高 楊，趙紅玲，王小青，王良友，尹志峰

(河北省中藥研究與開發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，承德醫(yī)學(xué)院中藥研究所，河北承德 067000)

阿基瑞林的固相合成

高 楊，趙紅玲，王小青，王良友，尹志峰

(河北省中藥研究與開發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，承德醫(yī)學(xué)院中藥研究所，河北承德 067000)

阿基瑞林;固相合成;Rink樹脂

Argireline(阿基瑞林)，又名乙酰六勝肽-3，經(jīng)現(xiàn)代生化機(jī)制科學(xué)合理設(shè)計(jì)，是模仿SNAP-25蛋白N端合成的由6個(gè)氨基酸組成的寡肽[1-2]。阿基瑞林具有抗皺活性，且經(jīng)過臨床試驗(yàn)，安全性可以保證，功效可與A型肉毒毒素媲美，但避免了肉毒毒素必須采用注射應(yīng)用方式和使用成本高昂的缺點(diǎn)。阿基瑞林現(xiàn)已成為風(fēng)靡世界的抗皺化妝品原料，許多高端化妝品均應(yīng)用了阿基瑞林成分用于抗皺[3-4]。鑒于阿基瑞林市場(chǎng)需求量日益增加，目前鮮有固相合成方面的相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道，且反應(yīng)條件復(fù)雜[5]。本研究采用9-芴甲氧羰基(Fmoc)固相多肽合成法，以Rink Amide樹脂為載體，通過逐步偶聯(lián)氨基酸得到阿基瑞林，為其進(jìn)一步固相合成條件的優(yōu)化奠定了基礎(chǔ)。

1 儀器與試劑

1.1 儀器 AR224CN分析天平(美國奧豪斯儀器上海有限公司);制氮機(jī)(蘇州華徳氣體設(shè)備有限公司);TDL-40B高速大容量離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠);SHZ-Ⅳ循環(huán)水多用真空泵(南京科爾儀器設(shè)備有限公司);Heal Force系列純水機(jī)(香港力康公司);Agilent 1200液相色譜儀(美國Agilent公司);Agilent1200系列高效液相-ESI質(zhì)譜聯(lián)用儀(美國Agilent公司)。

1.2 主要材料 Rink Amide Resin樹脂(天津南開合成科技有限公司);Fmoc-Arg(pdf)-OH、Fmoc-Met-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH(四川成都誠諾科技有限公司);Fmoc-L-Gln(Trt)-OH、1-羥基苯并三唑(HOBT)、N,N’-二異丙基碳二亞胺(DIC)(蘇州中科天馬肽工程中心有限公司);N,N-二甲基甲酰胺(DMF)(天津科密歐化學(xué)試劑有限公司);冰乙醚、二氯甲烷(天津博迪化工股份有限公司);三氟乙酸(天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司);間甲苯酚、甲基苯基硫醚(上海晶純?cè)噭┯邢薰?。

2 方法與結(jié)果

2.1 阿基瑞林的合成

2.1.1 溶脹脫Fmoc:把Rink Amide Resin樹脂(替代度0.58mmol/g)1.729g(1mmol)投入到多肽反應(yīng)柱中，10ml DMF洗滌一次，抽干;8ml DMF溶漲，N2吹拂攪拌30min至樹脂充分泡漲，抽干液體;10ml DMF洗滌一次，抽干。加入6ml DBLK溶液(20%哌啶/DMF(V/V))，脫除Fmoc保護(hù)基7min，抽干，10ml DMF洗一次，再加入6ml DBLK溶液(20%哌啶/DMF(V/V))5min，全部脫除Fmoc保護(hù)基，使用茚三酮檢測(cè)法茚檢為藍(lán)色，脫除Fmoc完成。分別加入DMF、DCM各5ml，洗滌樹脂三次。

2.1.2 氨基酸偶聯(lián):稱取Fmoc-Arg(pdf)-OH(4mmol)2.595g，DIC(4mmol)0.6ml和HOBt(4mmol)0.542g，5ml DMF溶解，加入到樹脂中，N2吹拂攪拌反應(yīng)2h，茚三酮檢測(cè)法定性檢測(cè)無色，抽濾去除反應(yīng)液。10ml DMF洗滌一次，抽干。加入6ml 20%哌啶/DMF(V/V)溶液，脫除Fmoc保護(hù)基7min，抽干，10ml DMF洗一次，再加入6ml DBLK溶液(20%哌啶/DMF(V/V))5min全部脫除Fmoc保護(hù)基，茚檢為藍(lán)色，脫除Fmoc完成。分別加入DMF、DCM各5ml，洗滌樹脂三次。按照以上方法氨基酸及縮合劑投料為4倍投料，從N端到C端循環(huán)偶聯(lián)其余5個(gè)氨基酸Fmoc-Arg(pbf)-OH、Fmoc-L-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Met-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH。

2.1.3 乙?；⒏稍?阿基瑞林末端為乙酰，加入封閉液(VAC2O/V吡啶=7:6)，乙?；磻?yīng)6h，茚檢無色，分別用DMF洗滌樹脂3次、二氯甲烷洗滌3次，每次洗滌1min左右，再用甲醇收縮3次，每次收縮7min，抽掉。在反應(yīng)柱口塞上卷紙，真空干燥抽干至樹脂呈流沙狀。

2.2 肽鏈切割 配置10ml裂解液(三氟乙酸:甲基苯基硫醚:間甲酚=98:1.9:0.1)于50ml圓底燒瓶中，塞上玻璃塞，-20℃冰箱冷凍30min后拿出，放入攪拌子。將1g肽樹脂緩緩加入到裂解液中，全部加完后計(jì)時(shí)。室溫裂解2h(現(xiàn)象:原樹脂和裂解液均呈淺黃色，混合后均呈深暗紅色)。過濾，將濾出液體緩慢滴加入裝有60ml乙醚的血清瓶中，3200r/ min離心，倒出上清液，用乙醚研洗粗肽，再次離心，上述兩步循環(huán)操作4次。置空氣中靜置15min，刮取少量樣品檢測(cè)，其余轉(zhuǎn)移至真空干燥器中，進(jìn)行減壓干燥。

2.3 結(jié)果檢測(cè) 所得產(chǎn)品為白色粉末0.658g，并進(jìn)行相關(guān)檢測(cè)。

2.3.1 高效液相色譜(HPLC)檢測(cè):色譜柱為Agela C18柱(4.6×250mm，10μm);檢測(cè)波長:214nm;流動(dòng)相:緩沖 液A:0.1%TFA/H2O+，B:乙 腈;流 速:1ml/min;進(jìn)樣量:10μl;洗脫條件B項(xiàng)5%-95%，保留時(shí)間6.097min。HPLC純度為64.5%。

2.3.2 質(zhì)譜(MS)檢測(cè):掃描范圍100-200，質(zhì)譜檢定結(jié)果為m/z(%):[M+H]+=889.1，[M+H]2+=445.0，與理論值相符。

3 討論

從Rink Amide Resin樹脂出發(fā)，先進(jìn)行Fmoc-Arg(pdf)-OH偶聯(lián)，合成Fmoc-Arg(pbf)-Rink Amide Resin按照氨基酸順序從N端到C端循環(huán)偶聯(lián)RQMEE，F(xiàn)moc-Arg(pbf)-OH、Fmoc-L-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Met-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH，末端乙?；磻?yīng)。裂解液選用(三氟乙酸:甲基苯基硫醚:間甲酚=98:1.9:0.1)經(jīng)裂解、洗滌、沉降、離心得白色粉末，其結(jié)構(gòu)經(jīng)MS確認(rèn)。本研究建立的阿基瑞林固相合成方法在常溫下進(jìn)行，氨基酸及縮合劑投料為4倍投料，反應(yīng)時(shí)間2h，HPLC純度為64.5%。本研究結(jié)果可為阿基瑞林的固相合成研究提供一種可行的方法。

[1]杜登學(xué),王姍姍,周磊.肽類在化妝品中的應(yīng)用[J].山東輕工業(yè)學(xué)院學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版),2012,26(1):35-39.

[2]郭建維,鐘星,徐曉健.藥妝品勝肽的合成及作用機(jī)制研究進(jìn)展[J].廣東工業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),2013,30(3):1-8.

[3]鐘星,郭建維,成秋桂.勝肽在化妝品行業(yè)的應(yīng)用和最新進(jìn)展[J].日用化學(xué)品科學(xué),2013,35(11):35-38.

[4]朱亮亮,繩則翠,陳英文.沈樹寶含有困難氨基酸序列Arg-Arg的醋酸阿基瑞林的固相合成及其動(dòng)力學(xué)研究[J].高?；瘜W(xué)工程學(xué)報(bào),2013,27(5):791-797.

[5]王立暉,袁永俊,李婭奇.生物活性多肽制備與純化的研究進(jìn)展[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué),2012,40(14):8021-8023.

(技術(shù)方法欄目編輯:張 健)

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1004-6879(2014)05-0420-02

2014-03-12)