張禾璇，單可人，何 燕，張 婷，王嬋娟，官志忠

（1.貴州省婦幼保健院優(yōu)生遺傳科，貴陽550001；2.貴州省醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴陽550004）

細(xì)胞轉(zhuǎn)染技術(shù)是采用一定的途徑將外源分子導(dǎo)入細(xì)胞、表達(dá)目的基因的過程。細(xì)胞轉(zhuǎn)染載體有病毒載體和非病毒載體兩大類。病毒載體轉(zhuǎn)染效率高，但由于其轉(zhuǎn)染具有免疫原性和致突變性限制了它的應(yīng)用；非病毒載體系統(tǒng)具有低毒、低免疫原性、轉(zhuǎn)移的核苷酸大小范圍廣和相對(duì)靶向性等優(yōu)點(diǎn)。當(dāng)用化學(xué)或物理方法轉(zhuǎn)染某些類型細(xì)胞效率不高或有毒性時(shí)，電穿孔可能是一種有用的方法[1-2]。目前，非病毒載體轉(zhuǎn)染法中運(yùn)用最廣泛的主要有陽離子脂質(zhì)體LipofectamineTM2000[3-4]和電穿孔法。選擇合適的細(xì)胞轉(zhuǎn)染方式，高效率質(zhì)粒轉(zhuǎn)染腫瘤細(xì)胞對(duì)于細(xì)胞生物學(xué)和分子生物學(xué)以及腫瘤防治等科學(xué)研究有十分重要的意義[5-6]。本研究分別采用脂質(zhì)體法和電穿孔法轉(zhuǎn)染人肝癌細(xì)胞株 HepG2、SGC7901／ADM細(xì)胞，并比較轉(zhuǎn)染效率，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 材料 HepG2、SGC7901／ADM細(xì)胞株均購自中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞庫；pcDNA3.1-EGFP質(zhì)粒由貴州省醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室周建獎(jiǎng)教授惠贈(zèng)。LipofectamineTM2000購自Invitrogen公司，電穿孔儀（美國(guó)Bio-rad Gene Pulser Xcell真核系統(tǒng)），Bio-rad 0.4cm電轉(zhuǎn)杯，電轉(zhuǎn)buffer（自配含10mmol／L HEPES，150mmol／L NaCl，5mmol／L CaCl2，6mmol／L葡萄糖pH 7.2的緩沖液）；Ezgene EndoFree Plasmid ezFlow Miniprep Kit購自Biomga公司；DMEM、磷酸鹽緩沖液（PBS）、胰蛋白酶、胎牛血清（FBS）購自Gibco公司，細(xì)胞培養(yǎng)器皿購自Corning公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) HepG2細(xì)胞培養(yǎng)液成分為高糖 DMEM（含10%FBS，1%雙抗）。SGC7901／ADM細(xì)胞培養(yǎng)液成分為RPMI 1640（含10%FBS，1%雙抗），在細(xì)胞培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)，每天換液，2～3d傳代1次。

1.2.2 細(xì)胞轉(zhuǎn)染 （1）脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法：完全培養(yǎng)基培養(yǎng)HepG2、SGC7901／ADM細(xì)胞，轉(zhuǎn)染時(shí)取傳代3次的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，以5×104個(gè)細(xì)胞接種至6孔板，每孔設(shè)2個(gè)復(fù)孔，加入1mL無抗性培養(yǎng)基，細(xì)胞貼壁密度為50%～80%時(shí)即可進(jìn)行轉(zhuǎn)染。將eGFP質(zhì)粒用相應(yīng)脂質(zhì)體LipofetamineTM2000轉(zhuǎn)染細(xì)胞（詳細(xì)步驟參見LipofetamineTM2000產(chǎn)品說明書）。（2）電穿孔轉(zhuǎn)染法：傳代3次的細(xì)胞長(zhǎng)滿70%～80%時(shí)可用于轉(zhuǎn)染，PBS沖洗3次，0.25%胰酶消化60s，完全培養(yǎng)基終止消化。收集細(xì)胞懸液后1 000r／min離心8min，棄上清液，用無血清培養(yǎng)液洗滌1次，離心后棄上清液，用電轉(zhuǎn)buffer重懸2次，以電轉(zhuǎn)buffer重懸細(xì)胞至1×107個(gè)／mL。取1×106個(gè)細(xì)胞懸液和pcDNA3.1-EGFP質(zhì)粒10μg分裝入0.4cm電轉(zhuǎn)杯中，小心混勻后4℃靜置10min，以1個(gè)電脈沖、脈沖時(shí)間20 ms、電壓270V方波電轉(zhuǎn)。電轉(zhuǎn)后培養(yǎng)于12孔板，電轉(zhuǎn)后轉(zhuǎn)移至37℃、含15%FBS的培養(yǎng)基培養(yǎng)，每孔設(shè)兩個(gè)復(fù)孔。

1.2.3 細(xì)胞存活率測(cè)定 兩種轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)中均設(shè)置未轉(zhuǎn)染的細(xì)胞為陰性對(duì)照，且各組細(xì)胞數(shù)量保持一致，完成轉(zhuǎn)染后培養(yǎng)8 h，胰蛋白酶消化各組細(xì)胞，以流式分析細(xì)胞計(jì)數(shù)，各轉(zhuǎn)染組細(xì)胞數(shù)與陰性對(duì)照細(xì)胞數(shù)的比值即轉(zhuǎn)染8h的細(xì)胞存活率。

1.2.4 轉(zhuǎn)染效率測(cè)定 電轉(zhuǎn)染后培養(yǎng)48h，借助綠色熒光標(biāo)志蛋白eGFP判斷轉(zhuǎn)染效率。用PBS洗滌貼壁細(xì)胞3遍后置顯微鏡下觀察，由于eGFP為綠色熒光，顯微參數(shù)為480nm激發(fā)波長(zhǎng)，520nm發(fā)射波長(zhǎng)。每孔共計(jì)5個(gè)高倍鏡視野觀察計(jì)算綠色熒光細(xì)胞數(shù)。轉(zhuǎn)染效率（%）＝綠色熒光細(xì)胞數(shù)／總細(xì)胞數(shù)×100%，取5個(gè)視野平均值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS18.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，計(jì)量資料以±s表示，組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 細(xì)胞存活率 重復(fù)3次以上實(shí)驗(yàn)，脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞存活率為（65.7±1.8）%，電穿孔法 HepG2細(xì)胞存活率為（38.5±2.4）%，二者比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染SGC7901／ADM 細(xì)胞存活率為（60.6±1.4）%，電穿孔法SGC7901／ADM 細(xì)胞存活率為（37.2±1.6）%，二者比較差異亦有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

2.2 細(xì)胞轉(zhuǎn)染率 重復(fù)3次以上實(shí)驗(yàn)，利用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染eGFP質(zhì)粒至HepG2細(xì)胞所獲得的陽性轉(zhuǎn)染率為（20.8±2.1）%，而電穿孔法轉(zhuǎn)染效率增高至（49.6±2.5）%，二者比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。利用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染eGFP質(zhì)粒至SGC7901／ADM 細(xì)胞所獲得的陽性轉(zhuǎn)染率為（25.4±1.3）%，而電穿孔法轉(zhuǎn)染效率增高至（52.6±2.1）%，二者比較差異亦有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

3 討 論

脂質(zhì)體法是通過脂質(zhì)雙分子層所構(gòu)成的囊狀載體包裹外源基因與細(xì)胞膜融合內(nèi)吞而完成外源基因的導(dǎo)入，該方法操作簡(jiǎn)便、細(xì)胞毒性低，但對(duì)細(xì)胞具有選擇性，轉(zhuǎn)染效率受細(xì)胞類型影響。電穿孔法是利用高強(qiáng)度的電場(chǎng)瞬時(shí)改變細(xì)胞膜的狀態(tài)和通透性，從而吸收周圍介質(zhì)中的外源分子進(jìn)入細(xì)胞，具有簡(jiǎn)單易行、可重復(fù)性強(qiáng)、安全性高、適用性廣等優(yōu)點(diǎn)[2]，但伴隨較高的細(xì)胞毒性。

本研究選取較大分子帶GFP綠色熒光蛋白的質(zhì)粒eGFP為轉(zhuǎn)染物，以常用的陽離子脂質(zhì)體LipofectamineTM2000和電穿孔兩種方法分別轉(zhuǎn)染HepG2、SGC7901／ADM細(xì)胞。脂質(zhì)體表面帶正電荷，與核酸中帶負(fù)電荷的磷酸根相互吸附形成脂質(zhì)體核酸復(fù)合物，該復(fù)合物能與細(xì)胞膜表面負(fù)電荷相互吸附，通過胞飲作用進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)[7-8]。利用脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染eGFP質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染效率為（20.8±2.1）%，這與朱曉瑩等[9]的結(jié)果相符，用于轉(zhuǎn)染時(shí)，脂質(zhì)體雖具有良好的膜親和性，但缺點(diǎn)在于其細(xì)胞毒性和低轉(zhuǎn)染效率性[10]。電穿孔法是利用外加電場(chǎng)產(chǎn)生一定的電脈沖，誘導(dǎo)活細(xì)胞產(chǎn)生跨膜電位，由于外加電場(chǎng)強(qiáng)度大于細(xì)胞膜穿孔的臨界值，引起細(xì)胞質(zhì)膜結(jié)構(gòu)暫時(shí)性改變，導(dǎo)致細(xì)胞膜形成可恢復(fù)的孔隙，細(xì)胞膜產(chǎn)生小孔，從而使外源基因進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)。相較脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染技術(shù)，電轉(zhuǎn)技術(shù)因較大的電壓刺激使得電轉(zhuǎn)后細(xì)胞的死亡率較高。有研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞存活率在50%左右時(shí)的電場(chǎng)參數(shù)可獲得最佳的轉(zhuǎn)染效率[11]。本研究結(jié)果顯示，脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染時(shí)細(xì)胞存活率較高，電穿孔轉(zhuǎn)染時(shí)細(xì)胞存活率雖然偏低，但是電穿孔法轉(zhuǎn)染可使上述兩種細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率均提高至50%左右，提示使用電穿孔法能明顯改善大片段載體低轉(zhuǎn)染效率的情況，這與江雪等[12]的觀點(diǎn)一致。

綜上所述，脂質(zhì)體LipofectamineTM2000更容易包裹吞入片段較小的轉(zhuǎn)染物，電穿孔法操作簡(jiǎn)單，能將DNA、RNA、抗體、酶等物質(zhì)轉(zhuǎn)入細(xì)菌、動(dòng)物細(xì)胞、植物細(xì)胞等，改善大片段載體低轉(zhuǎn)染效率的情況，更適合用于常規(guī)環(huán)狀質(zhì)粒轉(zhuǎn)染構(gòu)建工程細(xì)胞。

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