高正琴，岳秉飛

灰倉鼠(Cricetulusmigratorius，grey hamster)是嚙齒目(Rodentia)倉鼠科(Cricetidae)倉鼠亞科(Cricetinae)倉鼠屬(Cricetulus)動(dòng)物，棲息于荒漠平原及海拔幾千米以上高山草甸，參與鼠疫、土拉倫、黑熱病、森林腦炎等自然疫源性疾病傳播。高正琴等在2008年和2011年兩次分別對(duì)100多只灰倉鼠攜帶的細(xì)菌進(jìn)行了調(diào)查研究[1-2]。目前，國內(nèi)外尚未見有關(guān)灰倉鼠微生物背景資料的詳細(xì)全面報(bào)道。由于缺乏早期的研究數(shù)據(jù)，特別是沒有灰倉鼠攜帶真菌的多樣性信息，至今中國尚無灰倉鼠質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)。本研究應(yīng)用TaqMan MGB探針實(shí)時(shí)熒光定量PCR和核糖體克隆測序及真菌培養(yǎng)鑒定技術(shù)，首次調(diào)查并分析中國新疆地區(qū)灰倉鼠攜帶真菌的多樣性，以期獲得更全面的微生物多樣性信息，為我國灰倉鼠微生物學(xué)監(jiān)測及質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的制定提供科學(xué)的參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1試劑和樣本來源 真菌培養(yǎng)基、鑒定試劑和抗真菌藥敏片分別購自英國OXOID公司和丹麥ROSCO公司。DNA提取和PCR擴(kuò)增回收試劑盒等分子生物學(xué)試劑購自TaKaRa公司。白假絲酵母(Candidaalbicans)標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC10231和白假絲酵母TaqMan MGB探針實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測試劑由本實(shí)驗(yàn)室提供。60只成年灰倉鼠來自中國新疆地區(qū)，采血分離血清，安樂死后收集被毛、氣管、腸等標(biāo)本。

1.2DNA提取和TaqMan MGB探針實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測 按通用型基因組DNA提取試劑盒說明書操作提取灰倉鼠標(biāo)本DNA。白假絲酵母TaqMan MGB探針熒光定量PCR檢測基因引物探針序列： ITS基因的正向引物GZQCAITSTF：5′- GCTTGAAAGACGGTAGTGGTAAGG-3′；反向引物GZQCAITSTR：5′- CCGCCGCAAGCAATGTTTT-3′；探針GZQCAITSTP：5′- FAM- CCT

AAGCCATTGTCAAAGC-MGB-NFQ-3′。26S rRNA

基因的正向引物GZQCA26STF：5′- GGGCTTGAGATCAGACTTGGTATT-3′；反向引物GZQCA26STR：5′- TGCTGGCCCGGTAAACC-3′；探針GZQCAR26STP：FAM-TTGCATGCTGCTCTCT

C-MGB-NFQ。以提取的DNA為模板，分別使用白假絲酵母ITS基因和26S rRNA基因TaqMan MGB探針實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測試劑上機(jī)?？偡磻?yīng)體系20μL，包括正、反向引物(各900 nmol/L)和探針(250 nmol/L)共1 μL、TaqMan mix 10 μL、模板DNA 1 μL、nuclease-free water 8 μL。循環(huán)參數(shù)：95 ℃ 20 s；95 ℃ 3 s，60 ℃ 30 s，共40個(gè)循環(huán)。應(yīng)用7500型熒光定量PCR儀進(jìn)行檢測。用儀器自帶SDS軟件實(shí)時(shí)觀察PCR熒光擴(kuò)增曲線并采集數(shù)據(jù)。

1.3灰倉鼠真菌分離培養(yǎng)鑒定 取上述灰倉鼠標(biāo)本，分別接種沙堡氏葡萄糖瓊脂斜面、改良馬丁瓊脂斜面、皮膚病原真菌鑒別瓊脂平板，置28 ℃、35 ℃培養(yǎng)3～14 d。將分離獲得的真菌菌株，劃線接種改良馬丁瓊脂平板、皮膚病原真菌鑒別瓊脂平板，置28 ℃、35 ℃培養(yǎng)培養(yǎng)3～14 d。挑取單菌落，接種改良馬丁瓊脂斜面、改良馬丁瓊脂平板、皮膚病原真菌鑒別瓊脂平板、改良馬丁液體培養(yǎng)基，置28 ℃、35 ℃培養(yǎng)3～14 d。通過觀察分離株的菌落生長速度、表面質(zhì)地、顏色、形態(tài)、氣味、滲出物等進(jìn)行大體分類。對(duì)每一類典型菌落進(jìn)行鏡檢，觀察菌絲和孢子形態(tài)和特征、孢子著生部位及排列方式等，攝錄存檔。參照各種真菌形態(tài)描述及檢索表，進(jìn)行真菌菌種初步鑒定[3]。

1.4灰倉鼠真菌藥物敏感性試驗(yàn) 試驗(yàn)選用丹麥ROSCO 公司生產(chǎn)的N eo-Sensitab抗真菌藥敏片：兩性霉素(Amphotericin B，AMPHO；劑量10 μg)、制霉菌素(Nystatin，NYST；劑量50 μg)、酮康唑(Ketoconazole，KETO；劑量15 μg)、咪康唑(Miconazole，MICO；劑量10 μg)、克霉唑(Clotrimazole，CLOTRI；劑量10 μg)、益康唑(Econazole，ECONZ；劑量10 μg)、氟康唑(Fluconazole，F(xiàn)LZ；劑量25 μg)、沃爾康唑(Voriconazole，VOR；劑量1 μg)、特比萘芬(Terbinafine，TEB；劑量30 μg)、氟胞嘧啶(Fluorocytosine，F(xiàn)LU；劑量10 μg)。試驗(yàn)時(shí)用白假絲酵母ATCC 64548進(jìn)行質(zhì)控。

根據(jù)美國臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化委員會(huì)(National Committee for Clinical Laboratory Standard，NCCLS)的規(guī)定，采用瓊脂擴(kuò)散法，將0.5麥?zhǔn)蠁挝徽婢鷳乙壕鶆蛲坎荚? mm厚的改良Shadomy瓊脂培養(yǎng)基表面，經(jīng)35 ℃培養(yǎng)18～24 h后，讀取結(jié)果。藥敏片檢測結(jié)果參考試劑盒內(nèi)所提供的標(biāo)準(zhǔn)。根據(jù)藥敏片周圍真菌被抑制的范圍直徑大小來確定抗真菌藥物對(duì)真菌的抑制作用[4-5]。

1.5真菌核糖體PCR擴(kuò)增和克隆測序鑒定 采用真菌核糖體特定通用引物[6-7]，以抽提的灰倉鼠真菌菌株DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR總反應(yīng)體系為50 μL，包括10×Buffer (Mg2+Plus) 5.0 μL、dNTP Mixture 4.0 μL、正反向引物(20pmol/μL)各1.0 μL、EX Taq(5U/μ L)0. 5μL、模板DNA 1 μL、nuclease-free water 37.5 μL。循環(huán)參數(shù)：95 ℃ 1 min 1 cycle；95℃ 15 s，55℃ 15 s，72℃ 30 s，35個(gè)循環(huán)；72℃ 7 min 1個(gè)循環(huán)。瓊脂糖凝膠電泳檢測真菌PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。將獲得的目的基因片段回收純化并克隆測序鑒定。將所獲得的灰倉鼠真菌基因序列遞交GenBank作進(jìn)一步比對(duì)分析，核實(shí)確定各自種屬。

2 結(jié) 果

2.1灰倉鼠真菌分離培養(yǎng)鑒定結(jié)果 本研究從60只灰倉鼠中共分離培養(yǎng)出60株真菌，編號(hào)為GZQ20120208GH1-GZQ20120208GH60?；覀}鼠不同種類真菌生長培養(yǎng)特性和菌絲孢子形態(tài)顯微攝錄照片見圖1。

本研究利用培養(yǎng)手段從中國新疆灰倉鼠中分離得到60株真菌，經(jīng)初步鑒定分析其主要分布在曲霉屬(Aspergillus)、青霉屬(Penicillium)、絲孢酵母屬(Trichosporon)、假絲酵母屬(Candida)、脈孢菌屬(Neurospora)、間型脈孢菌、枝孢屬(Cladosporium)。具體如下。

煙曲霉(Aspergillusfumigatus)5株(灰倉鼠煙曲霉GZQ20120208GH22、GZQ20120208GH35、GZQ20120208GH47、GZQ20120208GH50、GZQ20

120208GH51在28℃、37℃均能生長，在沙堡氏葡萄糖瓊脂、改良馬丁瓊脂、皮膚病原真菌鑒別瓊脂、改良馬丁液體培養(yǎng)基上生長良好。菌落呈灰藍(lán)綠色，表面有輻射狀溝紋，背面呈黃色。菌落呈致密絨狀，能產(chǎn)生成簇的菌絲體，無特殊氣味。菌絲為有隔菌絲；分生孢子穗圓筒形，呈深淺不同的綠色，分生孢子梗光滑，帶綠色；頂囊燒瓶狀，僅上半部產(chǎn)生孢子；分生孢子球形，有刺，綠色(見圖1中A1、A2、A3)。

焦曲霉(Aspergillusustus)4株(灰倉鼠焦曲霉GZQ20120208GH16、GZQ20120208GH21、GZQ20

120208GH23、GZQ20120208GH43在28℃、37℃均能生長，在沙堡氏葡萄糖瓊脂、改良馬丁瓊脂、皮膚病原真菌鑒別瓊脂、改良馬丁液體培養(yǎng)基上生長良好。菌落呈茶褐色，絮狀，表面有輻狀溝紋，背面呈黃褐色，有淡黃色滲出液。分生孢子球形，褐色(見圖1中B1、B2、B3)。

雜色曲霉(Aspergillusversicolor)4株(灰倉鼠雜色曲霉GZQ20120208GH3、GZQ20120208GH4、GZQ20120208GH33、GZQ20120208GH41在沙堡氏葡萄糖瓊脂、改良馬丁瓊脂、皮膚病原真菌鑒別瓊脂上生長緩慢。菌落呈白色，絲絨狀，表面有輻射狀溝紋，背面呈紅褐色，有滲出液，有霉味。分生孢子球形(見圖1中C1、C2、C3)。

聚多曲霉(Aspergillussydowii)15株(灰倉鼠聚多曲霉GZQ20120208GH11、GZQ20120208GH15、

GZQ20120208GH17、GZQ20120208GH18、GZQ20

120208GH19、GZQ20120208GH20、GZQ20120208

GH24、GZQ20120208GH25、GZQ20120208GH31、GZQ20120208GH34、GZQ20120208GH36、GZQ20

120208GH40、GZQ20120208GH44、GZQ20120208

GH46、GZQ20120208GH52在沙堡氏葡萄糖瓊脂、改良馬丁瓊脂平板、皮膚病原真菌鑒別瓊脂上生長緩慢。菌落呈藍(lán)灰綠色，絲絨狀，表面有輻射狀溝紋，背面呈褐色，有滲出液，有霉味。分生孢子橢圓形(見圖1中D1、D2、D3)。

黑曲霉(Aspergillusniger)2株(灰倉鼠黑曲霉GZQ20120208GH1、GZQ20120208GH12在沙堡氏葡萄糖瓊脂、改良馬丁瓊脂上生長良好。菌落呈黑褐色，厚絨狀，表面有射輻狀溝紋，背面呈黃褐色。分生孢子頭褐黑色放射狀，分生孢子梗長短不一。頂囊球形，雙層小梗。分生孢子褐色球形(見圖1中E1、E2)。

日本曲霉(Aspergillusjaponicus)1株(灰倉鼠日本曲霉GZQ20120208GH53在沙堡氏葡萄糖瓊脂、皮膚病原真菌鑒別瓊脂上生長不良。菌落呈紫褐色，絲絨狀，表面有不規(guī)則的淺皺紋，背面淺黃色，無滲出液。分生孢子球形(見圖1中F1)。

宛氏擬青霉(Paecilomycesvariotii)12株(灰倉鼠宛氏擬青霉GZQ20120208GH9、GZQ20120208GH12、GZQ20120208GH32、GZQ20

2.報(bào)表填報(bào)不規(guī)范問題。一是建議加強(qiáng)教育主管部門與財(cái)政部門、財(cái)政業(yè)務(wù)部門與預(yù)算編審部門之間溝通，以便在預(yù)算下達(dá)時(shí)就能保持口徑一致，避免高校財(cái)務(wù)人員憑職業(yè)判斷來填報(bào)。二是建議主管部門每年編制完決算報(bào)表后，組織編報(bào)者進(jìn)行學(xué)習(xí)總結(jié)，指出不規(guī)范的地方及其原因，防止在下一年度會(huì)計(jì)核算中重復(fù)出錯(cuò)。三是建議建立決算報(bào)表員交流平臺(tái)，就如何提高決算報(bào)表質(zhì)量、報(bào)表數(shù)據(jù)分析應(yīng)用等相關(guān)情況展開經(jīng)驗(yàn)討論，有利于統(tǒng)一和提升業(yè)務(wù)能力、操作技能。

120208GH39、GZQ20120208GH42、GZQ20120208

GH49、GZQ20120208GH54、GZQ20120208GH55、GZQ20120208GH56、GZQ20120208GH58、GZQ20

120208GH59、GZQ20120208GH60在沙堡氏葡萄糖瓊脂、改良馬丁瓊脂上生長良好。菌落黃褐色，棉絮狀，背面黃色。分生孢子卵圓形(見圖1中G1、G2)。

產(chǎn)黃青霉(Penicilliumchrysogenum)6株(灰倉鼠產(chǎn)黃青霉GZQ20120208GH5、GZQ20120208GH27、GZQ20120208GH29、GZQ20120208GH30、GZQ20120

208GH45、GZQ20120208GH57在沙堡氏葡萄糖瓊脂、改良馬丁瓊脂上生長緩慢。菌落呈藍(lán)綠色，絲絨狀，表面有輻射狀皺紋，背面淺黃褐色，有滲出液，無特殊氣味。菌絲為有隔菌絲，菌絲被分隔成多個(gè)細(xì)胞，產(chǎn)生分散帚狀枝分生孢子鏈，分生孢子為球形(見圖1中H1、H2)。

黃灰青霉(Penicilliumaurantiogriseum)1株(灰倉鼠黃灰青霉GZQ20120208GH48在沙堡氏葡萄糖瓊脂、改良馬丁瓊脂上生長緩慢。菌落呈青黃色，絲絨狀，表面有輻射狀皺紋，背面黃色，有滲出液，無特殊氣味。菌絲為多細(xì)胞分枝。無性繁殖時(shí)，菌絲發(fā)生直立的多細(xì)胞分生孢子梗。梗的頂端不膨大，但具有可繼續(xù)再分的指狀分枝，每枝頂端有2-3個(gè)瓶狀細(xì)胞，其上各生一串灰綠色分生孢子(見圖1中I1)。 好食脈孢菌(Neurosporasitophila)1株(灰倉鼠好食脈孢菌GZQ20120208GH10在沙堡氏葡萄糖瓊脂、改良馬丁瓊脂上生長良好。菌落呈桔黃色，棉絮狀。具有疏松網(wǎng)狀的長菌絲，有隔膜，分枝，多核；分生孢子卵圓形(見圖1中J1、J2)。

間型脈孢菌(Neurosporaintermedia)2株(GZQ20120208GH37、GZQ20120208GH38)。芽枝狀枝孢(Cladosporiumcladosporioides)1株(GZQ20120208GH14)。

白假絲酵母(Candidaalbicans)1株(灰倉鼠白假絲酵母GZQ20120208GH26在28℃、37℃均能生長，在沙堡氏葡萄糖瓊脂、改良馬丁瓊脂、皮膚病原真菌鑒別瓊脂上生長良好。菌落呈乳白色，乳酪樣。假菌絲旁有卵圓形孢子(見圖1中K1、K2、K3)。

圖1 灰倉鼠真菌培養(yǎng)特性和形態(tài)照片

GH7、GZQ20120208GH8、GZQ20120208GH13、GZQ20120208GH28在沙堡氏葡萄糖瓊脂、改良馬丁瓊脂上生長緩慢。菌落初呈灰白色、薄膜樣，稍濕潤，其后變?yōu)槿辄S色、顆粒狀、表面明顯皺褶。分支分隔透明菌絲，橢圓形孢子，節(jié)孢子生出多個(gè)牙和牙管(見圖1中L1、L2)。

部分生長不良及形態(tài)特征難以分辨的真菌菌株結(jié)合真菌核糖體基因克隆測序結(jié)果比對(duì)分析核實(shí)。本研究中灰倉鼠真菌分離培養(yǎng)鑒定結(jié)果顯示，曲霉菌是最主要優(yōu)勢菌群，青霉菌是次優(yōu)勢菌群。

2.2灰倉鼠真菌藥物敏感性試驗(yàn)結(jié)果 對(duì)灰倉鼠真菌進(jìn)行藥物敏感性試驗(yàn)，獲得較好結(jié)果的有白假絲酵母(GZQ20120208GH26)、煙曲霉(GZQ201202

08GH22、GZQ20120208GH50、GZQ20120208GH51)、焦曲霉(GZQ20120208GH16)、日本曲霉(GZQ2012 0208GH53)，結(jié)果顯示，這些菌株對(duì)制霉菌素、克霉唑、沃爾康唑等藥物敏感(表1)。

表1 灰倉鼠真菌藥敏試驗(yàn)

2.3TaqMan MGB探針實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測結(jié)果 本研究應(yīng)用白假絲酵母TaqMan MGB探針實(shí)時(shí)熒光定量PCR從灰倉鼠中檢出1份陽性樣本GZQ20120208GH26(圖略)，該真菌菌株ITS和26S rRNA基因克隆測序結(jié)果已GenBank中與公布的Candidaalbicans核苷酸同源性高達(dá)100%(表略)，其形態(tài)特征、培養(yǎng)特性和藥敏結(jié)果均與白假絲酵母相似，命名為CAcm0208GH26，此為國內(nèi)外首次發(fā)現(xiàn)灰倉鼠感染白假絲酵母(另文報(bào)道)。

2.4真菌核糖體PCR擴(kuò)增和克隆測序結(jié)果 采用真菌通用引物，對(duì)抽提的灰倉鼠真菌DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測，結(jié)果獲得60株真菌的核糖體基因目的片段(圖略)，將獲得60個(gè)目的基因片段回收純化后進(jìn)行克隆，選取60個(gè)分別插入目的基因片段的陽性重組質(zhì)粒進(jìn)行PCR擴(kuò)增、酶切鑒定和測序(圖表略)。將獲得的60株灰倉鼠真菌核糖體基因序列在NCBI上進(jìn)行Blast在線比對(duì)分析，結(jié)果顯示灰倉鼠核糖體基因序列與GenBank中已公布的相關(guān)真菌序列同源性為99%～100%。

根據(jù)分離菌株核糖體基因克隆測序結(jié)果比對(duì)分析，60株灰倉鼠真菌菌株被證明是分布在曲霉屬、青霉屬、絲孢酵母屬、假絲酵母屬、脈孢屬、枝孢屬。具體分布如下：黑曲霉2株3.33%(2/60)、煙曲霉5株8.33%(5/60)、焦曲霉4株6.66%(4/60)、雜色曲霉4株6.66%(4/60)、日本曲霉1株1.66%(1/60)、聚多曲霉15株25%(15/60)、黃灰青霉1株1.66%(1/60)、產(chǎn)黃青霉6株10%(6/60)、宛氏擬青霉12株20%(12/60))、阿薩絲孢酵母5株8.33%(5/60)、白假絲酵母1株1.66%(1/60)、好食脈孢菌1株1.66%(1/60)、間型脈孢菌2株3.33%(2/60)、芽枝狀枝孢1株1.66%(1/60)。真菌核糖體基因克隆測序比對(duì)分析結(jié)果顯示灰倉鼠真菌具有多樣性和豐富性(表2)。

3 討 論

到目前為止，本文是第一個(gè)對(duì)灰倉鼠真菌多樣性作了報(bào)道。作者首先以沙堡氏葡萄糖瓊脂、改良馬丁瓊脂、皮膚病原真菌鑒別瓊脂、改良馬丁液體培養(yǎng)基為灰倉鼠真菌分離培養(yǎng)的基礎(chǔ)培養(yǎng)基和鑒別培養(yǎng)基，分別選擇在28 ℃、35 ℃適應(yīng)性培養(yǎng)3～14 d，獲得具有不同生長活性的灰倉鼠真菌分離株60株，最終明確了各類真菌的最佳培養(yǎng)條件和生長狀況。

表2 灰倉鼠真菌核糖體基因克隆測序

表2續(xù)1

Sequence no.DescriptionIdentitiesAccessionGZQ20120208GH26-26SAspergillus sydowii516/516 (100%)JN938955.1GZQ20120208GH26-ITSAspergillus sydowii460/460 (100%)KC253961.1GZQ20120208GH26-26SCandida albicans558/558 (100%)KF214375.1GZQ20120208GH26-ITSCandida albicans472/472 (100%)KF306280.1GZQ20120208GH27-26SPenicillium chrysogenum557/557 (100%)KF417576.1GZQ20120208GH27-ITSPenicillium chrysogenum534/535 (99%)JX996995.1GZQ20120208GH28Trichosporon asahii/GZQ20120208GH29-26SPenicillium chrysogenum557/557 (100%)KF417576.1GZQ20120208GH29-ITSPenicillium chrysogenum533/534 (99%)KC009826.1GZQ20120208GH30-26SPenicillium chrysogenum557/557 (100%)KF417576.1GZQ20120208GH30-ITSPenicillium chrysogenum534/534 (100%)JX996995.1GZQ2012020826S-GH31Aspergillus sydowii557/557 (100%)GU004536.1GZQ20120208ITS-GH31Aspergillus sydowii527/528 (99%)JX232271.1GZQ20120208GH32Paecilomyces variotii/GZQ20120208GH33Aspergillus versicolor/GZQ20120208GH34-26SAspergillus sydowii557/557 (100%)GU004536.1GZQ20120208GH34-ITSAspergillus sydowii520/520 (100%)KF313094.1GZQ20120208GH35-26SAspergillus fumigatus557/557 (100%)FJ867935.1GZQ20120208GH35-ITSAspergillus fumigatus554/555 (99%)KC461526.1GZQ20120208GH36-26SAspergillus sydowii557/557 (100%)EF652473.1GZQ20120208GH36-ITSAspergillus sydowii520/520 (100%)KF313094.1GZQ20120208GH37-26SNeurospora intermedia546/546 (100%)AY681149.1GZQ20120208GH37-ITSAspergillus versicolor500/500 (100%)JX232271.1GZQ20120208GH38-26SAspergillus sydowii557/557 (100%)GU004536.1GZQ20120208GH38-ITSNeurospora intermedia523/523 (100%)JX045846.1GZQ20120208GH39-26SPaecilomyces variotii557/557 (100%)FJ345354.1GZQ20120208GH40-ITSAspergillus sydowii520/520 (100%)KF313094.1GZQ20120208GH41Aspergillus versicolor/GZQ20120208GH42-ITSPaecilomyces variotii559/565 (99%)KC254066.1GZQ20120208GH43-26SAspergillus ustus557/557 (100%)JN938940.1GZQ20120208GH43-ITSAspergillus ustus523/523 (100%)AY213637.1GZQ20120208GH44Aspergillus sydowii/GZQ20120208GH45-26SPenicillium chrysogenum557/557 (100%)KF417576.1GZQ20120208GH45-ITSPenicillium chrysogenum537/537 (100%)KF417576.1GZQ20120208GH46-ITSAspergillus sydowii460/460 (100%)KF313094.1GZQ20120208GH47-26SAspergillus fumigatus557/557 (100%)FJ867935.1GZQ20120208GH47-ITSAspergillus fumigatus550/550 (100%)FJ867935.1GZQ20120208GH48-26SPenicillium aurantiogriseum557/557 (100%)KC146370.1GZQ20120208GH48-ITSPenicillium aurantiogriseum536/538 (100%)JF311946.1GZQ20120208GH49-26SPaecilomyces variotii557/557 (100%)FJ345354.1GZQ20120208GH49-ITSPaecilomyces variotii555/560 (99%)KC254066.1GZQ20120208GH50-26SAspergillus fumigatus557/557 (100%)FJ867935.1GZQ20120208GH50-ITSAspergillus fumigatus548/548 (100%)FJ867935.1GZQ20120208GH51-26SAspergillus fumigatus556/557 (99%)FJ867935.1GZQ20120208GH51-ITSAspergillus fumigatus550/550 (100%)FJ867935.1GZQ20120208GH52-26SAspergillus sydowii557/557 (100%)GU004536.1GZQ20120208GH52-ITSAspergillus sydowii520/520 (100%)KF313094.1

表2續(xù)2

Sequence no.DescriptionIdentitiesAccessionGZQ20120208GH53-ITSAspergillus japonicus/GZQ20120208GH54-26SPaecilomyces variotii557/557 (100%)FJ345354.1GZQ20120208GH54-ITSPaecilomyces variotii499/500 (100%)GQ351694.1GZQ20120208GH55-26SPaecilomyces variotii557/557 (100%)FJ345354.1GZQ20120208GH55-ITSPaecilomyces variotii457/461 (99%)KC895544.1GZQ20120208GH56-26SPaecilomyces variotii557/557 (100%)FJ345354.1GZQ20120208GH56-ITSPaecilomyces variotii394/399 (99%)KC254066.1GZQ20120208GH57-26SPenicillium chrysogenum557/557 (100%)KF417576.1GZQ20120208GH57-ITSPenicillium chrysogenum556/556 (100%)JX136729.1GZQ20120208GH58-26SPaecilomyces variotii557/557 (100%)FJ345354.1GZQ20120208GH58-ITSPaecilomyces variotii559/565 (99%)KC254066.1GZQ20120208GH59-26SPaecilomyces variotii557/557 (100%)FJ345354.1GZQ20120208GH59-ITSPaecilomyces variotii559/565 (99%)GU968674.1GZQ20120208GH60-26SPaecilomyces variotii557/557 (100%)FJ345354.1GZQ20120208GH60-ITSPaecilomyces variotii504/515 (99%)GU968674.1

通過實(shí)時(shí)監(jiān)測攝錄，獲得多種真菌在不同培養(yǎng)基上的生長特性表現(xiàn)和菌絲孢子形態(tài)學(xué)寶貴視頻資料。參考文獻(xiàn)[3]中描述的菌落特征、顯微菌絲和孢子特征進(jìn)行分類鑒定，對(duì)灰倉鼠真菌的歸類有了初步了解?？偟膩碚f，60株真菌中曲霉屬和青霉屬真菌用常規(guī)方法比較容易鑒別，但絲孢酵母屬、假絲酵母屬、脈孢屬、枝孢屬卻因生長不良或形態(tài)特征不典型而難以辨別。為了彌補(bǔ)常規(guī)方法的不足，在本研究中，作者首次應(yīng)用熒光定量PCR和基因克隆測序技術(shù)，對(duì)獲得的有生長活性的60株灰倉鼠真菌分離株進(jìn)行了基因水平上的核實(shí)確定，為真菌菌種的快速準(zhǔn)確鑒定提供了新的思路，對(duì)真菌的分離鑒定和菌種庫的建立具有一定的指導(dǎo)意義。本研究通過對(duì)灰倉鼠真菌數(shù)量和真菌的主要類群的研究，為研究灰倉鼠微生物多樣性提供了原始材料和數(shù)據(jù)資料，也為今后的深入研究提供研究基礎(chǔ)。

真核物種的總數(shù)在地球上最近估計(jì)為870萬，真菌占大約7%這個(gè)數(shù)字(611000種)。所有的真菌，其中大約有600種是人類病原體。本研究獲得的60株灰倉鼠真菌主要為曲霉屬、青霉屬、絲孢酵母屬、假絲酵母屬、脈孢屬、枝孢屬的真菌。參考文獻(xiàn)[8-11]人獸共患病病原體中100多種真菌名錄，顯示本研究中灰倉鼠攜帶的白假絲酵母、阿薩絲孢酵母、聚多曲霉、煙曲霉、焦曲霉、雜色曲霉、黑曲霉、日本曲霉、宛氏擬青霉、產(chǎn)黃青霉、黃灰青霉、好食脈孢菌、間型脈孢菌、芽枝狀枝孢等近20種真菌是人獸共患病病原體。白假絲酵母感染可引起肺炎、腸胃炎、心內(nèi)膜炎、腦膜炎、腦炎、敗血癥等。阿薩絲孢酵母可引起白毛結(jié)節(jié)病、皮膚及播散性絲孢酵母菌病。煙曲霉、焦曲霉、黑曲霉、雜色曲霉感染所致侵襲性肺曲霉病是致死性感染的主要原因[12-16]。目前，我國正處在對(duì)灰倉鼠進(jìn)行實(shí)驗(yàn)動(dòng)物化的馴化進(jìn)程中，因此，及時(shí)準(zhǔn)確做好新培育物種微生物監(jiān)測分析工作，對(duì)預(yù)防控制相關(guān)人獸共患疫病爆發(fā)流行作用巨大。

綜上所述，本研究應(yīng)用TaqMan MGB探針實(shí)時(shí)熒光定量PCR、核糖體克隆測序、真菌培養(yǎng)鑒定技術(shù)，首次對(duì)灰倉鼠攜帶真菌的多樣性進(jìn)行了研究，獲得了較為全面的結(jié)果。數(shù)據(jù)分析結(jié)果證明灰倉鼠體內(nèi)生存著大量的真菌種類，具有豐富的真菌群落多樣性和復(fù)雜性。今后，我們還將進(jìn)一步應(yīng)用宏基因組分析技術(shù)，對(duì)灰倉鼠中可能存在但用現(xiàn)行培養(yǎng)方法無法獲得的微生物展開深入調(diào)查研究，獲得更多更全面的關(guān)于灰倉鼠微生物多樣性的數(shù)據(jù)，為我國灰倉鼠微生物學(xué)監(jiān)測以及質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的制定提供科學(xué)參考依據(jù)，也為灰倉鼠這一具有特殊潛力、尚待實(shí)驗(yàn)動(dòng)物化的物種新資源的開發(fā)提供有效理論依據(jù)和豐富基礎(chǔ)研究。

參考文獻(xiàn)：

[1]Gao ZQ, He ZM, Yue BF, et al. Identification and susceptibility test of bacteria isolated from the trachea and ileocecal junction of grey hameters which came from Xinjiang area of China[J]. Lab Anim Comp Med, 2009, 29 (2): 93-99. (in Chinese)

高正琴, 賀爭鳴, 岳秉飛, 等. 中國灰倉鼠氣管和回盲部細(xì)菌分離鑒定及藥敏試驗(yàn)[J]. 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與比較醫(yī)學(xué). 2009, 29(2): 93-99.

[2]Gao ZQ, Xing J, Feng YF, et al.Monitor and analysis bacterial diversity of Cricetulus migratorius by TaqMan MGB probe real-time fluorescence quantitative PCR and bacteria isolation culture[J]. Chin J Pharm Anal, 2014, 34(2):22-28. (in Chinese)

高正琴, 邢進(jìn), 馮育芳, 等. 應(yīng)用TaqMan MGB探針實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)合分離培養(yǎng)監(jiān)測分析灰倉鼠細(xì)菌多樣性[J]. 藥物分析雜志. 2014, 34(2): 221-227.

[3]Wei JC. The identification manual of fungi[M]. Shanghai: Shanghai Science and Technology Press: 1979. (in Chinese)

魏景超. 真菌鑒定手冊(cè)[M]. 上海: 上海科技出版社出版: 1979.

[4]Espinel-Ingroff A, Canton E, Fothergill A, et al. Quality control guidelines for amphotericin B, Itraconazole, posaconazole, and voriconazole disk diffusion susceptibility tests with nonsupplemented Mueller-Hinton Agar (CLSI M51-A document) for nondermatophyte filamentous fungi[J]. J Clin Microbiol, 2011, 49(7): 2568-2571. DOI: 10.1128/JCM.00393-11.

[5]National Committee for Clincial Laboratory Standards. Method for antifugal disk diffusion susceptibility testing of yeasts: approved guideline M44-A[S]. Wayne: NCCLS, 2004.

[6]White TJ, Bruns T, Lee S, et al. Amplification and direct sequencing of fungal ribosomal RNA genes for phylogenetics[M]. In: Innis MA, Gelfand DH, Sninsky JJ, et al., editors. PCR protocols: a guide to methods and application. New York: Academic Press Inc. 1990: 315-322.

[7]Kurtzman CP, Robnett CJ. Identification of clinically important ascomycetous yeasts based on nucleotide divergence in the 5′ end of the large-subunit (26S) ribosomal DNA gene[J]. J Clin Microbiol, 1997, 35(5): 1216-1223.

[8]Mora C, Tittensor DP, Adl S, et al. How many species are there on Earth and in the ocean? [J]. PLoS Biol, 2011, 9(8): 1-8. DOI: 10.1371/journal.pbio.1001127

[9]Taylor LH, Latham SM, Woolhouse ME. Risk factors for human disease emergence[J]. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci,2001, 356 (1411): 983-989. DOI: 10.1098/rstb.2001.0888

[10]Woolhouse ME, Gowtage-Sequeria S. Host range and emerging and reemerging pathogens[J]. Emerg Infect Dis,2005, 1(12): 1842-1847. DOI: 10.3201/eid1112.050997

[11]Yu ES, Huang F, Pan L, et al. Zoonotic pathogens species[J]. Chin J Zoonoses, 2006, 22 (6): 485-492. (in Chinese)

于恩庶, 黃豐, 潘亮, 等. 當(dāng)今人獸共患病病原體分類[J]. 中國人獸共患病學(xué)報(bào)，2006, 22 (6): 485-492.

[12]Mayer FL, Wilson D, Hube B.Candidaalbicanspathogenicity mechanisms[J]. Virulence, 2013, 4(2): 119-128. DOI: 10.4161/viru.22913

[13]Servonnet A, Bourgault M, Trueba F, et al. DisseminatedTrichosporonasahiiinfection[J]. Ann Biol Clin, 2010, 68(3): 363-366. DOI: 10.1684/abc.2010.0444

[14]Dagenais TR, Keller NP. Pathogenesis ofAspergillusfumigatusin invasive aspergillosis[J]. Clin Microbiol Rev, 2009, 22(3): 447-465. DOI: 10.1128/CMR.00055-08

[15]Person AK, Chudgar SM, Norton BL, et al.Aspergillusniger: an unusual cause of invasive pulmonary aspergillosis[J]. J Med Microbiol, 2010, 59(7): 834-838. DOI: 10.1099/jmm.0.018309-0

[16]Charles MP, Joseph NM, Easow JM, et al. Invasive pulmonary aspergillosis caused byAspergillusversicolorin a patient on mechanical ventilation[J]. Australas Med J, 2011, 4(11): 632-634. DOI: 10.4066/AMJ.2011.905