左文娜 王洪琴 吳干勛 李國麗 李丹

腫瘤轉(zhuǎn)移抑制基因在惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和侵襲、轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮著重要作用。基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)屬于重要的蛋白酶類之一，其可以降解多種細胞外基質(zhì)成份和血管基膜，破壞腫瘤細胞的侵襲，促進血管形成。RECK(reversion-inducing-cysteine-rich protein with Kazalmotifs)基因是近年來新發(fā)現(xiàn)的一種新型腫瘤轉(zhuǎn)移抑制基因和基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑，可抑制多種MMP表達，阻礙腫瘤細胞的發(fā)生、發(fā)展及侵襲。本研究對41例喉癌患者的石蠟標本采用流式細胞術(shù)檢測并分析RECK基因和MMP-14、MMP-2在腫瘤組織中表達的相關(guān)性及與病理參數(shù)之間的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取我院2009年12月至2011年1月收集的72例腫瘤組織，按類型不同分為喉癌組織41例、癌旁組織16例 (距腫瘤切緣＞0.5 cm)及喉部正常黏膜組織15例，分別為喉癌組、癌旁組及對照組。根據(jù)國際抗癌協(xié)會(UICC)TNM分類臨床分期標準，Ⅰ～Ⅱ期17例，Ⅲ～Ⅳ期24例。喉癌組中男30例，女11例;根據(jù)術(shù)后病理，伴隨淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移11例，未伴隨30例;年齡40～76歲，中位年齡60歲;喉癌分型:聲門上型21例，聲門型15例，聲門下型5例;病理學(xué)分級:G1組16例，G2組18例，G3組7例;吸煙量＞400(年×支/d)者20例，≤400(年 ×支/d)者21例;所有腫瘤組織均經(jīng)組織病理學(xué)確診為鱗狀細胞癌、炎癥或正常組織。且術(shù)前均未行放療、化療等治療措施。

1.2 方法

1.2.1 制備單細胞懸液:將0.5 g組織放置于120目不銹鋼網(wǎng)上剪碎，用鑷子及0.9%氯化鈉溶液輕輕搓洗至自然沉淀，收集細胞懸液。再次將混懸液過濾，去除細胞團塊。1 000 r/min離心2 min，再次重復(fù)棄上清液。加入1 ml磷酸鹽緩沖液懸浮細胞，制成單細胞懸液。

1.2.2 細胞的免疫熒光標記:取0.1 ml以上液體，按1∶100 濃度分別加入0.1 ml RECK、MMP-14 及 MMP-2抗體工作液，加入磷酸鹽緩沖液10ml，同法離心5 min，棄上清液。之后加入羊抗兔FITC-IgG二抗工作液0.1 ml，常溫孵育30 min，避光，熒光染色。上述方法重復(fù)一次后剔除未結(jié)合的熒光二抗。

1.2.3 REC基因及MMP-14蛋白檢測:采用EPics-XLⅡ型流式細胞儀(美國Beckerman Coulter公司)、氬離子激光器、ExPo32ADC、Muticycle AN分析軟件等對數(shù)據(jù)進行免疫熒光分析和擬合分析，調(diào)整儀器CV值＜2%。按照熒光指數(shù)(FI)對RECK、MMP-14蛋白及MMP-2蛋白的定量表達進行分析。公式為FI=實驗樣品均道值/正常組織均道值。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析 應(yīng)用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件，計量資料以表示，采用t檢驗，同時采用單因素方差分析、SNK檢驗及直線相關(guān)及直線回歸分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 3組RECK、MMP-14和MMP-2蛋白的表達 喉癌組織中RECK蛋白的表達量低于癌旁組及對照組(P均＜0.05)。癌旁組和對照組中RECK蛋白的表達量差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.063)。喉癌組織中MMP-14和MMP-2蛋白的表達量均高于癌旁組及對照組(P均 ＜0.05)。癌旁組和對照組中 MMP-14和MMP-2蛋白的表達量差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.763和P=0.895)。喉癌組織中RECK和MMP-14、MMP-2蛋白的表達與臨床病理因素有關(guān)。見表1、2。

表1 各組RECK蛋白、MMP-14蛋白、MMP-2蛋白FI表達量比較±s

表1 各組RECK蛋白、MMP-14蛋白、MMP-2蛋白FI表達量比較±s

注:與喉癌組比較，*P ＜0.05

組別 RECK蛋白 MMP-14蛋白 MMP-2蛋白喉癌組(n=41)0.8173 ±0.1043 1.7135 ±0.1729 3.5987 ±0.1878癌旁組(n=16) 1.0926 ±0.1632* 1.3298 ±0.1427* 1.0322 ±0.1611*對照組(n=15) 1.1278 ±0.1322* 0.96787 ±0.7983* 0.6789 ±0.1657*

表2 喉癌組織中RECK在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、臨床分期和病理分級中的表達量±s

表2 喉癌組織中RECK在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、臨床分期和病理分級中的表達量±s

項目 RECK蛋白 P值 MMP-14蛋白 P值 MMP-2蛋白 P值淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有(n=11) 0.5382 ±0.0934 1.8991 ±0.2152 4.1026 ±0.2008無(n=30) 1.1021 ±0.1415 0.036 1.4623 ±0.1856 0.012 2.7869 ±0.2035 0.041臨床分期Ⅰ ～ Ⅱ期(n=17) 0.9169 ±0.1324 1.4112 ±0.1703 2.7589 ±0.1736Ⅲ ～ Ⅳ期(n=24) 0.6089 ±0.0714 0.024 1.7300 ±0.1579 0.030 3.9978 ±0.1876 0.003病理分級G1(n=16) 1.1022 ±0.1369 1.4213 ±0.2654 1.9326 ±0.1486 G2(n=18) 0.7533 ±0.0265 1.6849 ±0.2208 3.0120 ±0.2425 G3(n=7) 0.3148 ±0.0902 0.018 1.9538 ±0.2162 0.017 4.2386 ±0.1953 0.001

2.2 喉癌組織中RECK與MMP-14及MMP-2蛋白表達的相關(guān)性 RECK與MMP-14及MMP-2蛋白之間有顯著的負相關(guān)線性關(guān)系，(r= －0.629，P＜0.05)及(r= －0.804，P＜0.05);喉癌組織中 MMP-14、MMP-2蛋白之間有顯著的直線性相關(guān)關(guān)系，為正相關(guān)(r=0.612，P＜0.05)。見圖1 ～3。

圖1 RECK與 MMP-14呈負相關(guān)(直線回歸方程是Y=2.002－0.601X)

圖2 RECK與 MMP-2呈負相關(guān)(直線回歸方程是Y=2.578－0.601X)

圖3 MMP-14與 MMP-2呈正相關(guān)(直線回歸方程是Y=1.302+0.671X)

3 討論

MMP-2又稱Ⅳ型膠原酶、明膠酶，是MMPs的家族成員之一，是腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移的過程中發(fā)揮重要作用的酶［1］。可以降解基底膜中的Ⅳ型膠原、明膠等，使基底膜斷裂，破壞血管，使其完整性受到損害［2，3］。MMP-14/MTl-MMP 是 MT-MMP 家族中首位被發(fā)現(xiàn)的成員，其可啟動細胞表面多個蛋白級聯(lián)反應(yīng)［4］。MMP-14和MMP-2有著密切關(guān)系，前者可以激活細胞膜上的 MMP-2，促進腫瘤生長［4］。

田振囡等［5］研究報道MMP-2和MMP-14在乳腺癌中高表達且表達與腫瘤大小和腋窩淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)。江州華等［6］研究報道MMP2及MMPl4在胃癌中高表達，且與胃癌的浸潤深度、淋巴管浸潤、區(qū)域淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及TNM分期有關(guān)。本研究表明，MMP-14蛋白與MMP-2蛋白在喉癌組織中高度表達，且與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、臨床分期及病理分級有關(guān)，伴隨淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、臨床分期晚、病理分級低時，MMP-14蛋白及MMP-2蛋白顯高表達。提示MMP-14、MMP-2可促進腫瘤的生長，侵襲和轉(zhuǎn)移。MMP-14可以作為臨床上判斷喉癌預(yù)后的指標。

RECK基因是日本學(xué)者Takahashi于1998年發(fā)現(xiàn)的，它可抑制MMPs的表達與活動，有關(guān)研究顯示，有3中基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)能被RECK調(diào)節(jié):MMP-2、MMP-9和MMP-14，而在腫瘤侵潤轉(zhuǎn)移過程中涉及到的主要蛋白水解酶有MMP-2和MMP-9。膜錨定的RECK通過與 RECK結(jié)合并相互作用，使 MMP-2、MMP-9及MMP-14的活性受到影響，阻礙血管新生，誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡。

有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，RECK與腫瘤預(yù)后密不可分，陽性表達患者的預(yù)后要優(yōu)于陰性表達的患者，由此可以推斷出高表達RECK可使腫瘤細胞的侵襲和轉(zhuǎn)移受到阻礙［7］。周湘濤等［8］報道，RECK 在胃癌組織中低表達且與分化程度、浸潤深度和有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有顯著相關(guān)性。張潔等［9］研究報道，RECK在非小細胞肺癌組織中的表達水平較非癌組織顯著降低，RECK蛋白表達與TNM分期有密切關(guān)系。張?zhí)毂氲龋?0］報道RECK蛋白在口腔鱗癌組織中的表達，明顯低于正?？谇火つそM織，與有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、組織學(xué)分級及侵潤程度有關(guān)。

由本研究結(jié)果可見:(1)相對癌旁組織與正常組織，RECK基因在喉癌組織中為低表達，提示其可能影響喉癌的發(fā)生。(2)RECK的表達在有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、臨床分期越晚、病理分級越低的情況下為低表達，而與喉癌的臨床分型無關(guān)，證明RECK參與并抑制了喉癌細胞的侵襲和轉(zhuǎn)移，發(fā)揮了腫瘤轉(zhuǎn)移抑制基因的作用。(3)RECK基因和MMP-14、MMP-2之間存在顯著的負相關(guān)線性關(guān)系，說明RECK基因抑制喉癌侵襲和轉(zhuǎn)移的機制有可能通過下調(diào)MMP-14及MMP-2蛋白的表達來實現(xiàn)，更深層次的機制尚待進一步研究。

綜上，MMP-2蛋白和MMP-14蛋白在喉癌中的高表達且與臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、病理分化程度有關(guān)，可作為喉癌惡性程度的預(yù)測因子。RECK在喉癌組織中的表達低于癌旁組織及正常黏膜組織，RECK基因表達水平高的患者預(yù)后明顯好于表達水平低的患者，說明RECK可能通過抑制MMPs從而抑制腫瘤的進展，這就提示我們可以通過運用上調(diào)癌細胞中RECK表達的藥物或類似物來阻止腫瘤的侵襲及轉(zhuǎn)移。

1 Taniwaki K，F(xiàn)ukamachi H，Komori K，et al.Stroma-derived matrix metalloproteinase(MMP)-2 promotes membrane type l-MMP dependent tumor growth in mice.Camcer Res，2007，67:4311-4319.

2 Wang A，Zhang B，Huang H，et al.Suppression of local invasion of ameloblastoma by inhibition of matrix metalloproteinase-2 in vitro.BMC Cancer，2008，8:182-185.

3 Toshimiehi A，Mitsuhiro T，Cheng SQ，et al.Prognnostic values of matrix metalioproteinase family expression in human colorectal carcinoma.Surg Ros，2008，146:32-42.

4 Koyama S.Enhanced Cell surface expression of matrix metalloproteinases and their inhibitors and tumor-induced host response in progression of human gastric cancer.Dig Dis Sci，2004，49:1621-1630.

5 田振囡，李陽，胡楊，等.MMP-2、MMP-14在乳腺癌中的表達及臨床意義.實用腫瘤學(xué)雜志，2010，24:4470450.

6 江州華，吳生華，李小強，等.Wnt5a、MMP2和MMPl4在胃癌中的表達及其對臨床病理特征的影響.中國普外基礎(chǔ)與臨床雜志，2010，17:1077-1082.

7 Noda M，Takahashi C.Recklessness as a hallmark of aggressive cancer.Cancer Sci，2007，98:1659-1665.

8 周湘濤，莊英幟.MMP-9和RECK在胃癌中的表達及意義.臨床醫(yī)學(xué)，2011，24:46.

9 張潔，李雅莉，楊俠，等.RECK蛋自在非小細胞肺癌中的表達及其與MMP-9 的關(guān)系.陜西醫(yī)學(xué)雜志，2012，41:1296-1298.

10 張?zhí)毂?，許丹，關(guān)一夫，等.RECK和MMP-2在口腔鱗癌中的表達及其與侵襲轉(zhuǎn)移關(guān)系研究.中國實用口腔雜志，2010，3:292-294.