郝鳳奇,李景梅,李成玉,楊桂連

(1 長春理工大學(xué) 生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院,吉林 長春 130022;2 吉林農(nóng)業(yè)大學(xué) 動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院,吉林 長春 130118)

乳酸菌是一類能利用可發(fā)酵性糖產(chǎn)生大量乳酸細(xì)菌的總稱，目前在自然界已發(fā)現(xiàn)的這類細(xì)菌，在分類學(xué)上至少有23個屬[1]，其中乳酸桿菌屬在食品、醫(yī)藥等領(lǐng)域應(yīng)用較多[2]。人類腸道和發(fā)酵乳制品中分離的乳酸桿菌被公認(rèn)為是“安全級”(Generally regarded as safe，GRAS)的微生物，具有益生特性，乳酸桿菌屬的某些菌株在腸道黏膜免疫調(diào)節(jié)中發(fā)揮著重要作用[3]。然而該菌屬種類繁多，對腸道細(xì)胞因子分泌、T細(xì)胞增殖、sIgA水平的影響也存在菌種間差異。因此，明確不同種類乳酸桿菌對腸道黏膜免疫的調(diào)節(jié)作用，特別是對輔助性T細(xì)胞(Th細(xì)胞)極化狀態(tài)的影響具有重要意義。

本試驗采用嗜酸乳酸桿菌(Lactobacillusacidophilus)和植物乳酸桿菌(Lactobacillusplantarum)灌胃C57BL/6小鼠，通過檢測脾臟和腸系膜淋巴結(jié)中T細(xì)胞亞群、結(jié)腸PP結(jié)中Toll樣受體2陽性(TLR2+)和Toll樣受體4陽性(TLR4+)細(xì)胞比例、結(jié)腸組織干擾素γ(IFN-γ)和白介素4(IL-4)水平、小腸sIgA水平等指標(biāo)，在細(xì)胞和分子水平上對2種乳酸桿菌的腸道黏膜免疫調(diào)節(jié)作用進(jìn)行了比較研究，以期為深入研究乳酸桿菌的免疫調(diào)節(jié)作用機(jī)制和信號傳導(dǎo)途徑提供有價值的參考，對乳酸桿菌應(yīng)用于功能性食品、保健品或新型動物腸道微生態(tài)制劑具有一定的指導(dǎo)意義。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 菌 株 本試驗所用嗜酸乳酸桿菌、植物乳酸桿菌由吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)動物微生態(tài)學(xué)實驗室保存。

1.1.2 培養(yǎng)基和主要試劑 乳酸桿菌MRS培養(yǎng)基；蛋白酶抑制劑混合物，購自羅氏公司；小鼠IFN-γ、IL-4、sIgA ELISA試劑盒，購自R&D公司；Anti-mCD3-FITC、Anti-mCD4-APC、Anti-mCD8-PE、Anti-mTLR2-FITC、Anti-mTLR4-PE單克隆抗體、FACS buffer，購自BD公司；RPMI1640培養(yǎng)基，購自Gibco公司。

1.1.3 Green-berger Lysis Buffer的配制 150 mmol/L NaCl，15 mmol/L Tris，1 mmol/L MgCl·6H2O，1 mmol/L CaCl2，1% Triton，使用時按1∶100(體積比)加入蛋白酶抑制劑混合物。

1.1.4 試驗動物 C57BL/6雌性小鼠，30只，體質(zhì)量18～22 g/只，購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司。

1.2 方 法

1.2.1 乳酸桿菌懸液的制備 采用MRS培養(yǎng)基，常規(guī)微生物培養(yǎng)方法分別培養(yǎng)嗜酸乳酸桿菌、植物乳酸桿菌菌種，待菌液OD600值為0.6～0.8時，4 ℃、6 000 r/min離心2 min，菌體沉淀用1×PBS(pH 7.4)清洗3次后，制成108CFU/mL菌體懸液。

1.2.2 試驗動物分組及處理 試驗小鼠平均分成3組(嗜酸乳酸桿菌組、植物乳酸桿菌組和對照組)，SPF條件下飼養(yǎng)，自由飲水和采食，12 h光照，12 h黑暗，小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)15 d后進(jìn)行正式試驗，正式試驗期7 d 。正式試驗期內(nèi)，嗜酸乳酸桿菌組、植物乳酸桿菌組小鼠分別灌胃嗜酸乳酸桿菌或植物乳酸桿菌菌體懸液1 mL/(只·d)、對照組小鼠灌胃等體積PBS液。各組小鼠每天清晨飼喂前稱體質(zhì)量。第8天，頸椎脫臼法處死小鼠，打開腹腔，無菌條件下取脾臟、腸系膜淋巴結(jié)、小腸、結(jié)腸PP結(jié)、結(jié)腸等組織用于指標(biāo)檢測。

1.2.3 脾臟、腸系膜淋巴結(jié)、結(jié)腸PP結(jié)細(xì)胞懸液的制備 將脾臟、腸系膜淋巴結(jié)、結(jié)腸PP結(jié)分別置于盛放有RPMI1640培養(yǎng)基的平皿中，注射器末端研磨后，過無菌篩網(wǎng)制成細(xì)胞懸液，4 ℃下2 000 r/min 離心5 min，棄上清，細(xì)胞沉淀用PBS洗滌2次，加入適量RPMI1640培養(yǎng)基計數(shù)。

1.2.4 流式細(xì)胞儀檢測 分別取1.2.3制備的各組織細(xì)胞懸液200 μL，加入2.0 mL FACS Buffer，1 500 r/min離心5 min，棄上清，細(xì)胞沉淀用PBS洗滌2次。細(xì)胞用FACS Buffer混勻，加入到Tube管中，調(diào)整細(xì)胞數(shù)量為106/管，每管加入10 μL熒光標(biāo)記抗體(CD3+CD4+和CD3+CD8+T細(xì)胞測定采用Anti-mCD3-FITC、Anti-mCD4-APC、Anti-mCD8-PE單克隆抗體；TLR2+和TLR4+細(xì)胞測定采用Anti-mTLR2-FITC、Anti-mTLR4-PE單克隆抗體)，4 ℃避光作用30 min，F(xiàn)ACS Buffer洗滌2次，最后溶于100 μL FACS Buffer 中，加入10 μL多聚甲醛固定，進(jìn)行BD流式細(xì)胞儀(Canto)檢測。

1.2.5 結(jié)腸組織IFN-γ和IL-4的測定 將摘除PP結(jié)的結(jié)腸組織在冰預(yù)冷的Green-berger Lysis Buffer中制成組織勻漿，采用ELISA試劑盒，按照說明書操作檢測IFN-γ和IL-4的含量。

1.2.6 腸道黏膜總sIgA水平的測定 取幽門下至回盲結(jié)合部約15 cm小腸腸段，縱行剪開，用無菌1×PBS(pH 7.4)緩慢沖洗腸腔后，刮取腸黏膜表面黏液層，收集于1.5 mL 無菌離心管中，加入0.5 mL無菌1×PBS(pH 7.4，含蛋白酶抑制劑混合物)混勻后，于4 ℃下12 000 r/min離心10 min，取上清，按照ELISA試劑盒說明書操作，測定腸道黏膜總sIgA水平。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

采用Graphpad Prism 6.0對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析并繪圖，結(jié)果用“平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，P<0.05為差異顯著，P<0.01為差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 各組小鼠體質(zhì)量變化

正式試驗結(jié)束時，對照組、嗜酸乳酸桿菌組和植物乳酸桿菌組小鼠體質(zhì)量分別為(20.19±0.48)、(20.55±0.45)、(19.77±0.31) g/只，各組小鼠體質(zhì)量無顯著差異(P>0.05)。

2.2 2種乳酸桿菌對小鼠脾臟和淋巴結(jié)中CD4+、CD8+T細(xì)胞比例的影響

由圖1可知，嗜酸乳酸桿菌組小鼠腸系膜淋巴結(jié)中CD3+CD4+、CD3+CD8+T細(xì)胞比例分別為(41.0±1.2)%和(25.3±1.0)%，植物乳酸桿菌組分別為(42.0±1.0)%和(30.5±0.9)%，均顯著高于對照組(P<0.05)；嗜酸乳酸桿菌組與植物乳酸桿菌組相比，腸系膜淋巴結(jié)中CD3+CD4+T細(xì)胞比例無顯著差異(P>0.05)，而CD3+CD8+T細(xì)胞比例植物乳酸桿菌組顯著高于嗜酸乳酸桿菌組(P<0.05)。結(jié)果表明，嗜酸乳酸桿菌和植物乳酸桿菌均可顯著提高小鼠腸系膜淋巴結(jié)中CD3+CD4+、CD3+CD8+T細(xì)胞比例，且與嗜酸乳酸桿菌相比，植物乳酸桿菌更傾向于提高CD3+CD8+T細(xì)胞亞群的比例。而2種乳酸桿菌對脾臟中CD3+CD4+、CD3+CD8+T細(xì)胞比例均無顯著影響(P>0.05)。

圖1 嗜酸乳酸桿菌和植物乳酸桿菌對小鼠脾臟與腸系膜淋巴結(jié)中CD3+CD4+、CD3+CD8+T細(xì)胞比例的影響

2.3 2種乳酸桿菌對小鼠結(jié)腸PP結(jié)中TLR2+和TLR4+細(xì)胞比例的影響

由圖2可知，嗜酸乳酸桿菌組小鼠結(jié)腸PP結(jié)中TLR2+和TLR4+細(xì)胞比例分別為(44.7±4.2)%和(26.9±2.4)%，植物乳酸桿菌組分別為(47.0±5.1)%和(25.8±2.3)%。與對照組相比，嗜酸乳酸桿菌和植物乳酸桿菌均極顯著提高了TLR2+細(xì)胞比例(P<0.01)，而對TLR4+細(xì)胞比例無顯著影響(P>0.05)。

2.4 2種乳酸桿菌對小鼠結(jié)腸中IFN-γ和IL-4水平的影響

由圖3可以看出，嗜酸乳酸桿菌組小鼠結(jié)腸組織中IFN-γ和IL-4含量分別為(257.23±5.34)和(278.98±4.57) pg/mL，植物乳酸桿菌組分別為(264.16±6.24)和(191.55±6.70) pg/mL；與對照組相比，嗜酸乳酸桿菌和植物乳酸桿菌均可極顯著提高IFN-γ水平(P<0.01)；嗜酸乳酸桿菌可極顯著提高IL-4水平(P<0.01)，植物乳酸桿菌對IL-4無顯著影響(P>0.05)。

圖2 嗜酸乳酸桿菌和植物乳酸桿菌對小鼠結(jié)腸PP結(jié)中TLR2+及TLR4+細(xì)胞比例的影響

2.5 2種乳酸桿菌對腸道sIgA水平的影響

由圖4可知，嗜酸乳酸桿菌組、植物乳酸桿菌組小鼠腸道sIgA水平分別為(1.31±0.05)和(1.28±0.03) μg/mL；與對照組相比，2種乳酸桿菌均可顯著提高腸道黏膜sIgA的水平(P<0.05)。

圖4 嗜酸乳酸桿菌和植物乳酸桿菌對小鼠腸道sIgA水平的影響

3 討 論

乳酸桿菌能夠調(diào)節(jié)機(jī)體的固有免疫和適應(yīng)性免疫，包括調(diào)節(jié)細(xì)胞因子的產(chǎn)生、誘導(dǎo)免疫效應(yīng)細(xì)胞表面受體分子成熟、促進(jìn)淋巴細(xì)胞增殖、提高抗體水平等[3-6]。Th1/Th2型免疫應(yīng)答是機(jī)體針對內(nèi)外環(huán)境不良因素產(chǎn)生的基本應(yīng)答類型，二者間的平衡對于維持機(jī)體免疫穩(wěn)態(tài)至關(guān)重要[7]。根據(jù)參與Th1/Th2型免疫應(yīng)答，可將細(xì)胞因子分為Th1和Th2型細(xì)胞因子，2種類型的細(xì)胞因子通過重疊或拮抗作用，以網(wǎng)絡(luò)的方式調(diào)控Th1/Th2免疫應(yīng)答間的平衡[8]。IFN-γ和IL-4分別是Th1型、Th2型細(xì)胞因子的典型代表[8]，本試驗中，嗜酸乳酸桿菌能夠同時上調(diào)結(jié)腸組織中IFN-γ和IL-4水平，而植物乳酸桿菌僅能上調(diào)IFN-γ水平，說明嗜酸乳酸桿菌能夠同時提高Th1和Th2型免疫應(yīng)答水平，植物乳酸桿菌只能提高Th1型免疫應(yīng)答水平。

Th0細(xì)胞在Th1或Th2型細(xì)胞因子的作用下可分化為Th1和Th2型細(xì)胞亞群。Th1型細(xì)胞亞群表面表達(dá)CD3+CD8+，Th2型細(xì)胞亞群表達(dá)CD3+CD4+，T細(xì)胞亞群的比例對于評價機(jī)體的免疫水平具有重要意義[9]。脾臟是淋巴細(xì)胞的定居地，作為最大的外周免疫器官，負(fù)責(zé)對血源抗原產(chǎn)生免疫應(yīng)答，Tsai等[10]研究表明，BALB/c小鼠口服含有109CFU/mL 副干酪乳酸桿菌副干酪亞種NTU 101(L.paracaseisubsp.paracaseiNTU 101)的MRS肉湯后，第3、6、9周脾臟中CD3+CD4+和CD3+CD8+T細(xì)胞亞群比例均顯著高于對照組。本研究中，嗜酸乳酸桿菌和植物乳酸桿菌對脾臟中CD3+CD4+和CD3+CD8+T細(xì)胞比例的影響均無顯著差異。推測可能有以下2方面原因：①嗜酸乳酸桿菌和植物乳酸桿菌灌胃時間短，不足以刺激脾臟中T細(xì)胞亞群的分化；②Tsai等[10]所用的含有乳酸桿菌的MRS菌液，菌液成分復(fù)雜，含有氨基酸、小分子碳水化合物等次級代謝產(chǎn)物，因此CD3+CD4+和CD3+CD8+T細(xì)胞亞群比例的增加是否與次級代謝產(chǎn)物、或菌株間的協(xié)同作用有關(guān)尚不可知。腸系膜淋巴結(jié)是腸道的引流淋巴結(jié)，也是免疫應(yīng)答的主要場所，腸系膜淋巴結(jié)內(nèi)T細(xì)胞亞群的變化對宿主的黏膜免疫應(yīng)答發(fā)揮著重要作用。本研究中嗜酸乳酸桿菌和植物乳酸桿菌均能顯著提高小鼠腸系膜淋巴結(jié)中CD3+T細(xì)胞比例，且植物乳酸桿菌更傾向于提高CD3+CD8+T細(xì)胞亞群比例，進(jìn)一步說明該菌具有促進(jìn)Th0細(xì)胞向Th1型方向極化的潛能。

細(xì)胞因子作為免疫調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中的重要效應(yīng)性分子，其上游信號來自于鄰近淋巴組織中免疫細(xì)胞表面的模式識別受體對相應(yīng)配體的識別[11]。結(jié)腸PP結(jié)是分布在結(jié)腸組織中的次級淋巴器官，富含樹突細(xì)胞(DCs)、巨噬細(xì)胞(Mφ)及T、B細(xì)胞，是結(jié)腸組織發(fā)揮局部黏膜免疫應(yīng)答的主要場所[12]。DCs是機(jī)體重要的抗原遞呈細(xì)胞(APCs)，其表面分布多種模式識別受體，如Toll樣受體(TLR)、C型凝集素受體(CLR)和NOD樣受體(NLR)[13]。目前，在哺乳動物和人體中已發(fā)現(xiàn)了13種TLR，其通過識別不同的配體信息激活轉(zhuǎn)錄核因子NF-κB，進(jìn)而分泌不同種類的細(xì)胞因子，調(diào)控機(jī)體的免疫狀態(tài)[11]。已經(jīng)證實，TLR2和TLR4的配體分別是細(xì)菌細(xì)胞壁成分的肽聚糖和脂多糖[14]，乳酸桿菌是G+菌，菌體表面肽聚糖成分較多。本試驗中嗜酸乳酸桿菌和植物乳酸桿菌均顯著提高了結(jié)腸PP結(jié)中TLR2+細(xì)胞數(shù)量，對TLR4+細(xì)胞數(shù)量無顯著影響，說明TLR2在介導(dǎo)嗜酸乳酸桿菌和植物乳酸桿菌的免疫調(diào)節(jié)作用中發(fā)揮著主要作用，進(jìn)而引發(fā)細(xì)胞因子的產(chǎn)生。

sIgA是參與黏膜局部體液免疫應(yīng)答的主要抗體。乳酸桿菌能夠通過活化APCs，或通過調(diào)節(jié)腸道菌群平衡的方式，直接或間接促進(jìn)腸道sIgA產(chǎn)生[15-16]。本研究中嗜酸乳酸桿菌和植物乳酸桿菌均能顯著提高小腸sIgA水平，表明2種乳酸桿菌均能夠提高腸道黏膜局部的體液免疫功能，但具體的作用機(jī)制有待于進(jìn)一步探討。

本試驗結(jié)果表明，2株乳酸桿菌均可提高結(jié)腸PP結(jié)中TLR2+細(xì)胞比例，而對TLR4+細(xì)胞比例無顯著影響，嗜酸乳酸桿菌上調(diào)Th1和Th2型免疫反應(yīng)，植物乳酸桿菌上調(diào)Th1型免疫反應(yīng)，2株乳酸桿菌在腸道黏膜免疫調(diào)節(jié)作用方面存在差異。然而，2種乳酸桿菌同時灌胃小鼠是否存在免疫調(diào)節(jié)的協(xié)同作用及其機(jī)制值得深入研究。

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