陳 璐，吾拉木·馬木提，張德亭，金一幫

棘球蚴病(Echinococcosis)又稱包蟲病(hydatid disease)，是由棘球?qū)?Echinococcus)絳蟲的幼蟲—棘球蚴(metacestode ofEchinococcusor hydatid cyst)寄生于偶蹄或嚙齒類動物以及人體所致的一種嚴(yán)重危害人體健康和阻礙畜牧業(yè)發(fā)展的慢性人獸共患寄生蟲病[1]。該病在我國主要是綿羊/犬動物循環(huán)，因此建立一種有效檢測感染犬的方法，并結(jié)合進(jìn)行徹底驅(qū)蟲治療，將切斷棘球絳蟲終末宿主向中間宿主的傳播途徑，成為防治包蟲病的重要措施和有力手段。隨著人們對于寄生蟲病在分子生物領(lǐng)域的不斷深入研究，一種全新的核酸擴(kuò)增技術(shù)—環(huán)介導(dǎo)的等溫擴(kuò)增技術(shù)(Loop-mediated isothermal amplification，LAMP)越來越受到研究人員的親睞。該方法是由日本學(xué)者Notomi 等[2]首先提出，其特點是針對靶基因的6個獨立區(qū)域設(shè)計兩對特異引物，在鏈置換 DNA 聚合酶(Bst DNA polymerase)的作用下，恒溫水浴(60～65℃)30～60 min可將原有幾個拷貝的靶核酸擴(kuò)增到109水平[3]。

1 材 料

1.1儀器與試劑 PCR 擴(kuò)增儀 (BIO-RAD) ；DYY-6D型電泳儀 (北京市六一儀器廠) ；凝膠成像儀 (Gel Doc 2000 BIO-RAD) ；DK-8D 電熱恒溫水槽 (上海精宏) ；Bst DNA Polymerase(Biolabs)；Betaine(Sigma)；氨芐青霉素(Sigma); MgSO4(Invitrogen)；SYBR GreenI(Invitrogen)；蛋白酶K(Merk)；酚：氯仿：異丙醇(25∶24∶1)；DNA Ladder；Taq plus DNA 聚合酶；dNTP 均購自大連寶生物公司，糞便提取試劑盒(QIAGEN)膠回收試劑盒(Bioteke)；消化液(NaCl 100 mmol/L，EDTA 25 mmol/L，Tris-HCl 100 mmol/L pH=8.0，DNA沉降液NaCl 100 mmol/L，10% SDS)。

1.2菌種與質(zhì)粒 pEASY-T1載體、E.coliDH5ɑ購自上海生工生物工程有限公司。

1.3寄生蟲標(biāo)本 多房棘球絳蟲、細(xì)粒棘球絳蟲、犬蛔蟲、泡狀帶絳蟲、肥胖帶絳蟲成蟲，牛囊尾蚴均由新疆醫(yī)科大學(xué)寄生蟲教研室提供，均保存于液氮中。

1.4犬糞便標(biāo)本 6份E.m實驗感染陽性犬糞由青海省疾病控制中心采集提供；2份單純?nèi)谆紫x感染剖檢犬糞和4份單純?nèi)轄顜Ы{蟲感染犬糞便樣本采自四川省石渠縣；11份剖檢細(xì)粒棘球絳蟲絳蟲陽性犬糞標(biāo)本采自新疆博爾塔拉蒙古自治州巴音布勒克加克查鄉(xiāng)；8份人工感染細(xì)粒棘球絳蟲犬糞和15份未感染健康犬糞取自實驗室留樣。

2 方 法

2.1寄生蟲DNA模板的制備 按酚氯仿DNA經(jīng)典提取法進(jìn)行:①取100～300 mg -80℃凍存的細(xì)粒棘球絳蟲成蟲標(biāo)本，于研缽中液氮研磨3～5次，待組織研碎呈粉末狀，將粉末刮入1.5 mL離心管中稱得凈重0.3 g。②按1.2 mL/100 mg，加入1 200 μL消化液，蛋白酶K(20 mg/mL)加入30 mL，10%的SDS加10 μL，溫和混勻，56 ℃恒溫水浴消化過夜。③從水浴鍋中取出過夜消化的標(biāo)本，輕柔搖勻，加入等體積的蛋白抽提液：酚∶氯仿∶異戊醇=(24∶25∶1)，放入勻漿器傾斜30°，15 r/min，混勻5 min，至兩相混勻至乳液狀。4 ℃離心，12 000 g×10 min，取上層水相于新的1.5 mL的離心管中。重復(fù)該步驟1次。④取上層水相，加入0.5倍體積的100 mol/L NaCl溶液和兩倍體積的無水乙醇，室溫下緩慢搖勻，-20 ℃冰箱，沉降1 h。4 ℃離心，12 000 g×5 min，小心棄去上清。⑤在沉淀內(nèi)加入1 mL 70%乙醇，輕柔洗滌沉淀。5 000 g×5 min，4 ℃，小心棄去上清。⑥用干凈濾紙小心吸去殘留的乙醇，超凈臺晾干通風(fēng)干燥5～10 min，待干燥，加入50 μL的TE液溶解。

2.2棘球絳蟲ND2基因的克隆及標(biāo)準(zhǔn)管的建立 設(shè)計ND2基因(GenBank: AF297617.1,G1基因型)的上下游引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，上游引物TGTCTATATTTGTGTGCAGGT，下游引物TCTGTTAAATCAGAGACGACC，反應(yīng)體系為20 μL，模板DNA 1.0 μL，上、下游引物(10 μmol/L)各0.5 μL，10×PCRmix Buffer 2.0 μL，ddH2O 13.5 mL,Taq酶0.5 μL反應(yīng)條件為：①95 ℃ 5 min，②95 ℃ 30 s，③ 59 ℃ 30 s，④72 ℃ 30 s，⑤72 ℃ 6 min，⑥4 ℃∞。其中②～④步循環(huán)30次。擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳,紫外燈下觀察結(jié)果，將208 bp的目的擴(kuò)增片段切膠回收后，與pEASY-T1載體連接，25 ℃反應(yīng)10 min將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入E.coliDH5ɑ感受態(tài)細(xì)胞，接種于含50 μg/μL氨芐青霉素的LB平板，通過藍(lán)白斑菌落篩選含目的基因的白色菌落，37 ℃培養(yǎng)過夜。送測序鑒定，作為LAMP反應(yīng)靈敏性和特異性的標(biāo)準(zhǔn)陽性對照。

2.3犬糞DNA提取 將收集的犬糞在-80 ℃凍存1周滅活蟲卵。糞便DNA的提取按照Qiagen mini stool kit試劑盒(德國)說明書進(jìn)行。每次稱取0.22 g糞便,同一標(biāo)本不同部位取2份,同時提取DNA。獲得的DNA立即進(jìn)行PCR或儲存于-20 ℃?zhèn)溆谩?/p>

2.4檢測棘球絳蟲LAMP引物 針對細(xì)粒棘球絳蟲mtDNA的ND2基因序列(登陸號：GenBank:AF297617.1)的六個位點設(shè)計引物以及針對，通過PrimerExplorer V4設(shè)計四條LAMP引物(序列見表1)，其中包括2條外引物(F3、B3)和2條內(nèi)引物分別為FIP和BIP。以上引物序列由北京英駿公司合成。運用DNAman設(shè)計酶切位點(見圖1)。

表1 細(xì)粒棘球絳蟲 LAMP寡核苷酸引物序列

圖1 細(xì)粒棘球絳蟲線粒體ND2基因 (登錄號:AF297617.1) 4條 LAMP 引物靶序列

Fig.1NucleotidesequencesoftargetsforprimersintheLAMPassayonEchinococcusgranulosus(E.g)

The sequences are AF297617.1 and MseI enzyme site.

2.5LAMP檢測棘球絳蟲 反應(yīng)體系25 μL：模板DNA 1.0 μL，H2O 7.5 μL ，F(xiàn)IP、BIP(40 μmol/L)各1.0 μL，F(xiàn)3、B3(10 μmol/L)各0.5 μL，10×Bst DNA Polymerase Buffer 2.5 μL，dNTP Mixture(10 mmol/L) 3.5 μL，Betaine(5 mol/L)5.0 μL，MgSO4(50 mmol/L)1.5 μL，Bst DNA Polymerase (8 U/μL) 1.0 μL，ddH2O 6.5 μL，混勻后輕微離心，水箱 63 ℃孵育 60 min，80 ℃ 10 min滅活酶結(jié)束 LAMP 反應(yīng)。

2.6LAMP擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測

2.6.1加染料后檢測 每25 μL體系的反應(yīng)管加1000×SYBR Green I 1～2 μL，1～5 min觀察結(jié)果，反應(yīng)液變綠為陽性，保持橙色或棕色為陰性。

2.6.2電泳檢測 2 μL擴(kuò)增產(chǎn)物與0.4 μL上樣緩沖液混勻后點樣于含0.8 μg/mL 溴化乙錠的1.5～2 %瓊脂糖凝膠中，70 V電泳約60 min，電泳圖片顯示LAMP特征性梯狀條帶，則結(jié)果為陽性；無任何條帶則結(jié)果為陰性。

2.7棘球絳蟲LAMP擴(kuò)增產(chǎn)物的酶切鑒定 利用限制性內(nèi)切酶進(jìn)行LAMP擴(kuò)增產(chǎn)物鑒定，選取MseI限制性內(nèi)切酶，酶切位點見圖1，20 μL酶切反應(yīng)體系如下: 10.0 μL LAMP產(chǎn)物；4.8 μL ddH2O；2.0 μL MseI 10×buffer ；3.0 μL MseI(10 U/μL)?；靹蚝?6 ℃ 過夜。MseI 酶切片段計算[2]。

2.8PCR檢測棘球絳蟲 利用F3和B3作為PCR擴(kuò)增細(xì)粒棘球絳蟲的上、下游引物，反應(yīng)體系為25 μL，模板DNA 1.0 μL，F(xiàn)3、B3(10 μmol/L)各1.0 μL，10×PCRmix Buffer 12.5 μL，ddH2O 9. 5 μL。反應(yīng)條件為：①95℃ 4 min，②95 ℃ 30 s，③ 59 ℃ 30 s，④ 72 ℃ 30 s，⑤ 72 ℃ 7 min，⑥4℃ ∞。其中②～④步循環(huán)35次。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行100 V 瓊脂糖電泳30 min后觀察有無預(yù)期大小的目的DNA片段208 bp。

2.9LAMP和PCR檢測細(xì)粒棘球絳蟲ND2基因標(biāo)準(zhǔn)重組質(zhì)粒的特異性分析 將多房棘球絳蟲、犬弓首蛔蟲、泡狀帶絳蟲、肥胖帶絳蟲成蟲、牛囊尾蚴，作為對照組，利用上述LAMP和PCR反應(yīng)體系同時檢測對5種對照組寄生蟲和細(xì)粒棘球絳蟲提取的DNA進(jìn)行特異性檢測，并對擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行電泳分析。

2.10LAMP和PCR檢測細(xì)粒棘球絳蟲ND2基因標(biāo)準(zhǔn)重組質(zhì)粒的敏感性分析 以細(xì)粒棘球絳蟲線粒體基因ND2片段成功構(gòu)建的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒為檢測對象，對其進(jìn)行梯度稀釋，用消毒滅菌的雙蒸水做10倍梯度稀釋，運用公式，進(jìn)行計算DNA分子拷貝數(shù)分別為4×108(18.2 ng/μL)，4×107(1.82 ng/μL)，4×106(182 pg/μL)，4×105(18.2 pg/μL)，4×104(1.82 pg/μL)，4×103(182 ag/μL)，4×102(18.2 pg/μL)，4×101(18.2 pg/μL)，4×100(1.82 pg/μL)，陰性對照。分別用PCR方法和LAMP法檢測。

3 結(jié) 果

3.1靈敏度檢測比較 經(jīng)pEASY-T1/E.gND2基因片段靈敏度檢測發(fā)現(xiàn)針對E.g線粒體ND2基因設(shè)計的LAMP引物最低檢測下限是4×101copies(18.2 pg/μL)，比普通PCR方法(上下游引物分別為F3-ND2、B3-ND2檢測)高103倍，呈現(xiàn)出較好的敏感度。重復(fù)實驗過程3遍，PCR方法和LAMP法檢測結(jié)果穩(wěn)定(見圖2)，加入SYBE Green I顏色鑒別結(jié)果與電泳結(jié)果相一致(見圖3)

圖2LAMP(左)擴(kuò)增技術(shù)和普通PCR(右)方法敏感性分析比較

M：2000bpDNA分子標(biāo)準(zhǔn)品，1-9為細(xì)粒棘球絳蟲ND2基因標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒梯度稀釋濃度: 4×108(18.2 ng/μL), 4×107(1.82 ng/μL), 4×106(182 pg/μL), 4×105(18.2 pg/μL), 4×104(1.82 pg/μL), 4×103(182 ag/μL), 4×102(18.2 pg/μL), 4×101(18.2 pg/μL), 4×100(1.82 pg/μL), 10為陰性對照。

Fig.2ComparativeanalysisofsensitivityofLAMPassay(left)andconventionalPCR(right)

M: 2 000 bp DNA marker; 1-10:E.gmitochondrial standard recombinant plasmid 4×108(18.2 ng/μL), 4×107(1.82 ng/μL), 4×106(182 pg/μL), 4×105(18.2 pg/μL), 4×104(1.82 pg/μL), 4×103(182 ag/μL), 4×102(18.2 pg/μL), 4×101(18.2 pg/μL), 4×100(1.82 pg/μL), and negative control, respectively.

圖3加入染料SYBRGreenILAMP擴(kuò)增E.gND2標(biāo)準(zhǔn)重組質(zhì)粒的敏感性分析

1-9為細(xì)粒棘球絳蟲ND2基因標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒梯度稀釋濃度: 4×108(18.2 ng/μL), 4×107(1.82 ng/μL), 4×106(182 pg/μL), 4×105(18.2 pg/μL), 4×104(1.82 pg/μL), 4×103(182 ag/μL), 4×102(18.2 pg/μL), 4×101(18.2 pg/μL), 4×100(1.82 pg/μL), 10為陰性對照。

Fig.3AnalysisofsensitivityofLAMPmethodwithE.gND2standardrecombinantplasmidvisualizationbyaddingSYBRGreenI

Lane 1-10:E.gND2 standard recombinant plasmid 4×108(18.2 ng/μL), 4×107(1.82 ng/μL), 4×106(182 pg/μL), 4×105(18.2 pg/μL), 4×104(1.82 pg/μL), 4×103(182 ag/μL), 4×102(18.2 pg/μL), 4×101(18.2 pg/μL), 4×100(1.82 pg/μL), and negative control, respectively.

3.2特異性檢測比較

3.2.1E.g線粒體ND2基因片段重組質(zhì)粒為標(biāo)準(zhǔn)陽性對照的特異性分析 以線粒體ND2基因重組質(zhì)粒為標(biāo)準(zhǔn)陽性對照，將LAMP法與PCR法的特異性進(jìn)行對比，與CO1基因不同[4]，選取ND2基因的特異性LAMP引物除了能夠區(qū)別棘球絳蟲屬與其它腸道寄生蟲，檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)該引物不與E.m發(fā)生交叉反應(yīng)，針對E.g具有較好的特異性(見圖4)。

圖4LAMP(左)和PCR(右)擴(kuò)增細(xì)粒棘球絳蟲ND2基因的標(biāo)準(zhǔn)重組質(zhì)粒的特異性分析

1：細(xì)粒棘球絳蟲ND2基因片段重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)陽性對照；2-7：分別為多房棘球絳蟲、犬弓首蛔蟲、泡狀帶絳蟲、肥胖帶絳蟲成蟲、牛囊尾蚴、陰性對照。

Fig.4SpecificityofLAMPassayinND2E.gstandardplasmid

1:EchinococcusgranulosusDNA; 2:EchinococcusmultilocularisDNA; 3:ToxocaracanisDNA; 4:TaeniahydatigenaDNA; 5:BlisterstaeniaDNA; 6:TaeniasaginataDNA; 7: Negative control.

3.2.2ND2基因LAMP引物的酶切鑒定 利用限制性內(nèi)切酶進(jìn)行LAMP擴(kuò)增產(chǎn)物鑒定，選取MseI限制性內(nèi)切酶，酶切結(jié)果與理論計算一致(見圖5)。

圖5E.gND2基因片段標(biāo)準(zhǔn)重組質(zhì)粒LAMP擴(kuò)增產(chǎn)物MseI酶切片段凝膠電泳分析

M：1000 bp DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)品 1：細(xì)粒棘球絳蟲DNA LAMP 擴(kuò)增產(chǎn)物；2：MseI酶切片段

Fig.5GelelectrophoresisanalysisofMseIrestrictionenzymedigestedfragmentsofLAMPproductofE.gND2genestandardrecombinantplasmid

M: 1 000 bp DNA marker; 1: LAMP products ofE.gDNA; 2: LAMP products after digestion with MseI (224 bp, 131 bp, 96bp).

3.3LAMP法ND2基因檢測46例棘球絳蟲感染犬糞DNA 樣本結(jié)果 運用LAMP 法ND2基因引物檢測46份樣本(重復(fù)3次)，結(jié)果見表2。

表2LAMP法ND2基因引物診斷效果評價

Tab.2TheLAMPmethodEvaluationofDiagnosisinND2gene

LAMPNecropsy+-Total+19120-02626Total192746

4 討 論

鑒于LAMP技術(shù)引物設(shè)計的嚴(yán)格性，特異性引物的篩選，正確的引物設(shè)計是LAMP技術(shù)的關(guān)鍵。該技術(shù)在寄生蟲病檢測及相關(guān)領(lǐng)域的實際應(yīng)用中表現(xiàn)出卓越的靈敏度和特異性[4-7]。本研究選取細(xì)粒棘球絳蟲線粒體基因設(shè)計特異性LAMP引物，正確構(gòu)建了標(biāo)準(zhǔn)重組質(zhì)粒，并將LAMP引物在敏感性和特異性上進(jìn)行了初步評估，針對不能將E.g、E.m兩個相近種屬進(jìn)行鑒別這一情況[4]，研究選取細(xì)粒棘球絳蟲mtDNA ND2(E.gND2)基因設(shè)計LAMP引物，使用GenBank和BLAST軟件進(jìn)行分析篩選，將E.g，E.mND2基因序列同源性比對。結(jié)果同源性為84.13%，最后選定ND2基因種屬差異較大區(qū)域設(shè)計特異性LAMP引物，進(jìn)行靈敏度和特異度的檢測評估，發(fā)現(xiàn)ND2基因LAMP引物進(jìn)行檢測的靈敏度為4×101DNA分子拷貝數(shù)，比普通PCR方法高出103倍 ，在特異性檢測過程中LAMP法不僅區(qū)別出其他絳蟲及常見的犬腸道寄生蟲，還進(jìn)一步鑒別了細(xì)粒棘球絳蟲與多房棘球絳蟲，檢測結(jié)果比CO1基因LAMP引物更加特異[4]。最后將46份提取的犬糞DNA作為評估LAMP法的樣本，研究證明該引物的LAMP檢測結(jié)果與6例E.m糞便樣本，2例犬弓首蛔蟲樣本，4例泡狀帶絳蟲樣本均不發(fā)生交叉反應(yīng)，實驗結(jié)果表明針對E.gND2設(shè)計的LAMP引物表現(xiàn)出較好的靈敏度和特異性，研究總體呈現(xiàn)出較好的檢測結(jié)果。由于實驗檢測樣本數(shù)量有限，尚需后續(xù)進(jìn)一步的流行病學(xué)統(tǒng)計研究。

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