劉 丹付希安暴芳芳史本青劉 紅田洪青張福仁?

·經(jīng)驗(yàn)交流·

遺傳性泛發(fā)性色素異常癥ABCB6基因突變檢測(cè)

劉 丹1，2，3付希安1暴芳芳1史本青1劉 紅1田洪青1張福仁1?

目的: 檢測(cè)3例遺傳性泛發(fā)性色素異常癥患者ABCB6基因的突變。方法: 提取患者外周血DNA，采用PCR擴(kuò)增患者ABCB6基因的全部外顯子及其側(cè)翼序列，對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物直接測(cè)序檢測(cè)基因突變。結(jié)果: 3例患者該基因編碼區(qū)所有外顯子均未發(fā)現(xiàn)突變。結(jié)論: 本研究中3例遺傳性泛發(fā)性色素異常癥患者的發(fā)病與ABCB6基因的編碼區(qū)序列無(wú)關(guān)。

遺傳性泛發(fā)性色素異常癥； ABCB6基因； 突變位點(diǎn)

遺傳性泛發(fā)性色素異常癥(DUH)是由德國(guó)學(xué)者Lchikawa和Hiraga于1933年首次報(bào)道的一種少見(jiàn)的孟德?tīng)栠z傳性皮膚病，其典型皮損為全身泛發(fā)相互夾雜的色素沉著和色素減退斑。1本病呈常染色體顯性或隱性遺傳。DUH作為一種遺傳性疾病，其表型改變是以基因的改變?yōu)榛A(chǔ)，因此尋找其致病基因不僅可以對(duì)疾病做出明確診斷，而且可以在分子水平更好的認(rèn)識(shí)其發(fā)病機(jī)制。2003年賀林等首次將顯性遺傳DUH的致病基因定位于6q24.2～q25.2區(qū)域，2隱性遺傳DUH的致病基因定位于12q21～q23區(qū)域。3，42013年Zhang等運(yùn)用全基因組聯(lián)合分析及外顯子測(cè)序的方法首先發(fā)現(xiàn)ABCB6基因?yàn)镈UH的致病基因。5同時(shí)，我們的研究團(tuán)隊(duì)也運(yùn)用相似的方法得出相同的結(jié)論，并且用模式動(dòng)物斑馬魚(yú)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證致病基因ABCB6的表達(dá)。6為進(jìn)一步驗(yàn)證ABCB6為DUH的致病基因，我們對(duì)收集到的2個(gè)DUH家系的先證者及1例散發(fā)共3例患者進(jìn)行ABCB6基因突變位點(diǎn)檢測(cè)。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象 3例DUH患者來(lái)自山東省皮膚病性病防治研究所門(mén)診，均經(jīng)臨床和病理確診。2個(gè)DUH家系的家系圖如圖1所示:患者父母之一發(fā)病，男女發(fā)病機(jī)會(huì)大致均等；男女患者均可直接傳遞給后代且代代相傳，符合單基因遺傳中常染色體顯性遺傳的方式。家系中先證者及1例散發(fā)病例的平均發(fā)病年齡為2歲。典型的臨床表現(xiàn):全身泛發(fā)大小性狀不等色素斑，色素沉著與色素減退相互夾雜，無(wú)自覺(jué)癥狀(圖2)。組織病理學(xué)示:色素沉著區(qū)基底細(xì)胞甚至真皮層黑素增加；色素減退區(qū)黑素?cái)?shù)量明顯減少甚至缺如(圖3)。

圖1 家系圖(a:家系1；b:家系2)

圖2 a、b:散發(fā)病例的肩部及背部泛發(fā)大小形狀不等色素斑，色素沉著與色素減退相互夾雜圖3 散發(fā)病例背部組織病理示:色素沉著區(qū)基底細(xì)胞甚至真皮層黑素增加；而色素減退區(qū)黑素?cái)?shù)量明顯減少(HE，×400)

1.2 材料 經(jīng)患者知情同意后，留取詳細(xì)的臨床資料和臨床圖片及組織病理檢查結(jié)果，同時(shí)取患者靜脈血各5 mL，放置在EDTANa4抗凝管中，存入－70℃冰柜冷凍保存，采用AXYGEN試劑盒提取基因組DNA。取適量DNA進(jìn)行純度檢測(cè)并標(biāo)化。

1.3 方法

1.3.1 PCR擴(kuò)增 通過(guò)美國(guó)國(guó)家生物信息中心(NCBI)基因庫(kù)及UCSC數(shù)據(jù)庫(kù)檢索到ABCB6基因的基因組序列，采用Premier Primer 5.0軟件設(shè)計(jì)合適的引物，由北京華大基因科技有限公司合成(表1)。按照說(shuō)明書(shū)將其稀釋為20μmol/L，并采用溫度梯度法探索每一對(duì)引物的最佳退火溫度。PCR反應(yīng)在9700型PCR擴(kuò)增儀(美國(guó)ABI公司)上完成，反應(yīng)條件為: 94℃預(yù)變性3 min后，94℃變性30 s，退火45 s，72℃延伸45 s，共35個(gè)循環(huán)。最后72℃延伸8 min，4℃保存。

表1 本研究中設(shè)計(jì)的引物

1.3.2 DNA測(cè)序 PCR產(chǎn)物采用3130xl遺傳分析儀(美國(guó)ABI公司)直接測(cè)序。

2 結(jié)果

直接測(cè)序結(jié)果ABCB6基因整個(gè)編碼區(qū)的19條外顯子及其側(cè)翼序列被擴(kuò)增，并且個(gè)別外顯子采用了雙向測(cè)序，以確保測(cè)序結(jié)果的準(zhǔn)確性。3例患者的DNA測(cè)序結(jié)果中均未發(fā)現(xiàn)突變位點(diǎn)(圖4為散發(fā)病例12號(hào)外顯子的一段正常序列)。

圖4 散發(fā)病例12號(hào)外顯子的一段正常序列，箭頭所指為文獻(xiàn)5中報(bào)道的突變位點(diǎn)c.1736 G＞A(p.Gly579Glu)

3 討論

DUH是一種少見(jiàn)的色素異常性皮膚病，其典型皮損為全身泛發(fā)色素沉著伴色素減退斑。該病的診斷主要依靠臨床表型及組織病理學(xué)檢查，但臨床存在許多與其表型相類似的色素異常性疾病，如遺傳性對(duì)稱性色素異常癥(DSH)、網(wǎng)狀肢端色素沉著(RAPK)、屈側(cè)網(wǎng)狀色素異常癥(DDD)等，給臨床診斷帶來(lái)一定困難。而遺傳性疾病的表型改變往往以基因的改變?yōu)榛A(chǔ)，因此確定疾病的致病基因尤為重要。

早在2003年賀林等就首次將顯性遺傳及隱性遺傳DUH的致病基因分別定位于6q24.2～q25.2和12q21～q23區(qū)域，但均未發(fā)現(xiàn)致病基因。

2013年Zhang等5首先通過(guò)連鎖分析及相關(guān)的功能分析發(fā)現(xiàn)該病的致病基因?yàn)锳BCB6且該基因在皮膚的表皮表達(dá)。Cui等7通過(guò)連鎖分析及外顯子測(cè)序技術(shù)進(jìn)一步驗(yàn)證了ABCB6基因?yàn)镈UH的致病基因，并認(rèn)為不同位置的突變位點(diǎn)可以產(chǎn)生不同的表型。

ABCB6基因位于2號(hào)染色體2q36區(qū)域，屬于ABC轉(zhuǎn)運(yùn)超家族，參與轉(zhuǎn)運(yùn)多肽、類固醇等。8該基因表達(dá)于多種組織，如心臟、骨骼肌、黑素細(xì)胞及黑素瘤細(xì)胞等。8ABCB6亞細(xì)胞定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基體、溶酶體及質(zhì)膜。9，10既往研究發(fā)現(xiàn)DUH可能與黑素細(xì)胞成熟障礙相關(guān)。我們的動(dòng)物模式斑馬魚(yú)實(shí)驗(yàn)表明ABCB6在黑素的轉(zhuǎn)運(yùn)及生成方面發(fā)揮著極其重要的作用。6

迄今已發(fā)現(xiàn)7個(gè)DUH相關(guān)的ABCB6基因突變位點(diǎn)(表2)，但本研究中3例患者所有ABCB6基因編碼區(qū)域及側(cè)翼序列均未發(fā)現(xiàn)突變。我們推測(cè)可能的原因:一是突變位點(diǎn)可能位于啟動(dòng)子區(qū)域，而我們并沒(méi)有檢測(cè)所有的內(nèi)含子區(qū)域。二是該病可能存在其他致病基因。下一步我們會(huì)對(duì)非編碼區(qū)進(jìn)行測(cè)序，檢測(cè)內(nèi)含子區(qū)域是否存在突變。

表2 文獻(xiàn)中報(bào)道的關(guān)于顯性遺傳DUH的致病基因ABCB6突變位點(diǎn)

1 Ichigawa T，Hiraga Y.A previously undescribed anomaly ofpigmentation dyschromatosis universalis hereditaria.J Dermatol，1933，34:360－364.

2Xing QH，Wang MT，Chen XD，etal.A gene locus responsible for dyschromatosis(DSH)maps to chromosome 6q24.2－q25.2. Am JHum Genet，2003，73:377－382.

3 Bukhari IA，El－Harith EA，Stuhrmann M.Dyschromatosis universalis hereditaria as an autosomal recessive disease in five members of one fam ily.JEur Acad Dermatol Venereol，2006，20 (5):628－629.

4 Stuhrmann M，Hennies HC，Bukhari IA，et al.Dyschromatosis universalis hereditaria:evidence for autosomal recessive inheritance and identification of a new locus on chromosome 12q21－q23.Clin Genet，2008，73(6):566－572.

5 Zhang C，LiD，Zhang J，etal.Mutations in ABCB6 Cause Dyschromatosis Universalis Hereditaria.J Invest Dermatol，2013，133 (9):2221－2228.

6 Liu H，Li Y，Hung KKH，et al.Genome－wide linkage，exome sequencing and functional analyses identify ABCB6 as the pathogenic gene of dyschromatosis universalis hereditaria.PLoSOne，2014；9(2):87250.

7 Cui YX，Xia XY，Zhou Y，etal.Novelmutations of ABCB6 associated with autosomal dominant dyschromatosis universalis hereditaria.PLoSOne，2013，8(11):79808.

8Mitsuhashi N，Miki T，Senbongi H，et al.MTABC3，a novel mitochondrial ATP－binding cassette protein involved in iron homeostasis.JBiol Chem，2000，275:17536－17540.

9 Tsuchida M，Emi Y，Kida Y，et al.Human ABC transporter isoform B6(ABCB6)localizes primarily in the Golgi apparatus. Biochem Biophys Res Commun，2008，369(2):369－375.

10 Kiss K，Brozik A，Kucsma N，etal.Shifting the paradigm:the putativemitochondrial protein ABCB6 resides in the lysosomes of cells and in the plasma membrane of erythrocytes.PLoS One，2012，7(5):37378.

(收稿:2014－03－20 修回:2014－05－04)

M utation detection of ABCB6 gene w ith dyschromatosis universalis hereditaria

LIU Dan，F(xiàn)U Xi-an，BAO Fang-fang，et al.Shandong Provincial Institute of Dermatology and Venereology，250022，Jinan

Objective:To identifymutations of ABCB6 gene in three patientswith dyschromatosis universalis hereditaria.Methods:After extracting DNA from peripheral blood，all the exonsof ABCB6 geneand their flanking intronic sequences were amplified by PCR，and then，direct sequencing was performed to screen the mutations in the gene.Results:Nomutation was found in any of the exon in ABCB6 gene from the three patients.Conclusion:The pathogenesis of the three patients with dyschromatosis universalis hereditaria has nothing to do with the sequence of coding region in ABCB6 gene.

dyschromatosis universalis hereditaria；ABCB6 gene；mutations

1山東省皮膚病性病防治研究所，濟(jì)南，250022

2山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院，濟(jì)南，250062

3濟(jì)南大學(xué)山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院，濟(jì)南，250062

?通信作者