陳芳芳

（深圳市寶安區(qū)婦幼保健院，廣東 深圳 518000）

MMP-9在真菌感染合并胎膜早破胎膜組織中的表達及意義

陳芳芳

（深圳市寶安區(qū)婦幼保健院，廣東 深圳 518000）

胎膜早破；真菌感染；表達

胎膜早破（premature rupture of membranes，PROM）是指孕婦在臨產(chǎn)前胎膜發(fā)生破裂，包括足月胎膜早破和早產(chǎn)胎膜早破。PROM是影響孕婦及胎兒健康安全的常見妊娠并發(fā)癥之一。PROM占足月妊娠的10%，占早產(chǎn)的2%～3.5%[1,2]。發(fā)生胎膜破裂后由于其屏障作用消失，胎兒和羊水暴露，使圍生期孕產(chǎn)婦及胎兒的發(fā)病率、病死率升高。胎膜早破與多種因素有關(guān)，其中包括感染、炎癥等因素引起的絨毛膜羊膜炎對胎膜結(jié)構(gòu)的直接破壞。此外，胎膜本身結(jié)構(gòu)的改變以及細胞外基質(zhì)的破壞也是胎膜早破的重要原因[3]。

基質(zhì)金屬酶是一組能降解和破壞細胞外基質(zhì)的蛋白水解酶，其中基質(zhì)金屬酶-9（MMP-9）能裂解彈性蛋白纖維、連接蛋白和膠原（維持羊膜韌性的主要物質(zhì)），使局部胎膜抵抗張力的能力下降。胎膜組織中MMP-9表達增加是胎膜早破的重要獨立因素之一。本研究通過研究真菌感染合并胎膜早破患者胎膜組織中MMP-9的表達，探討真菌感染造成胎膜早破的可能機制。

1 材料與方法

1.1 胎膜早破的診斷標準：參照豐有吉主編的《婦產(chǎn)科學》，人民衛(wèi)生出版社出版，2005年。

1.2 病例選擇和實驗分組：選擇2011年1月至2012年6月在本院產(chǎn)科住院的真菌性陰道炎并發(fā)胎膜早破患者32例，平均孕周為（36.4±4.1）周，平均年齡（27.3±5.2）歲。選取同期住院有剖宮產(chǎn)指征而選擇性剖宮產(chǎn)的病例（在剖宮產(chǎn)前無臨產(chǎn)癥狀，無胎膜早破）30例為對照組，平均孕周為（35.7±4.3）周，平均年齡為（25.2±4.8）歲。

1.3 標本處理方法：胎盤娩出后，立即在距胎膜破口5 cm處取2.0 cm× 10.0 cm胎膜標本制成胎膜卷，即刻置10%福爾馬林溶液中固定。經(jīng)脫水，石蠟包埋后切片。切片置于60 ℃烤箱過夜，常規(guī)脫蠟至水，予以高溫高壓組織抗原修復后，常規(guī)HE染色和免疫組化染色。MMP-9抗體為多克隆抗體，購于Santa-Cruz公司。免疫組化實驗設(shè)陰性對照和陽性對照，陰性對照為TBS緩沖液代替一抗，MMP-9陽性片為乳腺癌腫瘤組織切片。

1.4 絨毛膜羊膜炎診斷標準：胎膜病理切片HE鏡檢，急性絨毛膜羊膜炎分期采用2003年Redline提出新的絨毛膜羊膜炎分期方案，Ⅰ期（早期）：母體中性粒細胞位于絨毛膜板下纖維蛋白中和（或）胎膜的蛻膜層與絨毛膜交界處。Ⅱ期（中期）：中性粒細胞位于絨毛膜板的結(jié)締組織和胎膜的絨毛膜羊膜中。Ⅲ期（晚期）：壞死性絨毛膜羊膜炎。羊膜基底膜過度紅染，中性粒細胞核碎解、壞死及羊膜上皮細胞脫落。

1.5 血清MMP-9含量檢測：所有孕婦入院時抽取靜脈血5 mL，置-20 ℃冰箱內(nèi)保存供檢測使用。采用ELISA方法檢測血清MMP-9含量。

1.6 免疫組化結(jié)果判定標準：MMP-9定位于細胞胞質(zhì)，其免疫組化陽性表現(xiàn)為細胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒。

具體陽性評分方法和標準如下：觀察陽性表達最強的一個高倍鏡視野中的所有細胞，記錄胎膜細胞呈陽性染色細胞百分數(shù)（%）并計分。陰性：胎膜細胞顯色與背景一致，無目標細胞染色，計0分；陽性＋：1%～25%，1分；陽性＋＋：26%～50%，2分；陽性＋＋＋：51%～75%，3分；陽性＋＋＋＋76%～100%，4分。

讀片時采用雙盲計分，為避免同一張片子不同區(qū)域染色程度不一樣，選擇10個高倍鏡視野，取結(jié)構(gòu)良好，染色均勻的中間值。

1.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計處理：免疫組化評分采用均值±標準差來表示，應用SPSS13.0統(tǒng)計軟件，選擇兩總體方差不齊的兩樣本t檢驗對資料加以統(tǒng)計分析。

2 結(jié) 果

2.1 真菌感染合并胎膜早破的胎膜組織表現(xiàn)嚴重的絨毛膜羊膜炎：所有標本經(jīng)常規(guī)病理切片并HE染色后觀察，結(jié)果表明：真菌感染會引起胎膜組織出現(xiàn)嚴重的的絨毛膜羊膜炎（圖1），主要表現(xiàn)為：胎膜中可見大量炎性細胞浸潤，胎膜組織結(jié)構(gòu)受到破壞。真菌感染組32例患者中，21例為急性絨毛膜羊膜炎Ⅲ期，7例為急性絨毛膜羊膜炎Ⅱ期，4例為急性絨毛膜羊膜炎Ⅰ期。對照組30例患者中，3例為急性絨毛膜羊膜炎Ⅰ期，27例絨毛膜羊膜未見中性粒細胞浸潤（表1）。

圖1 胎膜早破組織HE染色結(jié)果，可見存在不同程度的絨毛膜羊膜炎（A為Ⅰ期；B為Ⅱ期；C為Ⅲ期）

表1 真菌感染組與對照組胎盤胎膜病理結(jié)果

2.2 胎膜早破患者血清MMP-9升高：在本研究中，血清MMP-9含量用ELISA法進行評價，結(jié)果表明胎膜早破組血清MMP-9含量（697.5 pg/mL）明顯高于對照組（278.6 pg/mL），差異有顯著性（t=15.67，P=0.000），表明真菌感染會激活MMP-9表達，使其在體內(nèi)的含量增加。

表2 兩組血清MMP-9含量比較

2.3 MMP-9在胎膜組織中的表達：局部胎膜組織中的MMP-9表達采用免疫組化的方法進行檢測。MMP-9主要在胎膜中的羊膜上皮、絨毛膜上皮及間質(zhì)細胞中表達，其中陽性信號位于胞質(zhì)內(nèi)，呈棕黃色顆粒（圖2）。

圖2 MMP-9在胎膜組織中的表達（A為胎膜早破組；B為對照組）

免疫組化評分的結(jié)果顯示（表2），真菌感染合并胎膜早破的胎膜組織中，MMP-9的陽性表達（4.78±1.09）明顯高于對照組的胎膜組織（2.43±0.80），差異有顯著性（t=9.62，P=0.000），表明真菌感染能誘導MMP-9在局部胎膜組織中的高表達，這可能是真菌感染后，胎膜早破發(fā)生率增加的原因之一。

表2 MMP-9在對照組和胎膜早破組表達差異

3 討 論

在懷孕過程中，胎膜可以使羊膜腔保持相對隔離的無菌狀態(tài)，為胎兒的生長發(fā)育提供穩(wěn)定的內(nèi)環(huán)境。并且，隨著孕程延續(xù)，胎膜會出現(xiàn)相應的變化以適應逐漸增長的胎兒和子宮。近年來，研究者對胎膜早破的原因進行了多方位的探討。目前公認的觀點認為PROM應該是多因素、多途徑共同作用的結(jié)果。

其中，感染是造成胎膜早破的重要原因，包括細菌感染[4]、支原體衣原體感染[5]及真菌感染，其中上行性感染又為最常見的感染途徑。微生物局部生長繁殖直接對胎膜組織的破壞及微生物刺激局部多種炎性介質(zhì)的分泌進而出現(xiàn)絨毛膜羊膜炎是引起胎膜早破的重要原因，此外，感染還可以通過其他方式誘導產(chǎn)生胎膜早破，如上調(diào)MMP–9的表達。

基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）是一組能降解細胞外基質(zhì)的內(nèi)肽酶。MMPs是一個大家族，同一種MMP可降解多種細胞外基質(zhì)成分，而某一種細胞外基質(zhì)又同時是多種MMPs的作用底物。其中，研究較為透徹的是MMP-9。在分娩啟動前，宮頸處胎膜中MMP-9的活性顯著升高，提示MMP-9參與胎膜中膠原的程序性溶解過程[3]。在分娩后，孕產(chǎn)婦羊水和胎膜中MMP-9的表達也明顯增高，且胎膜中Ⅳ型膠原含量明顯下降，提示了MMP-9可能是胎膜破裂發(fā)生的重要生理基礎(chǔ)[6]。因而，當MMP-9異常表達過度時，會導致細胞外基質(zhì)降解加快，導致胎膜強度、韌性下降，胎膜結(jié)構(gòu)弱化，誘發(fā)出現(xiàn)胎膜早破。

本研究比較了真菌感染合并胎膜早破組與對照組（沒有發(fā)生胎膜早破病例）的血清MMP-9水平、胎膜組織MMP-9的表達及絨毛膜羊膜炎的嚴重程度。結(jié)果表明在妊娠過程中發(fā)生陰道真菌感染會導致胎膜出現(xiàn)嚴重的絨毛膜羊膜炎，并上調(diào)MMP-9在局部胎膜組織的表達。同時，在患者血清中也檢測到MMP-9含量增加。這些結(jié)果表明，真菌感染除了直接刺激胎膜組織出現(xiàn)炎性損傷，還可通過某種途徑增加MMP-9的表達，多種炎性介質(zhì)可能參與了之一過程。

在正常生理情況下，MMP-9在體內(nèi)的合成、分泌、降解均處于機體嚴格調(diào)控下，其在體內(nèi)的分布和含量具有組織特異性。研究表明，炎癥過程中的多種炎性因子如白細胞介素8、腫瘤壞死因子等可誘導MMP-9合成[7]。而MMP-9也可以激活白細胞介素8的表達，二者呈正性反饋調(diào)節(jié)[7]。MMP-9表達增高與炎性進展相互推動、相互促進，最終造成胎膜組織破壞。

胎膜早破是嚴重危害圍生期孕產(chǎn)婦及胎兒的健康安全的重要因素。目前認為，多種因素參與到PROM的發(fā)生過程中。本研究探討了真菌感染導致胎膜早破的機制，我們認為感染所致的炎性變化與MMP-9表達的上調(diào)是導致PROM發(fā)生的原因。此外，MMP-9表達增加，降解胎膜細胞外基質(zhì)結(jié)構(gòu)，從而破壞胎膜的完整性、韌性和強度。我們認為，上述過程可能是多種因素造成胎膜早破發(fā)生的最終通路和直接原因。

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R714.4

：B

：1671-8194（2014）31-0075-02

深圳市寶安區(qū)科技計劃社會公益項目（項目名稱：外陰陰道念珠菌病與胎膜早破的關(guān)系及預防應用抗生素對妊娠結(jié)局的影響，編號為2010542）