現(xiàn)先增大后減少的趨勢(shì),在55 ℃左右達(dá)到最高點(diǎn);在酶添加量為4%~7%時(shí),酯化率升高明顯,而在酶添加量為7%~8%時(shí)酯化率緩慢降低,說(shuō)明酶添加量對(duì)酯化率的影響作用大于反應(yīng)溫度,在響應(yīng)面圖上表現(xiàn)為坡度更為陡峭。從等高線圖上看,等高線為橢圓形,說(shuō)明反應(yīng)溫度和酶添加量的交互作用對(duì)酯化率有顯著影響。
圖5 反應(yīng)溫度和酶添加量交互作用對(duì)酯化率的影響
2.2.3 反應(yīng)溫度和反應(yīng)時(shí)間的交互作用 當(dāng)酶添加量為6%,物料比為3∶1時(shí),根據(jù)回歸模型繪制反應(yīng)溫度和反應(yīng)時(shí)間對(duì)酯化率影響的等高線和響應(yīng)面如圖6所示。由圖6可知,在反應(yīng)溫度為50~60 ℃、反應(yīng)時(shí)間為35~45 h時(shí),酯化率呈現(xiàn)先逐漸升高后又持續(xù)降低的變化過(guò)程。從等高線圖上看,等高線為橢圓,說(shuō)明反應(yīng)溫度和反應(yīng)時(shí)間的交互作用對(duì)酯化率有顯著影響,在反應(yīng)時(shí)間40~42 h以及反應(yīng)溫度為55~57.5 ℃的交叉區(qū)域內(nèi)酯化率達(dá)到最高。反應(yīng)溫度和反應(yīng)時(shí)間在響應(yīng)面上的變化趨勢(shì)無(wú)明顯差異,說(shuō)明二者對(duì)酯化率均有較大影響。
圖6 反應(yīng)溫度和反應(yīng)時(shí)間交互作用對(duì)酯化率的影響
2.2.4 酶添加量和反應(yīng)時(shí)間的交互作用 當(dāng)反應(yīng)溫度為55 ℃時(shí),物料比為3∶1時(shí),根據(jù)回歸模型繪制反應(yīng)時(shí)間和酶添加量對(duì)酯化率影響的等高線和響應(yīng)面見(jiàn)圖7。由圖7可以看出,等高線接近于圓形,可知酶添加量與反應(yīng)時(shí)間的交互作用對(duì)酯化率影響不顯著。由響應(yīng)面圖中的變化趨勢(shì)可知,酶添加量對(duì)酯化反應(yīng)的影響較反應(yīng)時(shí)間大。
2.2.5 最優(yōu)工藝條件的確定及其驗(yàn)證試驗(yàn) 通過(guò)對(duì)回歸方程的計(jì)算與分析,最終確定的共軛亞油酸甾醇酯合成的最佳工藝條件為:反應(yīng)溫度55.63 ℃、酶添加量6.58%、反應(yīng)時(shí)間41.15 h??紤]到具體操作和因素水平的控制,最后修正為反應(yīng)溫度55.5 ℃、反應(yīng)時(shí)間41.2 h、酶添加量6.6%。在此條件下進(jìn)行3個(gè)重復(fù)的驗(yàn)證試驗(yàn),以檢驗(yàn)脂肪酶催化合成共軛亞油酸植物甾醇酯的酯化率預(yù)測(cè)模型方程的有效性和擬合性。結(jié)果表明,酯化率的試驗(yàn)值(84.37%)與模型預(yù)測(cè)值(84.48%)相差0.11%,表明該預(yù)測(cè)模型可以較好地反應(yīng)甾醇酯的合成條件。
圖7 反應(yīng)時(shí)間和酶添加量交互作用對(duì)酯化率的影響
由圖8、9可以看出,共軛亞油酸植物甾醇酯出峰時(shí)間較植物甾醇早,酯化反應(yīng)基本完全,甾醇酯與植物甾醇有較好的分離,說(shuō)明共軛亞油酸植物甾醇酯粗品經(jīng)過(guò)重結(jié)晶后,產(chǎn)物純度較高。
圖8 植物甾醇的氣相色譜圖
本試驗(yàn)利用脂肪酶Pseudomonas催化共軛亞油酸植物甾醇酯的合成,在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上,通過(guò)Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)對(duì)合成工藝進(jìn)行了優(yōu)化,建立了擬合性良好的回歸模型方程,并對(duì)主要因素及其相互間的交互作用進(jìn)行了分析,經(jīng)過(guò)修正得到脂肪酶催化合成共軛亞油酸甾醇酯的最優(yōu)工藝參數(shù)為:反應(yīng)溫度55.5 ℃、酶添加量6.6%、反應(yīng)時(shí)間41.2 h,在此條件下,驗(yàn)證試驗(yàn)得到的酯化率為 84.37%,與其他的文獻(xiàn)[16-18]相比,該方法反應(yīng)時(shí)間短、酯化率高,為甾醇類衍生物的合成提供了一定的借鑒。
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