趙階峰，夏海洋，郁曉峰，張示杰，彭心宇，楊宏強(qiáng)

不同培養(yǎng)基及不同溫度對(duì)體外培養(yǎng)泡球蚴原頭節(jié)的影響

趙階峰，夏海洋，郁曉峰，張示杰，彭心宇，楊宏強(qiáng)

目的 觀察不同溫度下不同培養(yǎng)基對(duì)體外培養(yǎng)泡球蚴原頭節(jié)的影響，探討泡球蚴原頭節(jié)體外培養(yǎng)合適條件。方法 按照培養(yǎng)基的不同，隨機(jī)分為3組：Ⅰ組為含10%胎牛血清的RPMI-1640(4 ℃、25 ℃、37 ℃)；Ⅱ組為含10%胎牛血清的D-MEM(4 ℃、25 ℃、37 ℃)；Ⅲ組為含10%胎牛血清的M199(4 ℃、25 ℃、37 ℃)。觀察各組泡球蚴原頭節(jié)存活、生長情況，并記錄原頭節(jié)存活率及最長生存時(shí)間。結(jié)果 RPMI-1640培養(yǎng)基、D-MEM培養(yǎng)基與M199培養(yǎng)基中泡球蚴原頭節(jié)的存活率有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)，RPMI-1640培養(yǎng)基與D-MEM培養(yǎng)基中泡球蚴原頭節(jié)的存活率無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)；4 ℃、25 ℃與37 ℃泡球蚴原頭節(jié)的存活率無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)，但RPMI-1640培養(yǎng)基在4 ℃及37 ℃，D-MEM 培養(yǎng)基在25 ℃泡球蚴原頭節(jié)存活率較高；各組在第3 d和第9 d泡球蚴原頭節(jié)存活率有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。4 ℃各組原頭節(jié)存活時(shí)間明顯高于25 ℃組和37 ℃組。結(jié)論 不同溫度及不同培養(yǎng)基對(duì)體外培養(yǎng)泡球蚴原頭節(jié)的存活的影響不同，RPMI-1640在4 ℃下培養(yǎng)，D-MEM在25 ℃培養(yǎng)，原頭節(jié)成活率較高，存活時(shí)間較長，M199培養(yǎng)基不適合泡球蚴原頭節(jié)的體外培養(yǎng)。

泡狀棘球蚴；原頭節(jié)；溫度；體外培養(yǎng)

泡狀棘球蚴病是由泡狀棘球蚴寄生在人體引起的致死性寄生蟲病。該病酷似惡性腫瘤，可以隨淋巴或血液等轉(zhuǎn)移，引起肺、腦等臟器繼發(fā)性感染[1-2]，因此有惡性包蟲病(malignant echinococcosis)或“蟲癌”之稱，確診后10年內(nèi)的病死率高達(dá)94%[3]。國內(nèi)外為了能夠在實(shí)驗(yàn)室研究泡球蚴感染宿主的致病機(jī)理，尋找預(yù)防和治療泡球蚴病的有效方法，通過大量的嘗試相繼建立了泡球蚴的繼發(fā)感染動(dòng)物模型[4-5]和泡球蚴體外培養(yǎng)模型[6]。體外培養(yǎng)模型與動(dòng)物模型相比具有生長周期短，便于控制條件等優(yōu)點(diǎn)，更重要的是體外培養(yǎng)對(duì)泡球蚴的生長發(fā)育等研究可以不受宿主的影響。

泡球蚴的體外培養(yǎng)與培養(yǎng)基及培養(yǎng)溫度等有緊密的聯(lián)系，目前國內(nèi)外對(duì)泡球蚴原頭節(jié)的體外培養(yǎng)多在37 ℃下進(jìn)行，國外有學(xué)者[7]研究了細(xì)粒棘球蚴原頭節(jié)在不同溫度下不同培養(yǎng)液中的生存時(shí)間，而對(duì)于不同溫度下不同培養(yǎng)基對(duì)泡球蚴原頭節(jié)影響的實(shí)驗(yàn)卻未見報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)通過觀察不同溫度及不同培養(yǎng)基對(duì)泡球蚴原頭節(jié)存活率及存活時(shí)間的影響，初步探索了泡球蚴原頭節(jié)體外培養(yǎng)較合適的培養(yǎng)基及培養(yǎng)溫度。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及儀器 腹腔感染泡球蚴的灰倉鼠(購自新疆自治區(qū)疾病控制中心)，顯微鏡/采圖系統(tǒng)(OLYMPUS公司)，二氧化碳培養(yǎng)箱(NUAIRE公司)。

1.1.2 主要試劑 胎牛血清(HCLONE公司)，RPMI-1640、DMEM、M199培養(yǎng)基(GIBCO公司)，青霉素、鏈霉素(南京生興生物技術(shù)有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 收集泡球蚴原頭節(jié) 對(duì)感染泡球蚴的灰倉鼠施行安樂死，鼠體用碘伏及75%酒精進(jìn)行表面消毒，無菌條件下從腹腔中取出泡球蚴組織并對(duì)其修剪，將宿主組織剝離干凈后，PBS緩沖液(0.01 mmol/L，pH7.4)反復(fù)沖洗至液體澄清，用0.5 mm篩網(wǎng)研磨過篩泡球蚴囊泡組織及囊液，用含雙抗的PBS液沖洗3遍后自然沉淀，收集泡球蚴原頭節(jié)。將泡球蚴懸液定量稀釋后，取10 μL均勻的混懸液伊紅染色，觀察活力并計(jì)數(shù)。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)分組 收集原頭節(jié)，根據(jù)培養(yǎng)基不同隨機(jī)分為3組，每組在3種不同溫度條件下培養(yǎng)：RPMI-1640組(4 ℃、25℃、37 ℃)，D-MEM組(4 ℃、25 ℃、37 ℃)，M199組(4 ℃、25 ℃、37 ℃)。每個(gè)培養(yǎng)瓶中平均培養(yǎng)5 000枚泡球蚴原頭節(jié)。

1.2.3 泡球蚴原頭節(jié)存活率的估算 每組等量取1滴原頭節(jié)培養(yǎng)液，用0.1%伊紅染色，在帶有顯微測微尺的倒置顯微鏡下觀察。判斷標(biāo)準(zhǔn)：死亡原頭節(jié)紅染著色，伴有結(jié)構(gòu)破壞且無活動(dòng)性；活頭節(jié)不著色且有活動(dòng)性。計(jì)數(shù)每100個(gè)原頭節(jié)中著色數(shù)目，以不著色者占觀察原頭節(jié)的比例為其存活率，共計(jì)數(shù)300個(gè)計(jì)算平均存活率；觀察并記錄各組泡球蚴原頭節(jié)存活天數(shù)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 泡球蚴原頭節(jié)的存活率采用多因素方差分析法，在組內(nèi)和組間進(jìn)行兩兩比較；按α=0.05為水準(zhǔn)，以P<0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，采用SPSS17.0軟件分析處理。

2 結(jié) 果

2.1 各組泡球蚴原頭節(jié)的存活率 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析表明，RPMI-1640培養(yǎng)基組、D-MEM培養(yǎng)基組與M199培養(yǎng)基組泡球蚴原頭節(jié)的存活率有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)，RPMI-1640培養(yǎng)基組與D-MEM培養(yǎng)基組泡球蚴原頭節(jié)的存活率無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)；4 ℃、25 ℃與37 ℃各組泡球蚴原頭節(jié)的存活率無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)，但RPMI-1640培養(yǎng)基組在4 ℃及37 ℃，D-MEM 培養(yǎng)基組在25 ℃泡球蚴原頭節(jié)存活率較高；各組在第3 d和第9 d泡球蚴原頭節(jié)存活率有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)(表1)。

表1 泡球蚴原頭節(jié)的存活率

2.2 泡球蚴原頭節(jié)的平均存活天數(shù) 3種培養(yǎng)基不同溫度條件下，泡球蚴原頭節(jié)的最長平均存活天數(shù)是：31 d(RPMI-1640，4 ℃)，36 d(D-MEM，25 ℃)，23 d(M199，4 ℃)。3組比較，M199最不適合泡球蚴原頭節(jié)的培養(yǎng)，根據(jù)培養(yǎng)溫度不同，可以選擇D-MEM或者RPMI-1640培養(yǎng)基體外培養(yǎng)泡球蚴原頭節(jié)(圖1)。

圖1 平均存活天數(shù)與培養(yǎng)基及溫度的關(guān)系

3 討 論

泡球蚴的體外培養(yǎng)是在體外模擬泡球蚴宿主體內(nèi)生長環(huán)境，從而使泡球蚴在離開宿主的狀態(tài)下完成生活史的部分或全部生長發(fā)育階段，目前是評(píng)估抗泡球蚴藥物療效[8-9],分析和研究泡球蚴及其原頭節(jié)的特異成分以及生長發(fā)育過程等的最佳途徑。保持泡球蚴原頭節(jié)較高的存活率以及最長存活時(shí)間是建立其有效體外培養(yǎng)的基礎(chǔ)，其中培養(yǎng)基及培養(yǎng)溫度是兩個(gè)最主要因素，而現(xiàn)有的文獻(xiàn)中未見不同培養(yǎng)基及不同溫度對(duì)泡球蚴原頭節(jié)的生存情況的研究。

本實(shí)驗(yàn)采用RPMI-1640、D-MEM和M199共3種培養(yǎng)基分別在4 ℃、25 ℃和37 ℃ 3個(gè)溫度條件下培養(yǎng)泡球蚴原頭節(jié)，觀察泡球蚴原頭節(jié)存活率以及存活時(shí)間，發(fā)現(xiàn)4 ℃及37 ℃下 RPMI-1640培養(yǎng)基中泡球蚴原頭節(jié)的存活率及其存活時(shí)間高于D-MEM培養(yǎng)基和M199培養(yǎng)基；25 ℃下D-MEM培養(yǎng)基中泡球蚴原頭節(jié)的存活率及其存活時(shí)間高于同溫度下RPMI-1640培養(yǎng)基和M199培養(yǎng)基，這說明在相同溫度下采用不同的培養(yǎng)基對(duì)體外培養(yǎng)泡球蚴原頭節(jié)生存狀況的影響是不同的，體外培養(yǎng)泡球蚴選用的培養(yǎng)基與培養(yǎng)溫度存在相關(guān)性。

Ali Ihsan Diker等[10]研究發(fā)現(xiàn)，體外培養(yǎng)細(xì)粒棘球蚴原頭節(jié)最長生存時(shí)間分別為：-10 ℃ 3 d，0 ℃ 36 d，10 ℃ 28 d，20 ℃ 12 d，30 ℃ 4 d，40 ℃ 3 d。Ahmed A. M. Al-Azzauy[7]對(duì)RPMI-1640、林格氏液及生理鹽水3種培養(yǎng)液分別在4 ℃、25 ℃和37 ℃下細(xì)粒棘球蚴原頭節(jié)的最長存活時(shí)間進(jìn)行的研究發(fā)現(xiàn)，25 ℃下生理鹽水中細(xì)粒棘球蚴原頭節(jié)的存活時(shí)間最長。我們通過對(duì)比相同培養(yǎng)基在不同溫度下泡球蚴原頭節(jié)存活率及存活時(shí)間發(fā)現(xiàn)，RPMI-1640培養(yǎng)基在4 ℃下泡球蚴原頭節(jié)的存活率及存活時(shí)間高于25 ℃與37 ℃，而D-MEM培養(yǎng)基在25 ℃下原頭節(jié)存活率及存活時(shí)間高于4 ℃與37 ℃，這說明不同的溫度對(duì)體外培養(yǎng)泡球蚴原頭節(jié)存活情況影響不同。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)通過在不同溫度下不同培養(yǎng)基中培養(yǎng)泡球蚴原頭節(jié)，發(fā)現(xiàn)與37 ℃的體外培養(yǎng)溫度比較，4 ℃下的RPMI-1640培養(yǎng)基和25 ℃下的D-MEM培養(yǎng)基更能夠提高泡球蚴原頭節(jié)的存活時(shí)間，保證其較高的存活率，從而進(jìn)一步拓寬泡球蚴體外培養(yǎng)的條件，對(duì)特異性表達(dá)的基因進(jìn)行篩選和分離，確定該病有效治療藥物、疫苗候選基因以及進(jìn)行基因靶向治療奠定基礎(chǔ)。

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Effects of different culture media onEchinococcusmultilocularisprotoscoleces at different temperaturesinvitro

ZHAO Jie-feng,XIA Hai-yang,YU Xiao-feng,ZHANG Shi-jie,PENG Xin-yu,YANG Hong-qiang

(HepatobiliarySurgery,theFirstAffiliatedHospital,MedicalCollege,ShiheziUniversity,Shihezi832008,China)

In order to observe the effects of different culture media and temperature on protoscoleces ofEchinococcusmultilocularis, they were randomly divided into RPMI-1640 group, D-MEM group and M199 group, and cultured in three degrees of temperature (4, 25 and 37 ℃) with 10% fetal calf serum (FCS). Protoscoleces were counted by light microscope with 0.1% eosin staining, and calculated survival rate (per 100 protoscoleces) everyday until all the parasites died. At the same time, the average number of the preservation days was observed. The experiment results showed that the survival rate of protoscoleces in RPMI-1640 and D-MEM groups were higher than that in M199 group (P<0.05) and there’s no significant difference between RPMI-1640 group and D-MEM group (P>0.05). The survival rate of protoscoleces in RPMI-1640 group at 4 ℃ and 37 ℃ and D-MEM group at 25 ℃ were higher, but there was no significant effect of 4, 25 and 37 ℃ on the survival rate of protoscoleces (P>0.05). Significant difference were found in the survival rate of protoscoleces on the 3rdday and the 9thday in these three groups (P<0.05). The average number of the preservation days were 34 days in RPMI-1640 group at 4 ℃, 36 days in D-MEM group at 25 ℃ and 23 days in M199 group at 4 ℃. It was concluded that the effects of different culture media and temperature on protoscoleces are different, and the RPMI-1640 at 4 ℃ and D-MEM at 25 ℃ are more suitable for culturing protoscolecesinvitro.

Echinococcusmultilocularis; protoscolece; temperature; culture media

Yang Hong-qiang, Email: hongq01@sina.com

10.3969/cjz.j.issn.1002-2694.2015.03.012

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(No.81160199)和兵團(tuán)科技計(jì)劃攻關(guān)項(xiàng)目(No.2014BA028)

楊宏強(qiáng)，Email:hongq01@sina.com

石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院肝膽外科，石河子 832008

R383.3

A

1002-2694(2015)03-0244-03

Supported by the National Natural Science Foundation of China (No. 81160199) and the Key Scientific and Technological Project of Construction Corps (No. 2014BA028)

2014-03-28；

2014-12-23