杜驍杰，倪 華，王 玲，鄭 峰，胡 丹，王長軍，潘秀珍

豬鏈球菌是一種重要的人獸共患病病原菌，有33個血清型[1]。2型豬鏈球菌致病力最強，可引起腦膜炎、關節(jié)炎、敗血癥等[2]。信號轉導系統(tǒng)對細菌應對外界復雜的環(huán)境變化有著重要的作用。本課題組前期在對2型豬鏈球菌中國強毒株05ZYH33基因組測序的研究中發(fā)現(xiàn)和真核生物同源的絲氨酸/蘇氨酸激酶stk，利用同源重組原理成功構建了stk基因敲除突變株[3]，本文進一步研究stk缺失后細菌生物學特性的變化。

1 材料和方法

1.1實驗菌株、試劑 05ZYH33分離自STSS病人[4]，Δstk為本實驗室前期構建[3]，THB培養(yǎng)基購自美國Difco公司，哥倫比亞血瓊脂培養(yǎng)基為上海梅里埃生物制品有限公司產品，H2O2溶液購自廣東光華科技股份有限公司，革蘭氏染色試劑盒購自北京索萊寶科技股份有限公司，壯觀霉素購自美國Sigma公司。

1.2生長速率比較 參照Pan等[5]方法，將野生株和敲除株接種于THB培養(yǎng)基或添加10%胎牛血清(FBS)的THB培養(yǎng)基中，每隔1 h測定600 nm吸光度值，繪制生長曲線，實驗重復3次。

1.3菌落形態(tài)和溶血活性比較 將野生株和突變株接種于哥倫比亞血瓊脂培養(yǎng)基(5%綿羊血)，培養(yǎng)后觀察兩者在菌落形態(tài)和溶血活性方面有無差別。

1.4形態(tài)學觀察 參照Pan等[5]方法，將野生株和敲除株轉接于加FBS的THB中培養(yǎng)，至對數(shù)中期時進行革蘭氏染色，光學顯微鏡下觀察。制作超薄切片后在透射電鏡下觀察。

1.5H2O2敏感性比較 參照McCluskey等[6]方法進行，略有修改。將野生株和敲除株培養(yǎng)至對數(shù)生長中期，分別將106CFU的兩組細菌和一定的濃度梯度(20 ～120 mmol/L)的H2O2混勻后室溫共孵育15 min，同時設立不加H2O2的對照。倍比稀釋后涂布于THB平板，37 ℃孵育48 h后進行菌落計數(shù)。每組設立3個重復，實驗重復3次。

1.6全血存活能力比較 參照Jones等[7]對細菌在健康人全血中的存活率進行比較，有修改。將野生株和敲除株培養(yǎng)至對數(shù)生長中期，取10 μL 105CFU/mL的兩組細菌分別與350 μL全血孵育，7 h后涂于THB平板，計算兩組細菌的生存率，實驗重復3次。

2 結 果

2.1生長速率比較 相同濃度的05ZYH33和Δstk在相同的培養(yǎng)條件下培養(yǎng)，繪制野生株與突變株的生長曲線，從圖中可以看出，在單純THB培養(yǎng)基或添加10%FBS的THB培養(yǎng)基中，突變株的生長速率低于野生株(圖1)。

2.2菌落形態(tài)和溶血活性的比較 將05ZYH33和Δstk在哥倫比亞血平板上孵育48 h ，可見二者菌落周圍有明顯的β-溶血環(huán)。然而突變株的溶血活性與野生株沒有多大差異(圖2)。

2.3形態(tài)學觀察 將05ZYH33和Δstk進行革蘭染色，光學顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，兩者染色均為紫色，呈鏈狀排列，然而相比野生株，突變株的鏈狀結構更長。電鏡下觀察菌體形態(tài)均為圓形或橢圓形，突變株形成了多細胞相連的“糖葫蘆”狀結構(圖3)。

2.4H2O2敏感性實驗 將05ZYH33和Δstk進行H2O2敏感性比較，結果發(fā)現(xiàn)在不同的濃度梯度下Δstk的存活率均低于野生株，其中Δstk在60 mmol/L濃度下存活率為0，而05ZYH33在120 mmol/L濃度下存活率為0。

2.5全血存活實驗 05ZYH33和Δstk分別與健康人全血孵育，同時設立空白對照，涂板計數(shù)，計算野生株和突變株的生存率，結果發(fā)現(xiàn)，突變株的生存率低于野生株，兩者具有統(tǒng)計學上的差異(P<0.001)，說明stk的缺失導致細菌在血液中的存活量明顯降低。

圖1生長速率比較

Fig.1Comparisonoftheinvitrogrowthrates

A: Bacteria were cultured in THB at 37 ℃;

B: Bacteria were cultured in THB containing 10% FBS at 37 ℃. OD600, optical density at 600 nm.

圖2溶血活性比較

Fig.2Hemolytic-activityanalysis

A: 05ZYH33; B: △stk

圖3 形態(tài)學觀察

圖4 H2O2敏感實驗

Fig.4ComparisonofthesusceptibilitytoH2O2in05ZYH33andΔstk

圖5 全血存活實驗

3 討 論

本實驗對stk缺失后2型豬鏈球菌的生物學特性做了研究。光學顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)stk缺失株的鏈狀結構長于野生株。電子顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，敲除株形成了多細胞相連的結構，細胞分裂可能受到了影響。 Beilharz等[8]對肺炎鏈球菌STK StkP 對細胞分裂的作用進行研究，發(fā)現(xiàn)StkP作為細胞分裂的調節(jié)蛋白在細胞分裂中具有重要作用。stk缺失株的溶血活性與野生株相似，這與化膿鏈球菌STKsp-stk缺失后溶血活性降低[9]不同，可能的原因是豬鏈球菌中的stk敲除并不影響與溶血活性相關的基因表達。

病原菌侵入宿主時往往會遭遇宿主的免疫抵抗，血液中吞噬細胞釋放的活性氧等物質往往對病原菌造成很大損傷，因此對氧化壓力的抵抗以及在血液中的存活時間是細菌致病能力的重要部分[10]。本研究發(fā)現(xiàn)stk的缺失導致細菌對H2O2敏感性的升高，全血存活的能力降低，提示stk的缺失對細菌致病能力的潛在影響?？傊?，本文揭示了2型豬鏈球菌05ZYH33絲氨酸/蘇氨酸激酶編碼基因缺失后生物學特性的一些變化，說明該激酶的重要調控作用。本課題組將進一步開展stk調控的作用機制研究，從而闡明絲氨酸/蘇氨酸磷酸化系統(tǒng)在豬鏈球菌致病機制過程中的作用。

參考文獻：

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杜驍杰, 王玲, 鄭峰, 等. 豬鏈球菌真核樣絲氨酸/蘇氨酸激酶stk基因敲除株的構建[J]. 中國人獸共患病學報, 2013, 29(12): 1162-1167.

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