鄒海亮，桂顯偉，陳賀捷，陳 帥，吳向未

（石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院，新疆 石河子 832008）

細(xì)粒棘球蚴?。╟ystic echinococcosis，CE）又叫囊性包蟲(chóng)病、肝包蟲(chóng)病，是指由細(xì)粒棘球絳蟲(chóng)的中絳期幼蟲(chóng)感染引發(fā)的一種人畜共患病[1-3]。此病不僅見(jiàn)于人類(lèi)，也可在綿羊、豬、山羊、駱駝、水牛和馬等動(dòng)物中發(fā)病。目前，臨床上治療CE 的方式首選外科手術(shù)，常用的手術(shù)方式有肝包蟲(chóng)內(nèi)囊摘除術(shù)、肝包蟲(chóng)內(nèi)囊摘除+ 外囊部分摘除術(shù)及肝部分切除術(shù)[4]。對(duì)此病患者進(jìn)行手術(shù)治療存在一定的風(fēng)險(xiǎn)，且術(shù)后其病情有復(fù)發(fā)的可能。對(duì)此病患者進(jìn)行藥物治療雖然可取得一定的效果，但易對(duì)其造成肝損傷[5]。有研究指出，在CE 發(fā)病的過(guò)程中，由成纖維細(xì)胞引起的鈣鹽沉積及成骨作用在促進(jìn)包蟲(chóng)外囊壁的形成中起著重要作用[6]。間充質(zhì)干細(xì)胞（mesenchymal stem cells，MSC）是來(lái)源于動(dòng)物體內(nèi)中胚層的一種多能干細(xì)胞，具有免疫調(diào)節(jié)、抗炎、營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞等多種作用，其具有自我更新與增殖能力，在適宜的微環(huán)境中具有向血管、脂肪、神經(jīng)、軟骨、骨骼等多個(gè)胚層組織和細(xì)胞內(nèi)分化的潛能。在機(jī)體發(fā)生損傷或受到刺激時(shí)，體內(nèi)所儲(chǔ)存的MSC 就會(huì)向損傷部位聚集，定向遷移至損傷部位并進(jìn)行分化，替代損傷的細(xì)胞，以維持機(jī)體的完整性和穩(wěn)定性[7]。在CE 發(fā)展的過(guò)程中，MSC 由于歸巢作用會(huì)在患者體內(nèi)肝臟的受損處與細(xì)粒棘球絳蟲(chóng)或其頭節(jié)產(chǎn)生相互作用，進(jìn)而可對(duì)此病的發(fā)展起到促進(jìn)作用[8]。本文主要是研究將MSC 與細(xì)粒棘球絳蟲(chóng)原頭節(jié)共培養(yǎng)對(duì)細(xì)粒棘球絳蟲(chóng)原頭節(jié)活性的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)原材料

純合子C5/7 小鼠，購(gòu)買(mǎi)于新疆醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心。自然感染CE 的綿羊，購(gòu)買(mǎi)于新疆昌吉屠宰場(chǎng)。

1.2 化學(xué)試劑

磷酸緩沖溶液（PBS），胎牛血清和RPMI DMEM 培養(yǎng)基（均購(gòu)自美國(guó) Gibco-BRL 公司），Caspase-3 檢測(cè)試劑盒（購(gòu)自北京普利萊基因技術(shù)有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 細(xì)粒棘球絳蟲(chóng)原頭節(jié)的體外提取及培養(yǎng)方法 將感染CE 綿羊的肝臟取出，對(duì)肝臟進(jìn)行清洗。準(zhǔn)備好提取細(xì)粒棘球絳蟲(chóng)原頭節(jié)所需的器械和工具，包括無(wú)菌注射器、手術(shù)刀片及刀柄、組織鑷2 ～3 個(gè)、200 ml 的無(wú)菌玻璃瓶。用注射器刺入綿羊肝臟中的包蟲(chóng)囊泡內(nèi)，提取囊液與頭節(jié)的混懸液，將其置于無(wú)菌的玻璃瓶中。用PBS 對(duì)玻璃瓶中的液體進(jìn)行反復(fù)沖洗，棄去上清液，重復(fù)此操作15 次以上。將提純的細(xì)粒棘球絳蟲(chóng)原頭節(jié)置于加有5 ml DMEM 培養(yǎng)液（內(nèi)含10% 的FBS 和1% 的雙抗）的培養(yǎng)瓶中，放入無(wú)菌恒溫培養(yǎng)箱（溫度為37.5℃，內(nèi)含濃度為5% 的二氧化）中培養(yǎng)2 d。2 d 后，采用伊- 紅染色法在倒置顯微鏡下觀察細(xì)粒棘球絳蟲(chóng)原頭節(jié)的活性，若其存活率≥95%，則可用于下一步試驗(yàn)。

1.3.2 MSC 的提取方法 選取3 ～4 周齡的C5/7 小鼠，用頸椎脫臼法將其處死，然后將其放入濃度為75% 的酒精中浸泡10 min。10 min 后取出小鼠，用眼科小器械（小齒鑷、小剪刀）分離出小鼠下肢的長(zhǎng)骨干。用小剪刀剪除長(zhǎng)骨干兩側(cè)的干垢端，用1 ml 的注射器抽取2.5 ml 的DMEM培養(yǎng)液（內(nèi)含10% 的FBS 和1% 的雙抗）反復(fù)沖洗骨髓腔2 次，直至骨髓腔變白。將沖洗后的液體取出并放入一個(gè)6 cm 的培養(yǎng)皿中。將培養(yǎng)皿放置在無(wú)菌恒溫培養(yǎng)箱（溫度為37.5℃，內(nèi)含濃度為5% 的二氧化碳）中進(jìn)行培養(yǎng)。20 ～24 h 后第一次換液，之后每隔48 h 換液一次。在細(xì)胞增殖至占整個(gè)培養(yǎng)皿底90% 以上后對(duì)其進(jìn)行細(xì)胞傳代，重復(fù)以上步驟得到p3 代MSC，用于后續(xù)試驗(yàn)。

1.3.3 將細(xì)粒棘球絳蟲(chóng)原頭節(jié)與MSC 體外共培養(yǎng)的方法 取2 份等量的細(xì)粒棘球絳蟲(chóng)原頭節(jié)，將其分別作為A 組與B 組。將A 組細(xì)粒棘球絳蟲(chóng)原頭節(jié)與培養(yǎng)好的p3 代MSC 放入6 cm的培養(yǎng)皿中進(jìn)行共培養(yǎng)，對(duì)B 組細(xì)粒棘球絳蟲(chóng)原頭節(jié)進(jìn)行單獨(dú)普通培養(yǎng)。以培養(yǎng)當(dāng)天、培養(yǎng)的第2 天、第4 天、第6天、第8 天和第10 天作為觀察時(shí)間節(jié)點(diǎn)，取兩組細(xì)粒棘球絳蟲(chóng)原頭節(jié)中等量的細(xì)粒棘球絳蟲(chóng)原頭節(jié)（約100 個(gè)），對(duì)其進(jìn)行伊- 紅染色，然后在光學(xué)倒置顯微鏡下觀察其活性及存活情況。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

用SPSS 20.0 軟件處理本研究中的數(shù)據(jù)，計(jì)數(shù)資料用%表示，用χ2檢驗(yàn)，計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，用t檢驗(yàn)，多組之間比較采用單因素方差分析（ANOVA），P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 MSC 的培養(yǎng)、細(xì)粒棘球絳蟲(chóng)原頭節(jié)的提取及二者的共培養(yǎng)

原代的MSC 從小鼠骨髓中提取出后，24 h 內(nèi)換液去除其中的部分雜質(zhì)，干細(xì)胞的增殖能力強(qiáng)，約48 h 可將6 cm的培養(yǎng)皿基本鋪滿(mǎn)。將MSC 傳代至第p3 代MSC，可祛除培養(yǎng)皿內(nèi)的雜質(zhì)，獲得更純凈的MSC。在顯微鏡下進(jìn)行觀察可見(jiàn)，MSC 呈梭型或紡錘型、成簇樣排列（詳見(jiàn)圖A）。細(xì)粒棘球絳蟲(chóng)原頭節(jié)在靜止時(shí)呈圓形或類(lèi)圓形，在活動(dòng)時(shí)呈長(zhǎng)條狀（詳見(jiàn)圖B），在顯微鏡下能觀察到蟲(chóng)體的蠕動(dòng)。用伊- 紅染料對(duì)新提取的細(xì)粒棘球絳蟲(chóng)原頭節(jié)進(jìn)行浸潤(rùn)后，其拒染率約為99%，表示蟲(chóng)體的活性良好。將細(xì)粒棘球絳蟲(chóng)原頭節(jié)放入MSC 培養(yǎng)基中進(jìn)行共培養(yǎng)的情況詳見(jiàn)圖C。

2.2 培養(yǎng)期間兩組細(xì)粒棘球絳蟲(chóng)原頭節(jié)抗染的情況及光鏡下的形態(tài)

在培養(yǎng)期間，采用伊- 紅染色法在倒置顯微鏡下抽樣觀察兩組細(xì)粒棘球絳蟲(chóng)原頭節(jié)的活性，結(jié)果顯示，活性較好的細(xì)粒棘球絳蟲(chóng)原頭節(jié)呈拒染狀態(tài)（如圖D 中綠色箭頭所指的頭節(jié)），活性差或活性較差的細(xì)粒棘球絳蟲(chóng)原頭節(jié)可發(fā)生頭部深染或全身深染（如圖中藍(lán)色箭頭所指的頭節(jié)）。在染色的情況下，活性較好的細(xì)粒棘球絳蟲(chóng)原頭節(jié)可依舊保持其頭節(jié)原有的形態(tài)（呈圓形或類(lèi)圓形），活性差或活性較差的細(xì)粒棘球絳蟲(chóng)原頭節(jié)呈口器逐漸外翻的狀態(tài)，蟲(chóng)體膨大，其末端胚泡膨大或脫落（詳見(jiàn)圖D）。

2.3 培養(yǎng)期間兩組細(xì)粒棘球絳蟲(chóng)原頭節(jié)的存活率

在培養(yǎng)期間，采用伊- 紅染色法在倒置顯微鏡下抽樣觀察兩組細(xì)粒棘球絳蟲(chóng)原頭節(jié)的存活情況，結(jié)果顯示，B組細(xì)粒棘球絳蟲(chóng)原頭節(jié)隨著時(shí)間的推移其存活率逐漸下降。在培養(yǎng)的第8 天和第10 天，B 組細(xì)粒棘球絳蟲(chóng)原頭節(jié)的存活率均低于A 組細(xì)粒棘球絳蟲(chóng)原頭節(jié)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。詳見(jiàn)表1。

表1 培養(yǎng)期間兩組細(xì)粒棘球絳蟲(chóng)原頭節(jié)的存活率[n（%）]

3 討論

CE 是一種人畜共患病。細(xì)粒棘球絳蟲(chóng)主要寄生于人類(lèi)及牲畜等中間宿主的肝、肺、腦等器官中，可發(fā)育成包囊，對(duì)人畜的臟器功能損傷嚴(yán)重。農(nóng)牧民在感染細(xì)粒棘球絳蟲(chóng)后的半年內(nèi)蟲(chóng)包囊的直徑可達(dá)到0.5 ～1.0 cm，而其常因各種原因而不能及時(shí)就診，導(dǎo)致其體內(nèi)的蟲(chóng)包囊每年以1 ～5 cm（直徑）的速度增長(zhǎng)，最大直徑可達(dá)數(shù)十厘米。有報(bào)道稱(chēng)，細(xì)粒棘球絳蟲(chóng)外增性的生長(zhǎng)方式及致病機(jī)理與其纖維外包膜的存在密切相關(guān)[9]。細(xì)粒棘球絳蟲(chóng)纖維包膜的形成機(jī)制與成纖維細(xì)胞的鈣化機(jī)理密切相關(guān)。有報(bào)道稱(chēng)，成纖維細(xì)胞可像成骨細(xì)胞一樣產(chǎn)生基質(zhì)小泡并引起小泡內(nèi)鈣鹽沉積，這一機(jī)制可能在細(xì)粒棘球絳蟲(chóng)周?chē)w維囊壁鈣化的形成中起到重要作用[10]。對(duì)CE 患者進(jìn)行手術(shù)治療成功與否取決于其體內(nèi)細(xì)粒棘球絳蟲(chóng)包囊的完整性及術(shù)中是否出現(xiàn)囊液外溢的情況。細(xì)粒棘球絳蟲(chóng)包囊的外囊壁完整可為手術(shù)切除的范圍提供依據(jù)，且有助于降低患者術(shù)后并發(fā)癥的發(fā)生率[11]。

MSC 具有多種分化潛能，能分泌多種細(xì)胞因子，具有調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖、營(yíng)養(yǎng)、凋亡、支持、存活、遷移、歸巢、分化和表型等多種細(xì)胞反應(yīng)的作用[12-13]。在CE 發(fā)展的過(guò)程中，MSC 由于歸巢作用會(huì)在患者體內(nèi)肝臟的受損處與細(xì)粒棘球絳蟲(chóng)或其頭節(jié)產(chǎn)生相互作用，進(jìn)而可對(duì)此病的發(fā)展起到促進(jìn)作用。CE 在人體內(nèi)致病的過(guò)程中，MSC 與細(xì)粒棘球絳蟲(chóng)頭節(jié)及細(xì)胞均有密切接觸，且二者可相互影響，互相反饋與調(diào)節(jié)。本研究的結(jié)果顯示，在培養(yǎng)期間，B 組細(xì)粒棘球絳蟲(chóng)原頭節(jié)隨著時(shí)間的推移其存活率逐漸下降。在培養(yǎng)的第8 天和第10 天，B 組細(xì)粒棘球絳蟲(chóng)原頭節(jié)的存活率均低于A 組細(xì)粒棘球絳蟲(chóng)原頭節(jié)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。究其原因可能是，將MSC 與細(xì)粒棘球絳蟲(chóng)原頭節(jié)共培養(yǎng)后二者會(huì)產(chǎn)生相互刺激，促進(jìn)活性因子的分泌，對(duì)細(xì)粒棘球絳蟲(chóng)原頭節(jié)的活性產(chǎn)生影響，但其具體影響機(jī)制仍有待進(jìn)一步研究明確。

綜上所述，將MSC 與細(xì)粒棘球絳蟲(chóng)原頭節(jié)共培養(yǎng)，對(duì)細(xì)粒棘球絳蟲(chóng)原頭節(jié)的活性具有促進(jìn)作用。本研究可能為CE 的治療提供一種新的思路。