龍宇鵬 綜述，任 君審校

（中國人民解放軍第324醫(yī)院檢驗(yàn)科，重慶400020）

在妊娠期，Rh血型D抗原陽性胎兒的紅細(xì)胞可從胎盤漏出進(jìn)入RhD陰性的母體內(nèi)，促使其免疫系統(tǒng)產(chǎn)生的RhD抗體，并進(jìn)入胎兒循環(huán)并導(dǎo)致胎兒和新生兒發(fā)生同種異體的免疫反應(yīng)；在分娩時(shí)，大量的RhD陽性胎兒紅細(xì)胞可進(jìn)入母體，誘發(fā)RhD陰性血的母體對(duì)Rh因子產(chǎn)生抗體，在以后的妊娠中，這些抗體再通過胎盤進(jìn)入胎兒循環(huán)，攻擊胎兒的RhD陽性紅細(xì)胞，引發(fā)了胎兒和新生兒溶血?。╤emolytic disease of the fetus and newborn，HDFN），主要表現(xiàn)為溶血性貧血引發(fā)的胎兒水腫、黃疸、核黃疸以及胎兒宮內(nèi)死亡或新生兒死亡[1]。在孕晚期和分娩過程中，D抗原的風(fēng)險(xiǎn)最高，但D型的免疫反應(yīng)也可以發(fā)生在早孕和中孕期[2]。胎兒和新生兒溶血性疾病的治療取決于胎兒貧血的嚴(yán)重程度，而使用超聲多普勒測(cè)定大腦中動(dòng)脈的收縮期流速是確定胎兒貧血的一種安全、快速的方法。若病情較輕，胎兒可通過增加紅細(xì)胞生成來代償紅細(xì)胞的破壞。若病情進(jìn)一步加重則需要進(jìn)行宮內(nèi)輸血治療或剖宮產(chǎn)終止妊娠，胎兒出生后仍需要進(jìn)行血液交換或完全性的輸血治療。因此，D型免疫反應(yīng)是導(dǎo)致HDFN這一嚴(yán)重威脅胎兒和新生兒生命的疾病的主要原因。本文將對(duì)目前國內(nèi)外關(guān)于胎兒RhD的無創(chuàng)分型檢測(cè)的研究進(jìn)展及其在臨床的應(yīng)用作一綜述。

1 胎兒和新生兒溶血病研究進(jìn)展

在無免疫預(yù)防措施的20世紀(jì)50年代，HDFN的發(fā)病率高達(dá)1／2 200。到了20世紀(jì)60年代晚期，隨著新生兒預(yù)防性注射抗D免疫球蛋白的廣泛應(yīng)用，RhD陰性血婦女發(fā)生D抗原反應(yīng)的頻率從17%降到1%左右。后來又有研究認(rèn)為，胎兒出生前進(jìn)行預(yù)防性抗D治療可以將免疫反應(yīng)降至0.2%[3]。因此現(xiàn)在普遍采用多次產(chǎn)前結(jié)合產(chǎn)后預(yù)防性注射免疫球蛋白將免疫反應(yīng)的風(fēng)險(xiǎn)降到最低，產(chǎn)前可以在孕28～29周時(shí)單次注射250～300μg或選擇在孕29、34周時(shí)分別注射150μg免疫球蛋白；而出生后的預(yù)防通常在出生后72h內(nèi)給予單次注射。以往RhD陰性血的孕婦應(yīng)常規(guī)在分娩前進(jìn)行預(yù)防性治療，因?yàn)樘旱难椭敝脸錾蟛拍艽_定。但在歐洲血統(tǒng)的人群中，有40%的RhD陰性孕婦所懷胎兒也是RhD陰性，因此這部分患者不存在D抗原免疫的風(fēng)險(xiǎn)，造成了一定程度的過度治療[3]。

隨著非侵入性產(chǎn)前診斷技術(shù)的發(fā)展，出現(xiàn)了母體血中無細(xì)胞的胎兒游離DNA（cell-free fetal DNA，cffDNA）的無創(chuàng)分析策略，使胎兒RhD血型可以在出生前得到準(zhǔn)確的預(yù)測(cè)，預(yù)防性免疫球蛋白的治療也更具靶向性。目前這一篩查技術(shù)已經(jīng)在歐洲乃至全球鋪展開來，并且在丹麥、荷蘭、芬蘭、比利時(shí)、瑞士、法國和英國等國胎兒RhD分型已經(jīng)成為產(chǎn)前檢查的常規(guī)項(xiàng)目[3]。也有一些國家將胎兒RhD分型作為RhD陰性孕婦的監(jiān)測(cè)項(xiàng)目。

2 RhD血型的特點(diǎn)及臨床應(yīng)用

Rh血型系統(tǒng)由兩個(gè)基因組成，均位于1號(hào)染色體上且位置接近（1p34-36.2），均含有10個(gè)外顯子，并有94%的序列相同。RhD基因編碼的RhD蛋白上攜帶有D抗原（RH1），RHCE基因編碼的RhCE蛋白上攜帶有C或c、E或e抗原（RH2-5）。目前為止，Rh血型系統(tǒng)中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)50多種抗原，251個(gè)RhD等位基因和123個(gè)RHCE等位基因。這種多態(tài)性增加了從RhD基因型中預(yù)測(cè)D表型的難度。

攜帶有功能性RhD基因的個(gè)體通常表現(xiàn)為D表型陽性。而引起D表型陰性的最常見原因就是RhD基因的缺失，這也成為RhD陰性孕婦胎兒RhD基因檢測(cè)的焦點(diǎn)。D陰性表型在不同人群中出現(xiàn)的頻率分別為：歐洲15%～17%、非洲5%、亞洲3%。在非洲人群中，D陰性的表型可能是由于基因缺失，也有約66%的人是攜帶不編碼功能的假基因；而不同的RhD等位基因表達(dá)的差異較大，可表現(xiàn)為不表達(dá)、弱表達(dá)或部分表達(dá)D抗原的類型，因此存在RhD基因型的個(gè)體并不一定都有D陽性的表型，約有0.2%～1.0%的歐洲人群為D抗原弱表達(dá)，部分D表達(dá)的人則更少[4]。還有一類表型是DEL型，即只有在抗D抗體吸收和洗脫后才能檢測(cè)到RhD表型，這類表型在亞洲人較為常見，在歐洲人群較少，僅占1／350～1／2 000[5]。攜帶有D抗原部分表達(dá)基因型的孕婦也應(yīng)被歸為D陰性人群，并接受預(yù)防性治療，因?yàn)檫@類患者也可能與D陽性的胎兒產(chǎn)生免疫反應(yīng)[6]。由此可見，帶有以上的這些RhD基因型的孕婦，其胎兒RhD基因檢測(cè)的復(fù)雜性顯著地升高。

3 母血中的胎兒游離DNA及臨床檢測(cè)

胎盤合體滋養(yǎng)層含有細(xì)胞滋養(yǎng)細(xì)胞來源的胎兒細(xì)胞核，合體滋養(yǎng)層發(fā)生凋亡后可釋放大量的凋亡小泡進(jìn)入母體外周循環(huán)，小泡中包含的胎兒有核細(xì)胞的DNA片段會(huì)隨著小泡的溶解、破裂而混入母血中，形成cffDNA。自從1997年在母體循環(huán)中發(fā)現(xiàn)cffDNA以來，國內(nèi)外的眾多研究團(tuán)隊(duì)均聚焦于這一領(lǐng)域，并在1998年創(chuàng)立了針對(duì)RhD陰性孕婦的“基于非侵入性實(shí)時(shí)PCR的胎兒RhD基因檢測(cè)”技術(shù)。但cffDNA的生物學(xué)功能還遠(yuǎn)未闡明。

母血中cffDNA的主要特點(diǎn)是高度碎片化，通常為小于200bp的核酸片段；母血中的cffDNA的出現(xiàn)較早，在孕4～5周時(shí)即可檢測(cè)到，但水平極低，直到孕7周以后才較為穩(wěn)定，需到孕10～11周才能達(dá)到臨床檢測(cè)的標(biāo)準(zhǔn)。而且在整個(gè)孕期母血中cffDNA的水平均較低，波動(dòng)在1～1 000copy／mL，從早孕期的20～25copy／mL開始逐漸升高，在中孕期含量約為32 copy／mL，直至晚孕期接近1 000copy／mL才較為容易檢測(cè)，分娩后1～2d即消失[7]。母血中cffDNA的水平波動(dòng)和變異較大，主要是由于容易受到DNA提取方法、檢測(cè)技術(shù)、定量和定性手段等因素的影響，但根本的原因還是母血中cffDNA水平較低[8]。

實(shí)時(shí)熒光定量PCR（RT-PCR）法是目前胎兒RhD分型的主要技術(shù)[9]，其他用于分析cffDNA的方法包括：基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時(shí)間質(zhì)譜（MALDI-TOF MS）[10]、數(shù)字 PCR（digital PCR）和新一代測(cè)序技術(shù)（NGS）[11]。對(duì)于胎兒 RhD分型而言，母血中cffDNA的低水平所導(dǎo)致的最嚴(yán)重風(fēng)險(xiǎn)就是檢測(cè)結(jié)果的假陰性。此外，由于母體血漿cffDNA在孕早期很難檢測(cè)到，因此在早孕期檢測(cè)假陰性的風(fēng)險(xiǎn)最大，但中孕和晚孕期也有假陰性出現(xiàn)[6]。對(duì)于臨床母血cffDNA的檢測(cè)，最關(guān)鍵的是要確保檢測(cè)方法的高穩(wěn)定性和高敏感性以避免假陰性結(jié)果出現(xiàn)，必須注意以下幾點(diǎn)：（1）保證全血和血漿中胎兒DNA的穩(wěn)定；（2）保證DNA的高提取率；（3）保證足量的胎兒DNA可用于分析檢測(cè)。另外，母血中胎兒DNA的水平還受到運(yùn)輸、處理、離心和保存等分析前的條件影響，必須嚴(yán)格操作。

既往研究表明，cffDNA在母體全血和血漿中均非常穩(wěn)定，并可以在EDTA管中進(jìn)行數(shù)天的運(yùn)輸，而不影響胎兒RhD分型的實(shí)時(shí)PCR檢測(cè)結(jié)果。cffDNA對(duì)環(huán)境溫度的適應(yīng)性也較好，血樣可在室溫或4℃中保存或運(yùn)輸多日而不影響DNA水平。長時(shí)間的儲(chǔ)存和運(yùn)輸可導(dǎo)致母體DNA的升高，同時(shí)cffDNA比例下降，但這并不會(huì)對(duì)基于RT-PCR的胎兒RhD檢測(cè)法造成負(fù)性的影響[12]。DNA的高提取率可以通過多種DNA提取方法實(shí)現(xiàn)，包括手工提取試劑盒（病毒核酸提取試劑盒、循環(huán)血核酸試劑盒等）和具有高提取度、高重復(fù)性、低誤差率的自動(dòng)DNA提取法[13-14]。為獲得足量的cffDNA，可以增加母血樣本的總量，目前的方法已經(jīng)可以達(dá)到使用1～4mL母體血漿檢測(cè)胎兒RhD血型的水平。檢測(cè)敏感性的增加與所用方法和策略密切相關(guān)，采用多個(gè)DNA作為靶標(biāo)（雙外顯子聯(lián)合法、多重標(biāo)記法等）可以顯著地增強(qiáng)測(cè)定的敏感性[14]。針對(duì)cffDNA碎片的特性，臨床檢測(cè)應(yīng)使用短的PCR擴(kuò)增子以獲得更多完整的模板DNA分子和更高的敏感性[15]。

4 胎兒RhD基因檢測(cè)策略

運(yùn)用PCR方法檢測(cè)RhD基因，需要擴(kuò)增D陽性的變體，也需要高特異性的檢測(cè)方法以區(qū)分RHCE。目前的檢測(cè)包括RhD的5、7和10號(hào)外顯子等多個(gè)靶點(diǎn)，可單獨(dú)檢測(cè)也可聯(lián)合檢測(cè)[16]。但多數(shù)學(xué)者均推薦至少檢測(cè)2個(gè)外顯子[17]。有研究采用4、5、6和10號(hào)外顯子的聯(lián)合檢測(cè)將RhD陰性、陽性與RhD假基因、RhD-CE-Ds變體進(jìn)行區(qū)分，其準(zhǔn)確率可達(dá)到100%[18]。但是單獨(dú)檢測(cè)5號(hào)或10號(hào)外顯子均有因該外顯子為陰性而出現(xiàn)假陽性的檢測(cè)結(jié)果[19]。也有胎兒RhD檢測(cè)策略是使用10號(hào)外顯子確定D抗原的變體，因?yàn)榇蠖鄶?shù)雜合型等位基因均在此處隱藏；這種策略雖容易增加假陽性的預(yù)測(cè)結(jié)果，但對(duì)于臨床診斷是必要的。另外，鑒于RhD基因頻率的分布因地域差異而變，因此不同的實(shí)驗(yàn)室必須根據(jù)實(shí)際情況和胎兒RhD分型的臨床目的（用于科學(xué)研究或人群篩查）設(shè)計(jì)檢測(cè)的具體策略以適應(yīng)當(dāng)?shù)氐奶厥馊巳篬20]。

5 免疫異常孕婦的胎兒RhD分型

如果D抗原陰性孕婦的胎兒為RhD陽性，則導(dǎo)致其出現(xiàn)免疫異常，發(fā)生D型免疫反應(yīng)的風(fēng)險(xiǎn)較大。因此，正確地評(píng)估這些孕婦發(fā)生D型免疫反應(yīng)的風(fēng)險(xiǎn)對(duì)于這些孕婦的管理非常重要。若胎兒為RhD陽性，則需接受相應(yīng)的監(jiān)測(cè)和治療；若為陰性則可以免受不必要的治療。在全世界范圍內(nèi)，胎兒RhD分型都是一個(gè)綜合性的需要高精度結(jié)果的臨床服務(wù)項(xiàng)目?？傮w上，預(yù)測(cè)精確度和檢測(cè)敏感性在過去的15年中有了極大提高，從95%提高至接近100%，孕早期進(jìn)行產(chǎn)前預(yù)測(cè)的可靠性已達(dá)到較高水平[20]。而且，RhD陰性結(jié)果的檢出必須明確，盡量減少假陰性的出現(xiàn)。為了增加胎兒RhD表型的準(zhǔn)確性，常常采用多個(gè)外顯子同時(shí)檢測(cè)的策略[21]。在既往采用2種外顯子分型的研究中已經(jīng)得到了較高的準(zhǔn)確性；此外，利用MALDI-TOF MS分析技術(shù)和早孕期的檢測(cè)方法等也均已經(jīng)得到了良好的檢測(cè)結(jié)果，但是假陰性的結(jié)果依然無法避免。

為了保證胎兒D陰性表型預(yù)測(cè)的質(zhì)量，可將通用的胎兒RhD陰性基因作為對(duì)照，也有利用多態(tài)性的標(biāo)記結(jié)合Y染色體分析，或利用單核苷酸多態(tài)性進(jìn)行分析。有研究認(rèn)為，RASSF1A基因啟動(dòng)子甲基化BstUI抗性可能會(huì)成為cffDNA分析的可靠對(duì)照而廣泛應(yīng)用。但胎兒對(duì)照組必須與檢測(cè)目標(biāo)的敏感性在總體上相一致。有些研究為了保證檢測(cè)質(zhì)量，排除母體RhD基因變異對(duì)胎兒檢測(cè)結(jié)果的掩蓋，分別在不同孕周抽取血樣進(jìn)行獨(dú)立檢測(cè)。也有研究者采用兩個(gè)RhD外顯子檢測(cè)聯(lián)合總DNA作為DNA提取技術(shù)的對(duì)照。另外，數(shù)字化PCR近年來也應(yīng)用于母血含有RhD變體的檢測(cè)中，而且，數(shù)字化PCR、NGS等新興技術(shù)可以克服傳統(tǒng)RhD分型技術(shù)的局限，具有潛在的開發(fā)價(jià)值。為了達(dá)到臨床應(yīng)用和推廣的目的，檢測(cè)RhD的相關(guān)工作強(qiáng)度也必須符合常規(guī)的臨床檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)[22]。

與檢測(cè)孕婦RhD血型不同，產(chǎn)前胎兒的RhD分型主要的研究目標(biāo)就是降低假陰性率，而假陽性的結(jié)果不會(huì)導(dǎo)致嚴(yán)重的臨床后果。作為篩查方案，必須采用高成本效率、高樣本處理量和快速的檢測(cè)方法。按照目前的RHD篩查經(jīng)驗(yàn)，僅有極少數(shù)研究結(jié)果中出現(xiàn)了假陰性，且這些結(jié)果的出現(xiàn)并非由于母體血cffDNA的低水平，而是樣本中混入雜質(zhì)或處理失誤所致[23]。

6 胎兒RhD分型與產(chǎn)前治療方案

對(duì)于胎兒D抗原弱表達(dá)的孕婦，可以歸為RhD陽性胎兒組，也可歸為結(jié)果不明確組，在初診時(shí)預(yù)防性使用抗D抗體進(jìn)行治療；但1～3型的弱陽性孕婦可以不必進(jìn)行治療[24]。對(duì)于攜帶有RhD假基因的孕婦也應(yīng)按照上述方法歸類并進(jìn)行預(yù)防性治療，并根據(jù)這些基因變體的頻率涉及適當(dāng)?shù)姆桨?，盡量排除不需治療的個(gè)體。既往研究顯示，有約0.3%～2.3%的孕婦因檢測(cè)結(jié)果假陽性或歸為結(jié)果不明確組而接受了原本不需要的預(yù)防性治療，針對(duì)這部分患者的正確診斷仍有提升空間[3]。

胎兒RhD分型陽性的孕婦，產(chǎn)前靶向預(yù)防性治療方案的實(shí)施需要一大群衛(wèi)生專業(yè)人員的參與，包括專科醫(yī)師、通科醫(yī)師、助產(chǎn)士、實(shí)驗(yàn)室技術(shù)人員的工作和衛(wèi)生管理機(jī)構(gòu)的認(rèn)可，參與者之間的通力協(xié)作對(duì)于方案的成功至關(guān)重要。越來越多的研究提示：高依從性是治療項(xiàng)目實(shí)施和成功避免D抗原免疫反應(yīng)的關(guān)鍵因素[23]。

然而，對(duì)于出生后的新生兒，臍帶血血型檢測(cè)原本是一種更加安全、廉價(jià)的RhD分型方法，同時(shí)也可以作為產(chǎn)前胎兒RhD分型結(jié)果不可信或不明確時(shí)的一種有效補(bǔ)救措施，但是最近在荷蘭、丹麥等國被停用，其原因一方面是因?yàn)橐呀?jīng)有研究顯示其不能成為篩查結(jié)果的一個(gè)精確的標(biāo)記，另一方面是其質(zhì)量控制和保障尚不完善。美國國家生物標(biāo)準(zhǔn)和控制研究所（National Institute for Biological Standards and Control，NIBSC）已經(jīng)制定了血漿的臨床生物檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)，規(guī)范的cffDNA檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)尚未完成[25]。

7 小結(jié)與展望

綜上所述，無創(chuàng)胎兒RhD分型技術(shù)是建立在cffDNA高度自動(dòng)化、高敏感性檢測(cè)的基礎(chǔ)上，使用多種外顯子作為檢測(cè)靶點(diǎn)以降低假陰性率，必將發(fā)展成一種穩(wěn)定的常規(guī)篩查方法，用以指導(dǎo)產(chǎn)前預(yù)防性治療。在其廣泛應(yīng)用的過程中可從多個(gè)方面進(jìn)行成本和耗費(fèi)控制水平的提升：（1）采用簡單、廉價(jià)、有效的方法提高檢測(cè)敏感性，降低篩查的整體費(fèi)用；（2）采用多種自動(dòng)或手動(dòng)的措施，降低假陰性率，減少不必要的產(chǎn)前治療費(fèi)用；（3）取代其他高成本的篩選或檢測(cè)技術(shù)，獲得更多的衛(wèi)生經(jīng)濟(jì)學(xué)效益；（4）在孕早期進(jìn)行確診性篩查，及早發(fā)現(xiàn)RhD血型信息及其他免疫反應(yīng)條件的信息，進(jìn)行早期預(yù)防，節(jié)約后期治療成本；（5）應(yīng)用于 HDFN相關(guān)的其他同類血型抗原（Rhc、RhE、Kell、HPA等）的評(píng)估和檢測(cè)體系中，減少其他抗原分型的研究和診治成本。因此基于cffDNA的無創(chuàng)RhD血型檢測(cè)技術(shù)是一項(xiàng)極具研究價(jià)值和臨床價(jià)值的重要方法。

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