王 勤,程雪峰,李 聰,顧 健,敖華飛

(上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第三人民醫(yī)院耳鼻咽喉-頭頸外科，上海 201900)

中內(nèi)耳疾病包括分泌性中耳炎、自身免疫性內(nèi)耳疾病及梅尼埃病等，臨床常用的治療方法為全身應(yīng)用激素，為達(dá)到有效藥物濃度，需要使用較大劑量，因此會引起全身不良反應(yīng)。近年來有學(xué)者嘗試局部用藥治療，但由于鼓室經(jīng)咽鼓管與鼻腔相通，難以讓藥物較長時間滯留，大大影響療效。熱敏性凝膠[1-3]具有隨溫度升高而變成凝膠的特性，可以利用此特點(diǎn)使局部長期保持藥物濃度，進(jìn)而避免反復(fù)用藥造成鼓室損傷[4-5]。本研究以泊洛沙姆407為基質(zhì)制備耳用地塞米松熱敏性凝膠，并對其體外釋放性能進(jìn)行檢測，報告如下。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1試劑 地塞米松(上?？笊镉邢薰?，生產(chǎn)批號：090504)，泊洛沙姆407(poloxamer407，德國BASF公司，生產(chǎn)批號：9003116)，地塞米松對照品(中國藥品生物制品檢定所，生產(chǎn)批號：10098685)。

1.1.2儀器設(shè)備 1/10萬電子天平(AE240型，梅特勒-托利多有限公司)，DK-8D型電熱恒溫槽(上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司)，88-Ⅰ型定時恒溫磁力攪拌器(上海思樂儀器有限公司)，UV-9200型紫外分光光度計(上海元析儀器有限公司)，TK-20A型透皮擴(kuò)散試驗(yàn)儀(上海鍇凱科技貿(mào)易公司)，微量離心機(jī)(BECKMAN COULTER，美國)。

1.2方法

1.2.1制備地塞米松熱敏性凝膠 稱取一定量的泊洛沙姆407，加入定量等滲的磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline，PBS)溶液配成濃度為16%、17%、18%、19%、20%的等量泊洛沙姆407溶液,另外稱取等質(zhì)量的地塞米松加入上述各泊洛沙姆407溶液中，使其地塞米松濃度為10 g/L，在恒溫磁力攪拌下使上述溶液分散均勻，然后放置在4 ℃的冰箱中冷脹48 h，使凝膠分散均勻，充分溶解膨脹，得到澄清透明溶液。

1.2.2測定相轉(zhuǎn)變溫度 同時配制濃度為16%、17%、18%、19%、20%的泊洛沙姆407溶液放于4 ℃的冰箱中冷藏48 h得澄明溶液。取儲存于冰箱中的泊洛沙姆溶液和含地塞米松的泊洛沙姆407凝膠溶液，取等質(zhì)量的溶液分別置于容量瓶中，溫度計直接插入容量瓶的溶液中(溫度計的玻璃泡需與溶液充分接觸)，然后整體置于恒溫水浴中，水浴緩慢升溫(升溫速率為1 ℃/1～2 min)，觀察并記錄內(nèi)容物不流動時刻的溫度。每份溶液需要測定3次，取平均值。然后根據(jù)適合耳用的溫度(34 ℃)選擇合適的泊洛沙姆407濃度。

1.2.3測定波長的選擇 配制濃度為10 mg/L的地塞米松溶液。另外選擇釋放介質(zhì)即等滲PBS，在注射用水為空白對照的基礎(chǔ)上對波長范圍在300～500 nm內(nèi)進(jìn)行掃描。

1.2.4繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線 將地塞米松對照品25 mg置于25 mL容量瓶中，加入等滲PBS適量溶解(儲備液)。分別精密量取溶液0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 mL，置于25 mL容量瓶中，并將其稀釋至刻度，配成4、8、12、16、20、24 mg/L的溶液。取20μL溶液進(jìn)樣，在特定波長處測定不同濃度的地塞米松溶液的吸光度。

1.2.5測定精密度 按上述方法制備3種濃度(24.0、12.0、4.0 g/L)的地塞米松對照液各3份，置于室溫，閉光保存。分別在同一日不同時點(diǎn)間測量5次，計算日內(nèi)地塞米松吸光度的相對標(biāo)準(zhǔn)差(relative standard deviation，RSD)；再在5 d內(nèi)分別每日測量1次，計算日間RSD。

1.2.6測定回收率 分別精密量取含地塞米松10 g/L的樣品1 mL 6份，置于50 mL的容量瓶中，各精密加入上述制備的含地塞米松1 g/L的儲備液3.0、4.0、5.0 mL，加等滲PBS稀釋至刻度搖勻(每份濃度各制備2份)；再分別另取上述液體1 mL，以等滲PBS稀釋至50倍，混合搖勻。取適量溶液以離心半徑6 cm，3000 r/min離心5 min，取上清液測定并記錄吸光度的數(shù)值。

1.2.7體外測定凝膠釋藥 采用TK-20A型透皮擴(kuò)散試驗(yàn)儀，在Franz立式擴(kuò)散池模型基礎(chǔ)上進(jìn)行測定。將試驗(yàn)儀的水浴箱維持在36.0 ℃，并控制使其保持在恒溫狀態(tài)，轉(zhuǎn)速維持在200 r/min，分別將塞米松熱敏性凝膠和等滲PBS加入到給藥池和接受池，每隔一定時間取接受池樣品1 mL，然后再加1 mL PBS溶液。在等滲PBS為空白對照的基礎(chǔ)上，測量吸光度。不同時點(diǎn)間按上述方法進(jìn)行測量，即可得到地塞米松熱敏性凝膠不同時間點(diǎn)的藥物累計釋放量。

2 結(jié) 果

2.1地塞米松熱敏性凝膠基質(zhì)濃度的選擇 以最接近人體中耳內(nèi)的溫度34 ℃作為相轉(zhuǎn)變溫度篩選的依據(jù)，由結(jié)果(圖1)可知：濃度為17%的泊洛沙姆407溶液在34 ℃時已形成凝膠；地塞米松對泊洛沙姆407的相轉(zhuǎn)變溫度影響很小。故選擇濃度為17%的泊洛沙姆407作為凝膠基質(zhì)。

圖1 不同濃度的泊洛沙姆407與凝膠溫度的關(guān)系

2.2體外釋放度的測定 測定波長的選擇結(jié)果顯示地塞米松紫外吸收光譜在415 nm的波長處有最大吸收，而415 nm波長處PBS吸收很少，兩者能明顯分離。故選擇測定波長為415 nm。以C(濃度)對A(吸光度)進(jìn)行線性回歸繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線得方程為C=44.241A-1.860(r=0.998，n=6)。試驗(yàn)結(jié)果表明，在4～24 mg/L范圍內(nèi)地塞米松和吸光度呈良好線性關(guān)系。日內(nèi)精確度(RSD)=1.032%，日間RSD=1.936%，此結(jié)果符合方法學(xué)要求?；厥章式Y(jié)果見表1，結(jié)果同樣符合方法學(xué)要求。

表1 回收率測定結(jié)果

RSD：相對標(biāo)準(zhǔn)差

2.3樣品體外累計藥物釋放量的測定 據(jù)上述測定結(jié)果，選擇以濃度為17%的泊洛沙姆407為基質(zhì)的地塞米松熱敏性凝膠進(jìn)行體外累計藥物釋放量的測定。如圖2所示：藥物累計釋放百分率和時間呈良好的線性關(guān)系，顯示為零級動力學(xué)特征。并將此累計藥物釋放曲線進(jìn)行零級釋藥曲線擬和，即可得方程y=0.3235x+10.184(r=0.9978)，符合方法學(xué)要求。如圖2所示兩者良好的線性關(guān)系也說明樣品在體外整個釋放過程中無突釋，在240 h時藥物的累計釋放量已經(jīng)達(dá)到90%，整個釋藥過程完全，具有較好的緩釋性和控釋性。

圖2 地塞米松熱敏性凝膠累計藥物釋放量曲線

3 討 論

糖皮質(zhì)激素是治療中內(nèi)耳疾病的重要藥物，但血-外淋巴屏障嚴(yán)重限制藥物到達(dá)中內(nèi)耳組織，為達(dá)到有效藥物濃度，需要使用較大劑量。由此便帶來眾多不可避免的不良反應(yīng)，更是高血壓、糖尿病、胃潰瘍等疾病的禁忌，限制了其應(yīng)用，進(jìn)而限制了中內(nèi)耳疾病的治療效果。所以，近年來鼓室內(nèi)局部用藥治療中內(nèi)耳疾病成為國內(nèi)外學(xué)者探討的熱點(diǎn)，然而如何在局部保持藥物的高濃度長期給藥成了研究的關(guān)鍵。

近年來，由于材料科學(xué)的發(fā)展，出現(xiàn)大量的藥物緩釋材料，為中內(nèi)耳疾病的局部治療提供幫助。熱敏性凝膠具有特殊的環(huán)境敏感性，即在常規(guī)溫度下為溶液狀態(tài)，隨著所處外界的溫度升高，其能夠發(fā)生相轉(zhuǎn)化，形成非化學(xué)交聯(lián)型半固體凝膠[3、6]，所以以此作為載藥基質(zhì)，藥物即可精確定位到具體的組織內(nèi)，到達(dá)局部用藥的目的，這樣即可減少對全身其他組織的不良反應(yīng)，進(jìn)而可以擴(kuò)寬地塞米松治療中內(nèi)耳疾病的適應(yīng)證的范圍。

利用泊洛沙姆407的特殊性質(zhì)采用冷溶法制備地塞米松熱敏性凝膠，目的是使熱敏性凝膠在低溫時為流動性較好的液態(tài)，隨著所處外界溫度的升高發(fā)生狀態(tài)的轉(zhuǎn)變，形成半固體凝膠。而本實(shí)驗(yàn)的重點(diǎn)是考察不同濃度的泊洛沙姆407的轉(zhuǎn)化溫度，以人體中耳內(nèi)的溫度34 ℃作為篩選溫度的參考依據(jù)，選擇合適的濃度的泊洛沙姆407。在此基礎(chǔ)上同時考察了含不同濃度泊洛沙姆407的地塞米松熱敏性凝膠的相轉(zhuǎn)變溫度，以排除加入的地塞米松對相轉(zhuǎn)變溫度的影響。

在本實(shí)驗(yàn)中以直觀簡單的傾斜法觀察相轉(zhuǎn)變問題，操作簡單，結(jié)果準(zhǔn)確可靠。本研究用等滲的PBS緩沖液進(jìn)行配置樣品，不僅保證了地塞米松的完全溶解，還保證了樣品的pH值，減少了藥物對鼓室內(nèi)酸堿平衡的影響。查閱大量的凝膠體外釋放的研究文獻(xiàn)[7-10]，研究凝膠類藥物體外釋放[9-11]，在此基礎(chǔ)上為了能較好地模擬人體中耳環(huán)境，本研究采用其中的立式Franz擴(kuò)散池來檢測凝膠藥物的釋放，此方法能較好地模擬鼓室相對封閉的環(huán)境，通過調(diào)節(jié)固定的轉(zhuǎn)速來模擬鼓室所處的環(huán)境，穩(wěn)定性好，測定準(zhǔn)確。本研究制備的地塞米松耳用熱敏型凝膠累計釋放百分率接近90%時需要240 h，整個藥物釋放過程完全，且具有一定的控釋作用。配置的地塞米松熱敏性凝膠最突出的特點(diǎn)就是黏附力很強(qiáng)，藥物表面活性高，增加藥物與局部的接觸時間和面積，同時減少了用藥次數(shù)，增加了藥物療效，降低了對局部的刺激。

將泊洛沙姆407作為地塞米松的載藥基質(zhì)制備的地塞米松熱敏性凝膠，此體外實(shí)驗(yàn)取得了良好的效果，但是否能夠在體內(nèi)有一定的療效、能否很好地在體內(nèi)降解值得進(jìn)一步研究，期待此劑型成為治療中內(nèi)耳疾病的理想制劑。

[1] Cho HJ,Park EK,Song KW.Poloxamer/Cyclodextrin/Chitosan-based Thermoreversible Gel for Intranasal Delivery of Fexofenadine Hydrochloride[J].J Pharm Sci,2011,100(2):681-691.

[2] Dumortier G,Grossiord JL,Agnely F,etal.A review of poloxamer 407 pharmaceutical and pharmacological characteristics[J].Pharm Res,2006,23(12):2709-2728.

[3] Monti D,Burgalassi S,Rossato MS,etal.Poloxamer 407 microspheres for orotransmucosal drug deliverry.partⅡ:In vitro/in vivo evaluation[J].Int J Pharm,2010,400(1/2):32-36.

[4] Niu GF,Du FY,Song L,etal.Synthesis and characterization of reactive poloxamer 407s for biomedical applications[J].J Control Release,2009,138(1):49-56.

[5] Yong CS,Choi JS,Quan QZ,etal.Effect of sodium chloride on the gelation temperature,gel strength and bioadhesive force of poloxamer gels containing diclofenac sodium[J].Int J Pharm,2001,226(1/2):195-205.

[6] Albertini B,Passerini N,Sabatino MD.Poloxamer 407 microspheres for orotransmucosal drug delivery,partⅠ:Formulation,manufacturing and characterization[J].Int J Pharm,2010,399(1/2):71-79.

[7] Gupta S,Samanta MK,Raichur AM.Dual-drug delivery system based on in situ gel-forming nanosuspension of forskolin to enhance antiglaucome efficacy[J].Pharm Sci Tech,2010,11(1)：322-335.

[8] Mansoor M,Amiji MM,Lai PK,etal.Intr-Tumoraladministration of paclitaxel in an in situ gelling poloxamer 407 formulation[J].Pharm Dev Technol,2002,7(2):195-202.

[9] Oh KS,Lee KE,Han SS,etal.Formation of core/shell nanoparticles with a lipid core and their application as adrug delivery system[J].Biomacromolecules,2005,6(2):1062-1067.

[10] Cafaggi S,Leardi R,Parodi B,etal.Preparation and evaluation of a chitosan salt-poloxamer 407 based matrix for buccal drug delivery[J].J Control Release,2005,102(1):159-169.