張緣緣，邱軍強(qiáng)，周越洋，吳 方，張慶華

(1. 上海海洋大學(xué)水產(chǎn)與生命學(xué)院 省部共建水產(chǎn)種質(zhì)資源發(fā)掘與利用教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 上海 201306；2. 上海交通大學(xué) 系統(tǒng)生物醫(yī)學(xué)研究院，上海 200240)

帕金森病(Parkinson′s Disease，PD)是一種中老年常見的神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，且疾病發(fā)生目前呈年輕化趨勢[1]?，F(xiàn)有的治療藥物和手術(shù)方法等都不能根治此疾病[2]。帕金森病病理的重要特征是患者黑質(zhì)紋狀體中多巴胺能神經(jīng)元(dopaminergic neurons)大量變性丟失并伴有神經(jīng)遞質(zhì)多巴胺的缺失，現(xiàn)有的藥物主要通過提高神經(jīng)中樞的黑質(zhì)紋狀體通路中多巴胺的含量來維持多巴胺與乙酰膽堿的動態(tài)平衡[3-4]。

多巴胺不能透過血腦屏障，故直接口服或者靜脈注射不能補(bǔ)充腦內(nèi)缺少的多巴胺[5]。左旋多巴(L-Dopa)作為多巴胺合成前體可通過氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)透過血腦屏障進(jìn)入腦內(nèi)，但其在外周組織中被多巴脫羧酶(DDC)大量地降解，只有約口服用藥量1%的左旋多巴能夠到達(dá)腦內(nèi)并被多巴胺神經(jīng)元攝取后轉(zhuǎn)而變?yōu)槎喟桶钒l(fā)揮替代治療作用[6]。因此，臨床上抑制外周多巴脫羧酶的活性是十分必要的，左旋多巴和多巴脫羧酶抑制劑的聯(lián)合用藥是治療的常用方法[7-8]。多巴脫羧酶是一種維生素B6依賴酶。不僅可以催化多巴產(chǎn)生多巴胺，色氨酸產(chǎn)生色胺，也能催化5-羥基色氨酸產(chǎn)生5-羥基色氨。目前研究還發(fā)現(xiàn)多巴脫羧酶和高血壓、抑郁、失眠、厭食等疾病相關(guān)。多巴脫羧酶已知的抑制劑主要是其底物多巴的肼類衍生物(hydrazine)，其中以甲基多巴肼(Carbidopa)為代表。這類化學(xué)物的抑制機(jī)理是通過它們的肼基不可逆地與多巴脫羧酶輔酶維生素B6形成共價鍵，從而抑制其活性。雖然多巴類似物的肼類衍生物已被作為藥物在臨床上使用，但它們對多巴脫羧酶的特異選擇性不好[9]。

穩(wěn)定血漿中左旋多巴濃度、延長其半衰期來增加腦內(nèi)紋狀體多巴胺含量的藥物成為近年來帕金森病藥物研究的熱點(diǎn)之一[8, 10]。多巴脫羧酶的抑制劑可以通過抑制外周組織中多巴脫羧酶的活力從而降低左旋多巴在外周組織的降解，提高其生物利用率和藥學(xué)治療效果。因此發(fā)現(xiàn)新型特異的多巴脫羧酶抑制劑具有重要的理論和實(shí)際價值。

目前，多巴脫羧酶的測活方法主要是同位素標(biāo)記、熒光和Elisa等，還沒有報道適合高通量篩選抑制劑的方法。本文將擬建立一種高通量篩選多巴脫羧酶特異抑制劑的模型，為帕金森病以及其它疾病的治療提供新型的藥物先導(dǎo)化合物。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 質(zhì)粒和菌株

載體：pET28b實(shí)驗(yàn)室保存；DNA：多巴脫羧酶基因(BC008366)購于美國Proteintech公司；磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PEPC)：大腸桿菌基因組克隆獲得；菌株：大腸桿菌(BL21)感受態(tài)由作者實(shí)驗(yàn)室自制。

1.1.2 試劑

PCR純化、膠回收純化以及DNA小抽試劑盒購自Axygen生物科技有限公司，KOD-plus neo購自TOYOBO公司，DNA Marker、限制性核酸內(nèi)切酶(NdeⅠ，HindⅢ)、T4 DNA連接酶等購自寶生物(TAKARA)公司，預(yù)染蛋白質(zhì)Marker購自Invitrogen公司，引物由上海生工合成，甲基多巴(Methyldopa)、牛血清白蛋白(BSA)和煙酰胺腺嘌呤二核苷酸還原態(tài)(NADH)購于上海生工；磷酸吡哆醛(PLP)和左旋多巴(L-Dopa)購于Sigma公司；磷酸烯醇式丙酮酸酯鹽(PPPA)購于Alfa Aesar公司；β-巰基乙醇和蘋果酸脫氫酶(MDH)購于Amresco公司。

1.1.3 儀器

多功能酶標(biāo)儀購于Biotek公司; 細(xì)胞壓力破碎儀購于英國Constant systems公司；BIAcore 3000型表面等離子共振(SPR)傳感器購于BIAcore公司。

1.2 方法

1.2.1 克隆和表達(dá)

1)基因的克隆。根據(jù)Genbank所提供的多巴脫羧酶(DDC)、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PEPC)基因序列設(shè)計引物(P1、P2、P3和P4)。分別在上游引入NdeⅠ酶切位點(diǎn)和保護(hù)堿基，下游引入HindⅢ酶切位點(diǎn)和保護(hù)堿基并且在DDC的N-端引入His標(biāo)簽(P1、P2)，在PEPC的N端和C端分別引入His標(biāo)簽(P3、P4)，引物序列為：P1：5′-TATATATAGCTAGCAACGCAAGTGAATTCCGAAGGAGAGGG-3′；P2：5′-AAATTTAAGCTTCTACTCCCTCTCTGCTCGCAGCACG-3′；P3：5′-TATATATAGCTAGCAACGAACAATATTCCGCATTGCG-3′； P4：5′-AAATTTAAGCTTTCAGTGGTGGTGGTGGTGGTGGCCGGTATTACGCATACCTGCCGC-3′

2)表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建。將PCR擴(kuò)增得到的DDC和PEPC基因產(chǎn)物,用NdeⅠ和HindⅢ雙酶切后連接到用同樣限制性內(nèi)切酶酶切的質(zhì)粒載體pET28b上，以獲得重組質(zhì)粒pET28b-DDC、pET28b-PEPC。

3)重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)。分別將重組質(zhì)粒pET28b-DDC、pET28b-PEPC轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞E.coliBL21(DE3)，獲得DDC和PEPC表達(dá)型重組大腸桿菌，挑取平板單菌落，接種于5 mL含50 μg/mL卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基，37℃，250 r/min振蕩過夜培養(yǎng)。將1 mL上述菌液接種到1 L含50 μg/mL卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基, 37℃,250 r/min振蕩培養(yǎng)直至菌液OD600=0.8后，加入異丙基硫代半乳糖苷(IPTG)至終濃度為100 μM，16℃過夜培養(yǎng)，離心后收集的菌體用PBS懸浮，細(xì)胞壓力破碎儀破胞，用12000 r/min離心30 min將菌體碎片去除。

4)重組蛋白的純化。取上述上清加到Ni-NTA柱中，孵育1 h,分別加入含有5 mM和50 mM咪唑PBS緩沖液洗雜，然后用8 mL的250 mM咪唑的PBS將蛋白洗脫下來，收集分裝并保存在-80℃。

5)SDS-PAGE電泳鑒定。經(jīng)IPTG誘導(dǎo)前后收集的菌液加入SDS凝膠上樣緩沖液，95℃加熱5 min，13000 r/min離心1 min后，從上清取20 μL在8%的SDS-PAGE進(jìn)行蛋白質(zhì)電泳，之后用考馬斯亮藍(lán)染色過夜，脫色后搖蕩過夜以消除背景，并記錄結(jié)果。

6)蛋白濃度的測定。蛋白濃度用BCA Protein Assay kit測定。

1.2.2 酶活測定

圖1 酶聯(lián)反應(yīng)原理

2)高通量篩選方法的構(gòu)建。基于上述酶聯(lián)反應(yīng)的測活方法，我們分別檢測了不同NADH濃度所對應(yīng)OD值。同時也測定了時間和pH值對此酶聯(lián)反應(yīng)的影響，最終構(gòu)建了一種高通量篩選多巴脫羧酶的方法。

首先，1 μL的DMSO(對照)或待檢測化合物加到384孔板，然后加入24.5 μL酶混合液，包括:65 mM Tris-HCl，65 mM NaCl，0.015%(w/v)BSA，5 mM MgCl2，7.2 mM 巰基乙醇，380 μM NADH，165 nM PEPC，50 μM PLP和142 nM DDC，pH值8.05(終濃度)。隨后，加入24.5 μL底物混合液，包括：65 mM Tris-HCl，65 mM NaCl，0.015%(w/v)BSA，5 mM MgCl2，7.2 mM 巰基乙醇，5 mM PPPA，10 U MDH 和0.75 mM L-Dopa(終濃度)，pH值8.05。最后用透明封板膜將384孔板封嚴(yán)，立刻用酶標(biāo)儀讀取0 min時數(shù)值OD0 min，37℃反應(yīng)1 h后，再讀取60 min數(shù)值OD60 min。

計算公式：

剩下活力(%)=

NaHCO3反應(yīng)模型：類似上述步驟，首先加1 μL的DMSO(對照)或待檢測化合物到384孔板，然后加入24.5 μL不含DDC的上述酶混合液，再加入24.5 μL用1.25 μM NaHCO3取代底物L(fēng)-Dopa的上述底物混合液。

劑量依賴性實(shí)驗(yàn)：化合物從200 μM開始倍比稀釋7個濃度，其他步驟如上所述。所有數(shù)據(jù)均獨(dú)立重復(fù)2次，每次實(shí)驗(yàn)樣品數(shù)為3(n=3)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果為：平均數(shù)±方差。

2 結(jié)果與分析

2.1 基因的克隆

a: M—DNA Marker； 1,2—PEPC PCR產(chǎn)物。 b: M—DNA Marker； 1,2—DDC PCR產(chǎn)物。

圖3 重組質(zhì)粒雙酶切驗(yàn)證

a: pET28b-DDC雙酶切驗(yàn)證(M—DNA marker；1、3—酶切DDC；2、4—未酶切DDC)。b: pET28b-PEPC雙酶切驗(yàn)證(M—DNA marker；1、3—酶切PEPC；2、4—未酶切PEPC)。

從大腸桿菌基因組中擴(kuò)增得到PEPC約2652 bp的基因片段，以及購買的DDC基因擴(kuò)增得來的約1964 bp的基因片段，PCR擴(kuò)增后經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳,結(jié)果顯示產(chǎn)物片段大小與預(yù)期相符(如圖2)。通過NdeⅠ和HindⅢ限制性內(nèi)切酶分別對PCR產(chǎn)物和pET28b載體質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切，再用T4 DNA連接酶將酶切后的PCR產(chǎn)物和pET28b載體連接后，獲得重組質(zhì)粒pET28b-DDC、pET28b-PEPC，經(jīng)雙酶切驗(yàn)證(如圖3)，分別得到了大小約為1964 bp、2652 bp的目的條帶，并且該基因經(jīng)測序驗(yàn)證，確定目的基因已經(jīng)成功連接到表達(dá)載體上。

2.2 基因在大腸桿菌的表達(dá)和純化

將重組質(zhì)粒pET28b-PEPC轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞E.coliBL21(DE3)，獲得PEPC表達(dá)型重組大腸桿菌BL21/pET28b-PEPC，將重組菌株誘導(dǎo)過夜表達(dá)，離心上清再經(jīng)Ni-NTA柱純化后，通過SDS-PAGE電泳結(jié)果(如圖4a)表明，純化得到了較純的目的蛋白(約98 kD)，并且250 mM咪唑洗脫的PEPC濃度最高(8泳道，圖4a)。我們在下面酶活測試實(shí)驗(yàn)中使用該洗脫組份的純酶作為測試反應(yīng)的偶聯(lián)酶。我們用相似方法提純得到了DDC純酶，且250 mM咪唑洗脫中純度較高且大小正確(約54 kD，2泳道，圖4b)，因此選用此提純后脫鹽的組份(1泳道，圖4b)去測試DDC的活力。

圖4 SDS-PAGE電泳分析重組蛋白的原核表達(dá)及純化

a：PEPC的原核表達(dá)及純化(m—蛋白Marker； 1—破包后上清； 2—過柱子流穿； 3—未經(jīng)誘導(dǎo)的PEPC； 4—誘導(dǎo)后的PEPC； 5—5 mM咪唑PBS緩沖液洗雜； 6—50 mM咪唑PBS緩沖液洗雜； 7—100 mM咪唑PBS緩沖液洗雜； 8—250 mM咪唑PBS緩沖液洗脫； 9—500 mM咪唑PBS緩沖液洗脫； 10—1000 mM咪唑PBS緩沖液洗脫)。b：DDC的原核表達(dá)(m—蛋白Marker；1—DDC洗脫組份去鹽后；2—250 mM咪唑PBS緩沖液洗脫后的純化DDC)。

圖5 不同濃度NADH對應(yīng)的OD值

2.3 測定酶活方法

由于NADH在340 nm處有最大吸收峰，而NAD+幾乎沒有吸收，因此我們檢測了不同NADH濃度對應(yīng)OD值，結(jié)果表明OD值和NADH濃度在0.1 mM～1 mM是線性關(guān)系(如圖5)。為了靈敏的檢測NADH的變化，我們選擇了NADH濃度約為380 μM、OD值約為1.1的點(diǎn)，作為酶聯(lián)反應(yīng)中所用的濃度。

根據(jù)L-Dopa與 DDC報道的Km值(～350 μM)[13]，我們選取底物L(fēng)-Dopa濃度為750 μM。檢測不同pH值和時間對酶活的影響，優(yōu)化得到最適反應(yīng)條件。結(jié)果(如圖6)表明，0 min時，OD值是1.1。反應(yīng)一段時間后，OD值下降，下降的值代表此酶促反應(yīng)的活力(也稱窗口)。pH值對酶活影響較為明顯，在堿性緩沖液中酶促反應(yīng)的窗口最大。而酶促反應(yīng)的時間延長，窗口也相應(yīng)變大，但會伴有NADH的自身水解。為了減少這一水解現(xiàn)象，我們選擇反應(yīng)時間60 min檢測酶活。

圖6 在不同pH值緩沖液中，不同時間DDC酶促反應(yīng)的酶活變化(OD340 nm)Fig 6 The activity of DDC in different pH buffer and different time(OD340 nm)

根據(jù)上述反應(yīng)條件的試驗(yàn)，最終確定了高通量篩選模型，即使用750 μM l-Dopa作為底物，Tris-HCl(pH值8)為反應(yīng)緩沖液，以380 μM NADH作為檢測發(fā)光試劑，在反應(yīng)時間60 min讀取測活結(jié)果(見實(shí)驗(yàn)方法)。 我們用已知的陽性化合物甲基多巴(Methyldopa)測試了這個新型的DDC測活方法[14]，結(jié)果表明Methyldopa可以抑制DDC的活性，其IC50在1200 μM左右。用1000 μM Methyldopa 做對照，計算此高通量篩選模型的Z-因子的值為～0.55，是在高通量篩選中可接受的范圍內(nèi)(>0.5，通常被認(rèn)為是合適高通量篩選模型)。

圖7 70個天然產(chǎn)物的抑制劑篩選(相對于DMSO的百分比)Fig 7 The high-thoughput screening of 70 natural products (DDC activity,% of DMSO)

2.4 高通量篩選方法的評價

利用建立的篩選方法初篩了70個天然化合物(如圖7)，主要來自國家小分子藥物中心、上海交通大學(xué)藥學(xué)院等單位。其中有11個化合物在200 μM濃度抑制率可以達(dá)到90%以上，我們再用這些化合物做復(fù)篩實(shí)驗(yàn)，從中分析是否在340 nm自身有吸收等干擾因素，并做了劑量依賴性實(shí)驗(yàn)，最終確定了2個化合物，即化合物SD-8和SD-48。

我們通過Biacore表面等離子共振儀對這2個化合物進(jìn)行分析，根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果擬合出SD-8和SD-48的解離常數(shù)KD分別為3.4×105和2.6×105，說明這2種化合物對DDC有結(jié)合作用。因此可以間接驗(yàn)證我們建立的高通量篩選模型的準(zhǔn)確性和科學(xué)性。

3 討論

左旋多巴和多巴脫羧酶抑制劑聯(lián)合用藥的替代療法已是帕金森病治療的經(jīng)典方法。因而發(fā)現(xiàn)新的特異有效的小分子抑制劑不僅能提供多巴脫羧酶相關(guān)疾病機(jī)理研究的特異性探針工具，還能為帕金森病及其他疾病的治療提供新型的藥物先導(dǎo)化合物。

文獻(xiàn)報道傳統(tǒng)的多巴脫羧酶的測活方法多是用高效液相色譜(HPLC)的方法檢測產(chǎn)生底物多巴胺的含量來評價化合物的抑制作用，但篩選出來的抑制劑的特異性不理想；或者用同位素14CO2標(biāo)記的方法，但這種方法的穩(wěn)定性不好，因此，這些方法都不適合對該酶進(jìn)行高通量(HTS)的檢測[15-16]，熒光、Elisa等方法成本相比較其它方法較高。本模型建立了一種高通量檢測CO2的方法，實(shí)現(xiàn)了多巴脫羧酶抑制劑高通量的篩選，相比較同位素標(biāo)記、熒光、Elisa等方法更加快速、微量、準(zhǔn)確。

天然產(chǎn)物是自然界生物通過自然選擇保留下來的，經(jīng)歷了千百萬年的進(jìn)化過程。它具有結(jié)構(gòu)多樣性、化學(xué)獨(dú)特性和類藥性。天然化合物比化學(xué)合成的化合物更容易形成先導(dǎo)藥物結(jié)構(gòu)，可以通過進(jìn)一步的結(jié)構(gòu)優(yōu)化得到藥物候選化合物，具有較經(jīng)濟(jì)的天然產(chǎn)物來源、毒副作用小等特點(diǎn)，是生物活性物質(zhì)和實(shí)用藥物發(fā)現(xiàn)的重要源泉。人類從大自然植物中發(fā)現(xiàn)治療疾病的藥物已經(jīng)有了長久歷史和成功經(jīng)驗(yàn)。古代“神農(nóng)嘗百草”發(fā)現(xiàn)了多種中草藥材，近代中國科學(xué)家陳克恢從麻黃植物中發(fā)現(xiàn)的麻黃堿(一種常用感冒等藥物的關(guān)鍵成分之一)，美國科學(xué)家Wall和Wani從中國南部一種特有的植物喜樹(Happy tree)發(fā)現(xiàn)的有關(guān)抗癌癥的藥物——喜樹堿等[17]，這些例子都可以用來證明來源于植物的天然產(chǎn)物在藥物研究和發(fā)展過程中的重要性。因此。我們建立的多巴脫羧酶抑制劑的高通量篩選模型，以及發(fā)現(xiàn)的具有多巴脫羧酶抑制作用的天然產(chǎn)物，可以為多巴胺相關(guān)疾病提供藥物候選物和疾病研究的小分子探針工具，對和多巴胺相關(guān)的疾病研究、治療和預(yù)防具有十分重要的意義。

綜上所述，我們建立的多巴脫羧酶抑制劑的高通量篩選模型和發(fā)現(xiàn)的具有多巴脫羧酶抑制作用的天然產(chǎn)物可以為帕金森病提供藥物候選物和疾病研究的分子探針工具，對和多巴胺相關(guān)的疾病治療和預(yù)防具有重要意義。

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