葛 璇，劉 莉，王明泉，孫韶華，賈瑞寶

山東省城市供排水水質(zhì)監(jiān)測中心，山東 濟(jì)南 250021

近幾十年來，激素類藥物在人類日常生活中被大量使用，不同種類的雌激素被排放到水環(huán)境中。雌激素在極低的濃度下就具有很強(qiáng)的內(nèi)分泌干擾作用，如20世紀(jì)30年代報(bào)道的雌激素效應(yīng)，20世紀(jì)80年代在英國的沙布塔河，5%的雄性鯉魚發(fā)生雌雄同體的現(xiàn)象，20世紀(jì)90年代在佛羅里達(dá)洲和五大湖,發(fā)現(xiàn)了爬行類和魚類動物的雌性化、生殖器怪異的鱷魚等動物繁殖力異常的現(xiàn)象等[1]，這些現(xiàn)象都與水環(huán)境中存在雌激素類物質(zhì)密切相關(guān)。而且，雌激素對人類健康危害顯著，長期攝入雌激素殘留的食品會出現(xiàn)性早熟、性異常、癌癥等， 并增加某些疾病的發(fā)病危險(xiǎn)，其潛在的危害是擾亂激素平衡，導(dǎo)致女童性早熟，男性女性化，誘發(fā)女性乳腺癌、卵巢癌等疾病[2-5]。因此，根據(jù)農(nóng)業(yè)部2002年4月193號文《食品動物禁用的獸藥及其他化合物清單》的規(guī)定，部分雌激素藥物在中國已禁止生產(chǎn)和使用。目前，中國給水處理仍以常規(guī)處理工藝為主，對雌激素活性內(nèi)分泌干擾物的去除能力有限，而中國現(xiàn)行的《生活飲用水衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)》(GB 5749—2006)中也缺少對此類物質(zhì)的檢測方法和限值要求。因此，開展水中雌激素類物質(zhì)的檢測方法研究，對開展中國城市水環(huán)境中雌激素污染現(xiàn)狀、轉(zhuǎn)化規(guī)律及消除控制技術(shù)研究具有重要意義。

國內(nèi)外常見的雌激素檢測方法有化學(xué)檢測方法和生物檢測方法?；瘜W(xué)檢測法包括氣相色譜法[6-8]、液相色譜法[9]、氣相色譜-質(zhì)譜法[10]、液相色譜-質(zhì)譜法[11-13]，生物檢測法有熒光素酶法、ELISA檢測法、生物傳感器檢測法等。目前，牛奶、雞肝制品中雌激素的研究已有報(bào)道[14-16]，但對水中多種雌激素同時(shí)測定的方法報(bào)道較少。相比其他檢測方法而言，液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜能有效消除基質(zhì)干擾，降低檢出限。因此，選用固相萃取-液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用法，開發(fā)建立了17β-雌二醇、雌三醇、雌酮、17α-炔雌醇、己烯雌酚等5種雌激素的高通量檢測方法。該方法靈敏度高，準(zhǔn)確度和精密度好，可為水中雌激素類污染物的檢測提供方法參考依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

液相色譜-三重四極桿質(zhì)譜分析儀(1200/6410型，美國)；全自動固相萃取儀(AT280型，美國)；氮吹儀(DC12H型，美國)；液相色譜柱(zorbax SB-C18型，美國)； OASIS HLB固相萃取柱(200 mg，6 mL)；C18固相萃取柱(500 mg，6 mL)；活性炭固相萃取柱(500 mg，6 mL，美國)；SAX固相萃取柱(500 mg，6 mL，美國)。

甲醇、乙腈、乙酸乙酯、二氯甲烷均為農(nóng)殘級；Millipore超純水；冰乙酸為國產(chǎn)優(yōu)級純。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 樣品前處理

采用HLB固相萃取柱，依次用6 mL的甲醇、純水活化后取1 L水樣，加入乙酸調(diào)節(jié)水樣pH為3后上樣，上樣速度為10 mL/min，用10 mL純水淋洗，用8 mL甲醇洗脫，洗脫液用氮?dú)饩徛蹈珊笥靡译?水(體積比為3∶2)定容至1 mL。

1.2.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

用乙腈-水(體積比為3∶2)配制17β-雌二醇、雌三醇、17α-炔雌醇的濃度分別為5、10、20、40、50、60、80 μg/L，己烯雌酚和雌酮的濃度分別為0.5、1、2、4、5、6、8 μg/L的標(biāo)準(zhǔn)溶液。

1.2.3 液相色譜條件

色譜柱為zorbax SB-C18柱，柱溫為40 ℃；流動相為乙腈和水，流速為0.2 mL/min; 進(jìn)樣量為20 μL；采用梯度洗脫，梯度洗脫程序見表1。

表1 液相色譜梯度條件

電噴霧離子源，負(fù)離子模式(ESI-)；離子源溫度為350 ℃；多反應(yīng)監(jiān)測(MRM)模式下采集數(shù)據(jù)，具體參數(shù)見表2。

表2 5種雌激素MRM參數(shù)

2 結(jié)果與分析

2.1 固相萃取條件的優(yōu)化

以5種雌激素回收率的高低作為最優(yōu)化固相萃取條件的選擇依據(jù)，分別研究了固相萃取中萃取柱、上樣速度、樣品pH、洗脫溶劑及洗脫溶劑體積5個(gè)實(shí)驗(yàn)條件參數(shù)。取1 L水樣，加入乙酸調(diào)節(jié)pH為3左右，分別加入40 μL 5種雌激素的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，使水中17β-雌二醇、雌三醇、17α-炔雌醇的濃度均為40 μg/L,己烯雌酚和雌酮濃度均為4 μg/L。設(shè)定不同的固相萃取條件進(jìn)行萃取。

2.1.1 固相萃取柱優(yōu)選

分別選擇HLB固相萃取小柱、C18柱、活性炭柱、SAX柱，按照“1.2.1節(jié)”中的實(shí)驗(yàn)步驟進(jìn)行前處理，經(jīng)測定后所得結(jié)果見圖1。

圖1 不同固相萃取柱萃取5種雌激素的回收率

由圖1看出，用HLB柱進(jìn)行固相萃取時(shí)得到5種雌激素的回收率最高，因此確定選擇HLB固相萃取柱。

2.1.2 pH影響

用乙酸分別調(diào)節(jié)5個(gè)平行水樣pH為7、5、3、2、1，按照“1.2.1節(jié)”中的實(shí)驗(yàn)步驟進(jìn)行前處理，經(jīng)測定后所得結(jié)果見圖2。 由圖2看出，5種雌激素的回收率隨著pH的降低而升高，當(dāng)pH為3時(shí)達(dá)到最大值，之后隨著pH的降低而下降，因此選擇待測樣品pH為3。

圖2 不同pH時(shí)萃取5種雌激素的回收率

2.1.3 洗脫劑優(yōu)選

分別選擇甲醇、乙酸乙酯、乙腈、二氯甲烷、正己烷作為固相萃取的洗脫試劑，按照“1.2.1節(jié)”中的實(shí)驗(yàn)步驟進(jìn)行前處理，經(jīng)測定后所得結(jié)果見圖3。由圖3看出，極性最強(qiáng)的甲醇萃取5種雌激素的回收率最高，非極性的正己烷萃取5種雌激素的回收率為零。因此，選擇甲醇作為最佳洗脫試劑。

圖3 不同洗脫試劑萃取5種雌激素的回收率

2.1.4 洗脫體積優(yōu)化

分別選擇2、4、6、8、10 mL甲醇對固相萃取柱進(jìn)行洗脫，按照“1.2.1節(jié)”中的實(shí)驗(yàn)步驟進(jìn)行前處理，經(jīng)測定后所得結(jié)果見圖4。由圖4看出，5種雌激素的回收率隨著洗脫體積的增加而升高，到8 mL時(shí)達(dá)到最大值，之后不再隨洗脫體積的增加而升高，因此確定優(yōu)化洗脫體積為8 mL。

圖4 不同洗脫體積時(shí)5種雌激素的回收率

2.1.5 上樣速度

圖5為上樣流速分別為5、10 mL/min時(shí)的測定結(jié)果。由圖5可以看出，2種流速所得5種雌激素的回收率相差不大，說明上樣速度在5～10 mL/min內(nèi)時(shí)對回收率的影響很小，因此選擇10 mL/min作為上樣速度。

圖5 不同上樣速度時(shí)5種雌激素的回收率

綜上，5種雌激素最佳固相萃取條件為水樣pH為3，HLB固相萃取柱，上樣速度為10 mL/min，洗脫試劑為甲醇，洗脫體積為8 mL。此時(shí)5種雌激素可獲得滿意的回收率。

2.2 方法的評價(jià)

2.2.1 線性方程和測定下限

5種雌激素的線性方程、相關(guān)系數(shù)及測定下限見表3。

表3 5種雌激素的線性方程、相關(guān)系數(shù)和測定下限

2.2.2 實(shí)際樣品分析及回收率和精密度

配制17β-雌二醇、雌三醇、17α-炔雌醇濃度為4×10-2μg/L，雌酮、己烯雌酚濃度為4×10-3μg/L的純水加標(biāo)平行樣6份，對地表水和自來水進(jìn)行上述濃度的5種雌激素加標(biāo)，前處理后測定。采用該方法對2012年9月—2013年9月濟(jì)南市鵲山水庫，玉清水庫，臥虎山水庫，錦繡川水庫和玉清水廠、鵲華水廠(2個(gè)引黃水廠)的出廠水及濟(jì)南光大水務(wù)污水處理一廠、二廠、三廠、四廠出廠水進(jìn)行檢測(表4、表5)。由表4、表5可見，4個(gè)水庫水、2個(gè)水廠的出廠水和4個(gè)污水處理廠出廠水中均未檢出5種雌激素，說明在該地區(qū)此類雌激素污染水平較低。

表4 5種雌激素的加標(biāo)回收率及相對標(biāo)準(zhǔn)偏差 %

表5 實(shí)際水樣中5種雌激素的測定濃度 μg/L

3 結(jié)論

建立了液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定地表水、飲用水和污水處理廠出廠水中17β-雌二醇、雌三醇、雌酮、17α-炔雌醇、己烯雌酚等的高通量檢測方法：樣品經(jīng)甲醇作萃取劑過OASIS HLB固相萃取柱富集，氮吹后用1 mL乙腈-水(體積比為3∶2)溶解，后用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜在MRM模式下進(jìn)行定性及定量分析。5種雌激素純水加標(biāo)回收率為63.6%～120.2%，地表水加標(biāo)回收率為59.8%～91.5%，自來水加標(biāo)回收率為55.3%～92.1%，精密度分別為3.7%～10.7%，線性方程的相關(guān)系數(shù)為0.995～0.998。17β-雌二醇、雌三醇、17α-炔雌醇的檢出限均為5 μg/L，雌酮、己烯雌酚的檢出限均為0.5 μg/L。采用該方法對濟(jì)南市4個(gè)水庫水和2個(gè)水廠的出廠水及4個(gè)污水處理廠出廠水進(jìn)行檢測，均未檢出5種雌激素。

[1] Theo C, Dianne D, John Peterson M.Our Stolen Future[M]. New York: The Spieler Agency, 1995:215-220.

[2] Holzman D. Elusive estrogens may hold key to some cancer risk [J].Natl Cancer Inst,1995,87:1 207.

[3] Gail M H, Fears T R, Hoover R N, et al.Reproducibility studies and interlaboratory concordance for assays of serum hormone levels: estrone, estradiol, estrone sulfate, and progesterone [J].Cancer Epidemical Biomarkers Prev,1996,5:835-844.

[4] 徐兩蒲, 劉暉, 王子敬. 性早熟女童性激素水平測定分析[J].福建醫(yī)藥雜志,2006,28(4):66-67.

[5] Carlson E, Givercmen A, Keiding N, et al. Evidence for decreasing qualities of semen during past 50 years[J].Br Med J,1992,305:609-613.

[6] 戴國斌, 楊琛, 黨志. 池塘底泥中合成激素的氣相色譜-質(zhì)譜測定[J].分析測試學(xué)報(bào),2008,27(1): 63-65.

[7] Ternes T A, Andersen H, G Ilberg D, et al. Determination of estrogens in sludge and sediments by liquid ex traction and GC/MS /MS[J].Ana Chem,2002,74(14):3 498-3 504.

[8] 胡偉, 黃榮斌, 陳小君, 等. 用氣相色譜考察雌二醇的衍生化方法[J]. 分析測試技術(shù)與儀器, 2001,7(1):41-44.

[9] 林春曉, 王起恩, 劉開鉗, 等. 食品中五種性激素的高效液相色譜測定法[J]. 中華預(yù)防醫(yī)學(xué)雜志, 2003,37(4):275-277.

[10] Helaleh M I H, Takabayash I Y, Fujii S, et al. Gas chromatographic- mass spectrometric method for separation and detection o f endocrine disruptors from environmental w ate r samples[J]. Anal Chim Acta, 2001,428(2):227-234.

[11] Zhang Hongwei,Henion J. Quantitative and qualitative determination of estrogen sulfa tes in hum an urine by liquid chromatog raphy/tandem mass spectrometry using 96-well techno logy[J].Anal Chem,1999,71(18):3 955-3 964.

[12] 應(yīng)永飛, 朱聰英, 陳慧華, 等. 動物尿液中15種甾類同化激素的液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜同時(shí)測定[J]. 分析測試學(xué)報(bào),2008,27(12):1 308-1 312.

[13] 陳彤,云霞,那廣水,等.高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定海水中雌酮、雌二醇、雌三醇[J].分析試驗(yàn)室,2009,28(11):41-44.

[14] 劉宏程,鄒艷紅,黎其萬,等.高效液相色譜分離牛奶中己烯雌酚、己烷雌酚和雙烯雌酚[J].分析化學(xué),2008,36(2):245-248.

[15] 吳銀良,劉素英,單吉浩,等.氣相色譜-質(zhì)譜法分析雞肝中己烯雌酚殘留量[J].中國獸藥雜志,2005,39(11):8-10．

[16] 林奕芝,司徒潮滿,劉奮,等.GC-MS法測定肉中雌激素殘留量方法的研究[J].中國衛(wèi)生檢驗(yàn)雜志,2007,17(7):1 165-1 167．